عملية صب المستندة إلى الغزل الرطب من الجيلاتين لتجديد الأنسجة

Summary

البلدان المتقدمة النمو، ووصف بروتوكول يستند إلى مفهوم الغزل الرطب، لبناء أساس الجيلاتين الحيوية المستخدمة لتطبيق هندسة الأنسجة.

Abstract

تقدم هذه المقالة طريقة غير مكلفة لاختلاق الجيلاتين، بوليمر طبيعي، إلى شعيرات الألياف أو غيرها من الأشكال المناسبة. من خلال أسلوب الغزل الرطب، ألياف الجيلاتين تنتجها البثق السلس في متوسط تخثر مناسب. لزيادة سطح الوظيفية لهذه الألياف الجيلاتين وقدرتها على تقليد سمات الأنسجة، يمكن مصبوب الجيلاتين إلى شكل أنبوب بالإشارة إلى هذا المفهوم. درست بالاختبارات في المختبر والمجراه في، تثبت الأنابيب الجيلاتين بإمكانات كبيرة للتطبيق في هندسة الأنسجة. بوصفها مادة فجوة شغل مناسب، الجيلاتين أنابيب يمكن استخدامها لتحل محل الأنسجة في المنطقة المتضررة (على سبيل المثال، في نظام الجهاز العصبي أو القلب والأوعية الدموية)، فضلا عن تعزيز التجدد بتوفير بديل مباشر للخلايا الجذعية والدوائر العصبية. يوفر هذا البروتوكول إجراء مفصل لإنشاء مادة بيولوجية استناداً إلى بوليمر طبيعي، وتنفيذه ومن المتوقع أن تستفيد إلى حد كبير تطوير البوليمرات الطبيعية المترابطة، التي تساعد على تحقيق استراتيجيات تجديد الأنسجة.

Introduction

أحدث تطور في تجديد الأنسجة تنطوي على تطبيق هندسة الأنسجة، مما يمثل تحديا لتحسين استراتيجيات علاجية جديدة في العلاج الطبي. على سبيل المثال، إمكانات محدودة للتجدد العصبي أو التالي الإصابة أو المرض، يشكل مشكلة صحية كبيرة في جميع أنحاء العالم. نظراً لتعقد العمليات الفيزيولوجية المرضية المرتبطة بالجهاز العصبي، استخدام أوتوجرافت التقليدية أو تنفيذ عملية جراحية الاستقرار قد ثبت أن تقدم فوائد في النتائج الفنية، ولكن لا دليل قوي على آثار تثبيت العمود الفقري جراحة^1،2. فقدان الأنسجة في المنطقة المتضررة واستبداله ب astrocytes المستحث هايبرتروفيكالي³، في نهاية المطاف تشكيل ندبة الدبقية كثيفة^4،5. هذه المصفوفة يعمل كحاجز أن كتل انتعاش العصب تعمل^6،7 وهو، يعوق وبالتالي، إلى حد كبير التجدد. ولذلك، من المتوقع مادة مناسبة ملء فجوة الحيلولة دون فقدان الأنسجة وتقليل تشكيل النسيج الضام ندبة المرتبطة بالحفاظ على سلامة المنطقة المتضررة، فضلا عن توفير بديل مباشر للخلايا العصبية و دارات كهربائية لتعزيز التجديد إكسون.

وكانت المواد البوليمرية الحيوية المفضل السقالات لتجديد الأنسجة والعلاج، استناداً إلى اللائحة من الخلية أو إكسون السلوك والأنسجة التقدم من خلال الدعم المصفوفة خارج الخلية الطبيعية (ECM). ويعتبر شكل الألياف عادة كلبنة لمختلف المواد، نظراً لهيكل أحادي الأبعاد⁸. يمكن عموما الحصول على الألياف التي تذوب النتوء أو الرطب الغزل الأسلوب؛ ومع ذلك، بحجم كبير وتكلفة المعدات وصعوبة القيام بهذه الأساليب تشكل تحديا. وباﻹضافة إلى ذلك، ركزت غالبية الأعمال المتصلة بالألياف البوليمرية على المواد الاصطناعية أو مركب. البوليميرات الطبيعية كمصدر لمادة بيولوجية توفر أفضل خصائص توافق مع الحياة لجسم الإنسان. ومع ذلك، للحصول على محاذاة ألياف البوليمر الطبيعي نسبيا أكثر صعوبة من المصادر الاصطناعية البوليمر⁹. ومن ثم تحويل البوليمر الطبيعي كمصدر غنى للبروتين إلى ألياف مادة بيولوجية استراتيجية هامة – ليس فقط ألياف مادة بيولوجية يمكن مباشرة المعزولة من المواد الخام، وبالتالي تجنب تحول غير ضرورية إلى مونومرات، ولكن كما تحتوي ألياف البروتين على مظهر جيد وخصائص مواتية¹⁰.

وفي هذا الصدد، نحن تصف أسلوب معالجة غير مكلفة لتصنيع ألياف البوليمرات الطبيعية من خلال المفهوم الأساسي للغزل الرطب، التي يمكن أن تنفذ على نطاق المختبر لهندسة الأنسجة. الغزل الرطب يؤديها البثق والتخثر حل البوليمر في نونسولفينت بوليمر مناسبة. حلاً مناسباً، لزج يخدر في المتوسط تخثر الدم يسبب جزيئات البوليمر حل. من خلال مرحلة الانتقال، خيوط ثم تفقد تلك القابلية للذوبان والتي عجلت في شكل البوليمر الصلب المرحلة¹¹. الإشارة إلى هذا المفهوم، نحن ثم توسيع تطوير الجيلاتين في شكل أنبوب بعملية صب، التي تعتبر مناسبة لطلب تجديد الأنسجة. وباﻹضافة إلى ذلك، جوهريا، يمكننا أيضا وضع أي شكل من المواد من ألياف الجيلاتين (مثل قناة الجيلاتين طوى من عدة ألياف الجيلاتين)، المطلوب لأخرى تطبيقات.

الجيلاتين، بوليمر طبيعية القابلة للتحلل، يتكون من الكولاجين التشويه والتحريف وتحلل، بما في ذلك أي دولة سيميكريستاليني أو غير متبلور أو ثلاثية حلزونية من الكولاجين¹². ومن المعروف جيدا أن الكولاجين هو البروتين الهيكلية الأساسية في جميع الأنسجة الضامة من الفقاريات واللافقاريات^13،14، ومماثل لهيكل بروتين ECM الرئيسي الذي يدفع نمو الأعصاب، في نفس الوقت، يستبدل كمية كبيرة من جليكوسامينوجليكان ويفرز خلال إصابات النخاع الشوكي. ولذلك، سيكون استخدام الجيلاتين كمصدر خيار كبير لأي من المركبات الطبية. إضافة إلى كونه مصدرا غير مكلفة، الجيلاتين أيضا قابلة للتحلل وسيتوكومباتيبلي وثبت سريرياً لتكون مؤقتة عيب حشو¹⁵. وضعت في شكل أنبوب، تبين الاختبارات في المختبر والمجراه في وصف هنا أن الجيلاتين يحتوي على توافق مع الحياة ممتازة وملاءمة للمستقبل الأنسجة التطبيقات الهندسية. مثقف مع الخلايا الجذعية البشرية الدهنية، أنابيب الجيلاتين تحسين تمايز الخلية إلى الخلايا العصبية السلف باستخدام التلوين نيستين إيجابية كعلامة خلية العصبية. وعلاوة على ذلك، الجيلاتين كملء الفجوة المادية، كما أنتجت وبالطريقة المحددة في هذه الدراسة، من المتوقع أن تكون معقولة وآمنة، وتستفيد إلى حد كبير مهندسي الأنسجة الذي تعمل حاليا على وضع الارتباطية البوليميرات الطبيعية لتعزيز النسيج استراتيجيات التجديد.

Protocol

وتم الحصول على الأنسجة الدهنية من جراحات العظام كما معتمدة من قبل المؤسسات استعراض المجلس لثلاثي-خدمة "المستشفى العام"، تايبيه، تايوان، R.O.C. الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان أقرتها "اللجنة رعاية الحيوان" على الصعيد الوطني المركز الطبي للدفاع، تايوان (R.O.C).

1-الرطب الغزل عملية

1. إعداد الحل
   1. حل 5 غ مسحوق الجيلاتين في 100 مل الماء المقطر مزدوجة للحصول على تركيز الحل 5% (w/v).
   2. يحرك الخليط ببطء في 60-70 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتحقيق تشتت متجانسة تماما دون أي فقاعات.
2. الغزل الرطب
   1. تشكيل الألياف
      ملاحظة: ويبين الشكل 1ألفتخطيطي للأسلوب. الإعداد الغزل مجهز بجهاز مضخة تمعجية (انظر الجدول للمواد) التي توفر سرعة عالية الدقة وضوابط التسليم السلس للتدفق.
      1. قم بتوصيل حقنه 26 x 1/2 بوصة (0.45 ملم × 12 ملم) كحل محقن أنابيب الفينيل واضحة.
      2. تحضير 100 مل حل الأسيتون 99.5% في زجاج الكأس لاستخدامه كحمام تخثر الدم.
      3. تشغيل الجهاز مضخة تمعجية 21 لفة في الدقيقة (3.25 مل/دقيقة) وترك حل الجيلاتين الوقوف لعدة ثوان في حل الأسيتون قبل المتداول عنه.
      4. إخراج الألياف الجيلاتين من الحل الأسيتون وتزج بها في 2.5% (w/v) polycaprolactone/الميثان (PCL/DCM) الحل مع 01:20 (w/w).
      5. واسمحوا الجيلاتين الألياف في الحل PCL/DCM الجافة بين عشية وضحاها، تحت غطاء محرك السيارة في درجة حرارة الغرفة.
   2. تشكيل أنبوب
      ملاحظة: ويبين الشكل 1بتخطيطي للأسلوب.
      1. استخدام قسطرة وريدية طرفية 24 x 3/4 بوصة (0.7 مم × 19 مم) كأنبوب العفن.
      2. تحميل القسطرة إلى الحل الجيلاتين والاحتفاظ بها هناك 3 s.
      3. تحميل القسطرة إلى الحل الأسيتون وعقد لمدة 1 دقيقة.
      4. تحميل القسطرة مرة أخرى في الحل الجيلاتين والاحتفاظ بها هناك 3 s.
      5. كرر هذا الإجراء البديل x 20.
      6. إخراج القسطرة من الحل الأسيتون واسمحوا مصبوب أنبوب جاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      7. تأخذ بلطف بها الأنبوب الجيلاتين من القسطرة باستخدام هيموستات ونقل الأنبوب الجيلاتين بعناية في زجاج ماصة باستور مع غمر 2.5% (w/v) PCL/DCM الحل.
      8. واسمحوا ماصة باستور تحتوي على أنبوب الجيلاتين والحل PCL/DCM الجافة بين عشية وضحاها، تحت غطاء محرك السيارة في درجة حرارة الغرفة.

2-مورفولوجيا الأنبوب الجيلاتين

1. جبل قطعة أنبوب الجيلاتين المجففة على كعب روتين الكربون.
2. وضع العينة في آلة المغطى الرش أيون (انظر الجدول للمواد) ومعطف العينة مع الذهب 60 ثانية؛ ثم، نلاحظ في المورفولوجيا عن طريق فحص المجهر الإلكتروني (انظر الجدول للمواد).

3-الثقافة البشرية الخلايا الجذعية الدهنية

1. ضع الأنسجة الدهنية (التي تم الحصول عليها من الأنسجة الدهنية الفموية عن طريق الجراحة السريرية) في طبق بتري يحتوي على 10 مل من محلول نقل تتألف من 0.1 م مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، 1% البنسلين/ستربتوميسين، والسكر 0.1%.
2. قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة (أقل من 1 مم²) مع شفرة المبضع.
3. نقل الأنسجة إلى أنبوب بلاستيكي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق.
4. إزالة المادة طافية واحتضان الرواسب في أنبوب بلاستيك التي تحتوي على 10 مل من المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم، تتألف من 4 مم L-الجلوتامين، بيروفات صوديوم 1 مم، وأحمر الفينول 15 مغ/لتر) مع كولاجيناز 0.1% في 37 درجة مئوية، في جو هوميديفيد التي تحتوي على 95% الهواء و 5% CO₂، لمدة يوم واحد.
5. الطرد المركزي في الأنبوب من البلاستيك في 500 x ز لمدة 5 دقائق، وتجاهل المادة طافية بعناية (لا تلمس الرواسب)، وثم تعليق الرواسب بلطف بإضافة 10 مل دميم التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والسماح لها الوقوف لمدة يوم واحد في 37 درجة مئوية ، في جو هوميديفيد التي تحتوي على 95% الهواء و 5% CO₂.
6. الطرد المركزي في الأنبوب من البلاستيك في 500 x ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية بعناية؛ ثم أضف 1 مل من الخلايا الجذعية المتوسطة (تتألف من keratinocyte خالية من المصل المتوسطة (كاﻹدارة المستدامة للغابات)، 5% FBS، ستربتوميسين ن-أسيتيل-L-سيستين، حمض الأسكوربيك-2-الفوسفات، والامفوتريسين) إلى تعليق الرواسب، وأنه نقل إلى قارورة ثقافة T25 التي تحتوي على 4 مل من المتوسطة الخلية الجذعية، والسماح لها الوقوف لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية، في جو هوميديفيد التي تحتوي على 95% الهواء و 5% CO₂.
7. تجاهل المادة طافية وإضافة 1 مل حمض التربسين-الإيثيلين 0.25% (يدتا)، واحتضان أنه عند 37 درجة مئوية، في جو هوميديفيد التي تحتوي على الهواء 95% و 5% CO₂ ل 3.5 دقيقة، لفصل الخلايا من الجزء السفلي لقارورة الثقافة.
8. إضافة 1 مل FBS وتعليق المخلوط، وأنه نقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي.
9. الطرد المركزي من التعليق في 500 x g 3.5 دقيقة وتعليق الرواسب مع 1 مل من الخلايا الجذعية المتوسطة، ونقله إلى قارورة الثقافة التي تحتوي على 5 مل من الخلايا الجذعية المتوسطة؛ ثم يبقيه في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 95% الهواء و 5% CO₂.
10. الحفاظ على ثقافة فرعية بتغيير الخلايا الجذعية المتوسطة كل 3 أيام.

4-زراعة الخلايا في الأنبوب الجيلاتين

1. تعقيم أنبوب الجيلاتين مع الأشعة فوق البنفسجية ح 2؛ ثم تزج أنه في 75% (v/v) الإيثانول وغسله x 2 مع الخلايا الجذعية المتوسطة لإزالة الإيثانول المتبقية.
2. جمع الخلايا الجذعية الدهنية البشرية (هاسكس) من قارورة الثقافة.
   1. إزالة المتوسطة من قارورة الثقافة.
   2. أضف 1 مل من 0.25% التربسين-يدتا واحتضان في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 95% الهواء و 5% CO₂ ل 3.5 دقيقة، لفصل هاسكس من الجزء السفلي لقارورة الثقافة.
   3. إضافة 1 مل FBS وتعليق المخلوط، وأنه نقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي.
   4. الطرد المركزي أنبوب ميكروسينتريفوجي في 500 x ز ل 3.5 دقيقة؛ ثم تجاهل المادة طافية بعناية، وتعليق الرواسب مع 1 مل من الخلايا الجذعية المتوسطة.
3. ضع الأنبوب الجيلاتين في صفيحة 6-كذلك يتضمن 3 مل من الخلايا الجذعية المتوسطة والبذور 4 × 10⁴ من هاسكس إلى الأنبوب؛ احتضان لهم لمدة أسبوعين في 37 درجة مئوية، في جو هوميديفيد التي تحتوي على 95% الهواء و 5% CO₂.
4. قم بتغيير كل 3 أيام المتوسطة الخلايا الجذعية لتوفير تغذية كافية لنمو الخلايا.

5-إيمونوسيتوتشيميستري

1. إزالة الخلايا الجذعية المتوسطة ويغسل جيدا مع برنامج تلفزيوني.
2. إصلاح الأنبوب مع الخلايا مع 0.1% حمض الخليك الجليدي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. أغسل x 2 جيدا مع برنامج تلفزيوني.
4. إضافة خافض للتوتر السطحي (NP-40، 0.05%) واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. أغسل x 3 جيد مع برنامج تلفزيوني.
6. إضافة 2% مصل الماعز العادي واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
7. صب الحل، إضافة جسم الابتدائي نيستين (علامة خلية السلف العصبية)، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
8. أغسل x 3 جيد مع برنامج تلفزيوني.
9. إضافة الثانوي جسم حمار مكافحة موس-fluorescein isothiocyanate (فيتك) والاحتفاظ العينة في الظلام ح 2.
10. أغسل x 3 جيد مع برنامج تلفزيوني.
11. أضف 1 مل هويشت 33342 وصمة عار الأنوية واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
12. أغسل جيدا بلطف والاحتفال به تحت مجهر الأسفار.

6-وفي اختبار توافق مع الحياة فيفو

ملاحظة: الفئران بوزن بين ز 201-225 قد تم اختبارها بنجاح باستخدام هذا البروتوكول.

1. التخدير
   1. الحث والمحافظة على التخدير؛ تخدير ويفضل الجرذان (الفئران "سبراغ داولي" عمرها 8 الأسبوع، أنثى) عن طريق حقن العضلي تيليتاميني وزولازيبام (25 ملغ/كغ + 25 مغ/كغ، على التوالي) وإكسيلازيني (5 ملغ/كغ). إجراء اختبار تحفيز ألم بالضغط على الأصابع للفئران للتأكد من أنيسثيتيزيشن.
2. التعقيم الجراحي الموقع
   1. الحلاقة وتنظيف جلد منطقة شبه منحرفة للفئران (على الجزء خلفي الرقبة) والقضاء عليه مع محلول بوفيدون لإعداد الشرط العقيم من الجلد (100 مغ/مل).
   2. تغطية الفئران مع الستائر الجراحية المعقمة للحد من نقل البكتيريا والتلوث اللاحق لموقع الجراحية.
3. غرس أنبوب الجيلاتين
   1. قطع الجلد من منطقة في الفئران شبه منحرفة مع مقص جراحي بلطف.
   2. إنشاء جرح 2 سم ثم ضع الأنبوبة الجيلاتين مباشرة على الطبقة بين اللفافة والعضلات.
4. جراحة بوستيمبلانتيشن
   1. إغلاق الجرح بخياطة النايلون والقضاء عليها بمحلول بوفيدون (100 مغ/مل).
   2. حمل الفئران عن طريق حقنه عضليا كيتوبروفين (2.5 مغ/كغ) وسيفازولين (15 مغ/كغ).
   3. الحفاظ على الفئران تحت ظروف معقمة لمدة 7 أيام.
5. القتل الرحيم
   1. هو euthanized الفئران عن طريق الخنق₂ CO وفقا "المبادئ التوجيهية وبرايتون" للقتل الرحيم. تأكيد وفاة الفئران برشة أخمص القدمين والذيل، متبوعاً بلمس الصدر التأكد من نبضات القلب.
   2. قص الفئران بلطف مع شفرة المبضع وإزالة الأنسجة مزروع، والتقاط الصور للمراقبة.

النتائج

في هذه الدراسة، قمنا بتطوير بنجاح الجيلاتين في الألياف (الشكل 2أ) وأنابيب (الشكل 2ب، ج) عن طريق مفهوم الغزل الرطب سهل الاستعمال. ويمكن استخدام هذه المواد على أساس الجيلاتين كأي أداة طبية، اعتماداً على الأشكال. إذ ترى أن سط?...

Discussion

قدمنا التنمية المستندة إلى الجيلاتين الحيوية باستخدام رطب بسيطة الغزل التقنية التي يمكن تطبيقها في دراسة البوليمرات الطبيعية لتجديد الأنسجة. هذا العمل أظهر إمكانية تصنيع الجيلاتين كمصدر لبروتين كبيرة دون إضافة مصادر أخرى، بهدف تحسين خصائص الجيلاتين نفسه. تطوير الحيوية على أساس الجيلات...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution preparation:
Gelatin type B (porcine)	Ferak	Art. -Nr. 10733	500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump	Gilson	Model M312	Minipuls*3
Plastic tube connector	World Precision Instruments	14011	1 box
Syringe	Sterican	5A06258541	26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone	Ferak	Art. -Nr. 00010	2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4	-
Dichloromethane	Scharlau	CL03421000	1 L vial
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	-
Hemostat	Shinetec instruments	ST-B021	-
Peripheral venous catheter (Introcan Certo)	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine	Hitachi	e1010	-
Scanning electron microscopy	Hitachi	S-3000N	-
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA	Gibco	488625	100 mL vial
Fetal bovine serum	Gibco	923119	500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium	Gibco	31600-034	Powder
Keratinocyte-SFM medium	Gibco	10744-019	500 mL vial
T25 culture flask	TPP	90025	VENT type
6-well plate	Falcon	1209938	-
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline	Gibco	654471	500 mL vial
Acetic acid glacial	Ferak	Art. -Nr. 00697	500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution)	Sigma	056K0151	500 mL vial
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000-20	20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927	-
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099	-
Hoechst 33342	Anaspec	AS-83218	5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam	Virbac	BC91	5 mL vial
Xylazine	Bayer korea	KR03227	10 mL vial
Ketoprofen	Astar	1406232	2 mL vial
Povidone-iodine solution	Everstar	HA161202	4 L barrel
Cefazolin	China Chemical & Pharmaceutical	18P909	1 g vial
Scalpel blade	Shinetec instruments	ST-B021	-
Surgical scissor	Shinetec instruments	ST-B021	-