Processus de moulage humide-filage à base de gélatine pour la régénération des tissus

Résumé

Nous avons développé et décrire un protocole basé sur le concept de filage humide, pour la construction des biomatériaux axée sur la gélatine utilisée pour l’application de l’ingénierie tissulaire.

Résumé

Cet article présente une méthode peu coûteuse pour fabriquer la gélatine, comme un polymère naturel, en fibres monofilament ou toute autre forme appropriée. Par le biais de l’humide méthode de filature, fibres de gélatine sont produits par extrusion lisse dans un milieu approprié de coagulation. Pour augmenter la surface fonctionnelle de ces fibres de gélatine et de leur capacité à imiter les caractéristiques des tissus, la gélatine peut être moulé en forme de tube en se référant à ce concept. Examinés par des essais in vitro et in vivo, les tubes de gélatine démontrent un grand potentiel d’application en génie tissulaire. Agissant comme un matériau de remplissage approprié gap, gélatine tubes peuvent être utilisés pour remplacer les tissus dans la zone endommagée (par exemple, dans le système nerveux ou cardiovasculaire), ainsi que pour favoriser la régénération en fournissant un remplacement direct des cellules souches et des circuits neuronaux. Ce protocole prévoit une procédure détaillée pour la création d’un biomatériau basé sur un polymère naturel, et sa mise en œuvre devrait grandement favoriser le développement de polymères naturels corrélatives, permettant de réaliser des stratégies de régénération des tissus.

Introduction

Le dernier développement dans la régénération des tissus implique l’application de l’ingénierie tissulaire, ce qui représente un défi pour l’amélioration de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les traitements médicaux. Par exemple, le potentiel limité de régénération du système nerveux, suivant les blessures ou les maladies, pose un problème de santé important dans le monde entier. En raison de la complexité des processus physiopathologiques associés au système nerveux, l’utilisation d’autogreffe traditionnelle ou la mise en œuvre de la chirurgie de stabilisation a été démontré d’offrir des avantages dans les résultats fonctionnels, mais il n’y a aucune preuve solide pour les effets de fixation vertébrale chirurgie^1,2. Le tissu à la zone endommagée est perdu et remplacé par des astrocytes induit hypertrophically³, formant éventuellement une cicatrice gliale dense^4,5. Cette matrice agit comme une barrière que bloque la récupération du nerf fonctionne^6,7 et est, ainsi, grandement entrave la régénération. Donc, un matériau d’écart de remplissage approprié devrait empêcher la perte de tissus et de réduire la formation du tissu conjonctif, associée à cicatrice en maintenant l’intégrité de la zone endommagée, ainsi qu’en fournissant le remplacement direct des cellules neuronales et circuits pour promouvoir la régénération axonale.

Biomatériaux polymériques ont été préféré comme échafaudages pour la thérapie de régénération des tissus, basée sur la régulation des cellules ou axone comportement et tissu la progression grâce à l’appui naturel de la matrice extracellulaire (mec). Le format de la fibre est communément considéré comme un bloc de construction pour différents matériaux, en raison de sa structure de dimension⁸. Les fibres peuvent généralement être obtenus par extrusion de fonte ou humide filature méthode ; Cependant, la grande taille et le coût de l’équipement et de la difficulté à effectuer ces méthodes sont difficiles. En outre, la majorité des travaux lié aux fibres de polymère a été axée sur les matériaux synthétiques ou composites. Polymères naturels comme source de biomatériau offrent de meilleures propriétés de biocompatibilité pour le corps humain. Néanmoins, pour obtenir un alignement des fibres polymères naturels est relativement plus difficile que de polymère synthétique sources⁹. Par conséquent, la conversion d’un polymère naturel comme une source riche de protéines, en fibres de biomatériau est une stratégie importante — non seulement les fibres du biomatériau peuvent être directement isolées de la matière première, évitant ainsi une transformation inutile aux monomères, mais la fibres de protéine ont également un bon aspect et les caractéristiques favorables¹⁰.

À cet égard, les auteurs décrivent une méthode de traitement peu coûteux pour la fabrication des fibres de polymère naturel à travers le concept de base du filage humide, pouvant être mises en œuvre sur l’échelle de laboratoire pour l’ingénierie tissulaire. Filage humide est réalisée par l’extrusion et la coagulation d’une solution de polymère dans une nonsolvent de polymère adapté. Une solution appropriée, visqueuse dopée dans le milieu de coagulation entraîne les molécules de polymère dissoudre. Par le biais de la phase de transition, les filaments puis perdent leur solubilité et sont précipités sous la forme d’un polymère solide étape¹¹. Se référant à ce concept, nous avons élargi puis le développement de la gélatine dans la forme du tube par un procédé de moulage, qui est considérée comme approprié pour application de régénération tissulaire. En outre, intrinsèquement, nous pouvons également développer toutes les formes de matière de fibres de gélatine (par exemple, conduit de gélatine enroulé plusieurs fibres de gélatine), pour d’autres voulu des applications.

Gélatine, un polymère naturel biodégradable, est formée de collagène dénaturé et hydrolysée, y compris n’importe quel état hélicoïdale semi-cristallin, amorphe ou triple de collagène¹². Il est bien connu que le collagène est la protéine structurale essentielle dans tous les tissus conjonctifs de vertébrés et invertébrés^13,14, qui est similaire à la structure de la protéine de l’ECM principal qui induit la croissance nerveuse et, simultanément, remplace une grande quantité de glycosaminoglycanes sécrétée au cours de la moelle épinière. Par conséquent, l’utilisation de la gélatine en tant que source serait un excellent choix pour n’importe quel véhicule médicalisé. En plus d’être une source peu coûteuse, gélatine est aussi biodégradable et cytocompatible et cliniquement prouvé pour être temporaire défaut remplissage¹⁵. Est devenue une forme de tube, des essais in vitro et in vivo décrits ici démontrent que la gélatine a une excellente biocompatibilité et l’aptitude au tissu futur applications d’ingénierie. Cultivés avec des cellules souches humaines adipeuses, tubes de gélatine améliorent la différenciation cellulaire dans les cellules progénitrices neurales à l’aide de nestin coloration positive comme un marqueur de cellules neurales. En outre, gélatine comme garnissage d’écart, sont produits par la méthode établie dans la présente étude, devrait être facile à gérer en toute sécurité et profiter grandement ingénieurs de tissus qui sont en train de développer des polymères naturels corrélatives pour le renforcement du tissu stratégies de régénération.

Protocole

Les tissus adipeux ont été obtenues de chirurgies orthopédiques, attestée par l’institutionnel Conseil examen de hôpital général pour le Tri-Service, Taipei, Taiwan, R.O.C. procédures portant sur des sujets animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux au National Centre médical de la défense, Taiwan (équipe R.O.C).

1. Imprégnez processus de filature

1. Préparation de la solution
   1. Dissoudre 5 g de poudre de gélatine dans 100 mL d’eau bidistillée à obtenir 5 % (p/v) concentration de la solution.
   2. Agiter le mélange lentement à 60-70 ° C pendant la nuit afin d’obtenir une dispersion parfaitement homogène sans les bulles.
2. Mouiller la filature
   1. Formation de fibre
      Remarque : Un schéma de la méthode est illustré dans la Figure 1A. La configuration de la filature est équipée d’une machine à pompe péristaltique (voir Table des matières) qui fournit une vitesse de haute précision et contrôler la prestation lisse de l’écoulement.
      1. Branchez une seringue de 26 x 1/2 pouce (0,45 x 12 mm) comme l’injecteur solution tuyau en vinyle transparent.
      2. Préparer 100 mL de solution d’acétone de 99,5 % dans un verre de Becher pour être utilisé comme le bain de coagulation.
      3. Exécutez la machine pompe péristaltique à 21 tr/min (3,25 mL/min) et laisser la solution de gélatine pendant quelques secondes dans une solution d’acétone avant faisant rouler vers le haut.
      4. Retirer les fibres de la gélatine de la solution d’acétone et immerge-les dans 2,5 % (p/v) de solution de polycaprolactone/dichlorométhane (PCL/DCM) à 01:20 (w/w).
      5. Laissez la gélatine des fibres dans la solution PCL/DCM sec durant la nuit, sous le capot à la température ambiante.
   2. Formation du tube
      Remarque : Une représentation schématique de la méthode est illustrée à la Figure 1B.
      1. Utiliser un cathéter veineux périphérique de 24 x 3/4 pouce (0,7 mm x 19 mm) comme le moule de tube.
      2. Charger le cathéter dans la solution de gélatine et tenez-le là pendant 3 s.
      3. Charger le cathéter dans la solution d’acétone et maintenez pendant 1 min.
      4. Charger le cathéter à nouveau dans la solution de gélatine et tenez-le là pendant 3 s.
      5. Répétez cette procédure remplaçant 20 x.
      6. Retirer le cathéter de la solution d’acétone et laisser le tube moulé à sécher à température ambiante pendant 5 min.
      7. Retirez délicatement le tube de gélatine du cathéter à l’aide d’une pince hémostatique et transvaser avec soin le tube de gélatine dans une pipette Pasteur en verre avec l’immersion de 2,5 % (p/v) de la solution PCL/DCM.
      8. Laissez la pipette Pasteur contenant que la solution PCL/DCM sec et un tube de gélatine pour la nuit, sous le capot à la température ambiante.

2. morphologie du tube de gélatine

1. Monter le morceau de tube de gélatine séchés sur une ébauche de carbone.
2. Placer l’échantillon dans la machine de coucheuse ion par pulvérisation cathodique (voir Table des matières) et enrober l’échantillon avec de l’or pendant 60 s ; puis, observez sa morphologie par microscopie électronique à balayage (voir Table des matières).

3. la culture des cellules souches adipeuses

1. Placer les tissus adipeux (obtenues par le tissu adipeux orale par chirurgie clinique) dans une boîte de pétri contenant 10 mL de solution de transfert consistant en une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,1 M, 1 % pénicilline/streptomycine et 0,1 % de glucose.
2. Couper les tissus en petits morceaux (moins de 1 mm²) avec une lame de bistouri.
3. Transférer les tissus dans un tube en plastique de 15 mL et centrifuger à 500 x g pendant 5 min.
4. Retirez le surnageant et incuber les sédiments dans un tube en plastique contenant 10 mL de milieu de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM, composé de 4 mM de L-glutamine, pyruvate de sodium 1 mM et 15 mg/L rouge de phénol) avec la collagénase de 0,1 % à 37 ° C, en atmosphère humidifiée contenant 95 % air et 5 % du CO₂, de 1 jour.
5. Centrifuger le tube en plastique à 500 g pendant 5 min, jeter le surnageant avec précaution (ne pas toucher les sédiments), puis, suspendre le sédiment doucement en ajoutant 10 mL de DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) et laissez reposer pendant 1 nuit à 37 ° C , dans une atmosphère humidifiée contenant 95 % air et 5 % de CO₂.
6. Centrifuger le tube en plastique à 500 g pendant 5 min et éliminer le surnageant avec soin ; Ensuite, ajouter 1 mL de milieu de cellules souches (constituée de kératinocytes milieu sans sérum (K-GDF), 5 % de FBS, N-acétyl-L-cystéine, l’acide ascorbique-2-phosphate, streptomycine et amphotéricine) pour suspendre le sédiment, transférez-le dans un flacon de culture de T25 contenant 4 mL de moyen de cellules de la tige et laissez reposer pendant 3 jours à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 95 % air et 5 % de CO₂.
7. Jeter le surnageant, ajouter 1 mL d’acide de 0,25 % trypsine-tétraacétique (EDTA) et elle incuber à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 95 % d’air et 5 % CO₂ pendant 3,5 min, pour détacher les cellules du fond de la fiole de la culture.
8. Ajouter 1 mL de FBS, suspendre le mélange et le transférer dans un tube de microcentrifuge.
9. Centrifuger la suspension à 500 g pendant 3,5 min, suspendre le sédiment avec 1 mL de milieu de cellules souches et introduire dans la fiole de culture contenant 5 mL de milieu de cellules souches ; Ensuite, maintenir à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 95 % air et 5 % de CO₂.
10. Maintenir la sous-culture en changeant le support de cellules souches tous les 3 jours.

4. la culture de cellules sur le Tube de gélatine

1. Stériliser le tube de gélatine avec la lumière UV pendant 2 h ; Ensuite, l’immerger dans de l’éthanol à 75 % (v/v) et le laver 2 x avec cellules souches moyen pour éliminer l’éthanol résiduel.
2. Recueillir les tissu adipeux des cellules souches humaines (hASCs) du flacon de culture.
   1. Retirez le support du flacon de culture.
   2. Ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA et incuber à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 95 % air et 5 % de CO₂ pendant 3,5 minutes, pour détacher les hASCs du fond de la fiole de la culture.
   3. Ajouter 1 mL de FBS, suspendre le mélange et le transférer dans un tube de microcentrifuge.
   4. Centrifuger le tube de microcentrifuge à 500 x g pendant 3,5 min ; Ensuite, jeter le surnageant avec soin et suspendre le sédiment avec 1 mL de milieu de cellules souches.
3. Placer le tube de gélatine dans une assiette de 6 puits contenant 3 mL de milieu de cellules souches et graine de 4 x 10⁴ de hASCs dans le tube ; les incuber pendant 2 semaines à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 95 % air et 5 % de CO₂.
4. Changer le support de cellules souches tous les 3 jours pour fournir assez de nutrition pour la croissance cellulaire.

5. immunocytochimie

1. Enlever le support de cellules souches et laver le puits avec du PBS.
2. Fixer le tube avec des cellules avec 0,1 % d’acide acétique glacial pendant 30 min à température ambiante.
3. Laver le bien 2 fois avec du PBS.
4. Ajouter un surfactant (NP-40, 0,05 %) et incuber pendant 10 min à température ambiante.
5. Laver le bien 3 fois avec du PBS.
6. Ajouter 2 % de sérum de chèvre normal et incuber à température ambiante pendant 30 min.
7. Décanter la solution, ajoutez l’anticorps primaire nestin (marqueur de cellules progénitrices neurales) et incuber une nuit à 4 ° C.
8. Laver le bien 3 fois avec du PBS.
9. Ajouter anticorps secondaire âne anti-mouse-fluorescéine isothiocyanate (FITC) et conserver l’échantillon dans l’obscurité pendant 2 h.
10. Laver le bien 3 fois avec du PBS.
11. Ajouter 1 mL de Hoechst 33342 pour souiller les noyaux et incuber pendant 10 min à température ambiante.
12. Laver le puits doucement et observez-la sous un microscope à fluorescence.

6. essai in Vivo biocompatibilité

Remarque : Des rats avec un poids entre 201-225 g ont été testés avec succès à l’aide de ce protocole.

1. Anesthésie
   1. Induire et maintenir l’anesthésie ; de préférence, anesthésier un rat (rat Sprague Dawley âgés de 8 semaines, femelle) via une injection intramusculaire de tiletamine et zolazepam (25 mg / kg + 25 mg / kg, respectivement) et de xylazine (5 mg/kg). Effectuer un test de stimulation de douleur en appuyant sur les doigts de rat pour confirmer l’anesthetization.
2. Stérilisation du site chirurgical
   1. Se raser et nettoyer la peau du quartier du trapèze de rat (sur l’arrière du cou) et essuyer avec la lotion de povidone-iode pour préparer l’état aseptique de peau (100 mg/mL).
   2. Couvrir le rat avec des draps chirurgicaux stériles pour réduire le transfert de bactéries et de contamination ultérieure du site chirurgical.
3. Implantation du tube de gélatine
   1. Doucement, couper la peau du quartier du trapèze de rat avec un ciseaux chirurgicaux.
   2. Créer une plaie de 2 cm et placer le tube de gélatine directement sur la couche entre l’aponévrose et le muscle.
4. Chirurgie postimplantation
   1. Refermer la plaie avec suture de nylon et essuyez-le avec solution de povidone-iode (100 mg/mL).
   2. Induire le rat par une injection intramusculaire de kétoprofène (2,5 mg/kg) et de la céfazoline (15 mg/kg).
   3. Garder le rat dans des conditions aseptiques pendant 7 jours.
5. Euthanasie
   1. Rat est euthanasié par asphyxie₂ CO conformément aux directives de l’AVMA d’euthanasie. Confirmer la mort de rat par pinch orteil et la queue, suivie de poitrine toucher afin d’assurer le rythme cardiaque.
   2. Couper le rat doucement avec une lame de scalpel, enlever le tissu implanté et prendre des photos pour l’observation.

Résultats

Dans cette étude, nous avons développé avec succès la gélatine en fibres (Figure 2A) et les tubes (Figure 2B, C) à travers le concept convivial filage humide. Ces matériaux à base de gélatine peut être utilisées comme n’importe quel outil médical, selon leurs formes. Considérant que la surface fonctionnelle et la trame de ces matériaux sont plus adaptés pour la régénération de...

Discussion

Nous avons présenté le développement des biomatériaux à base de gélatine en utilisant un simple humide filage technique qui peut être appliquée dans l’étude des polymères naturels pour la régénération des tissus. Ce travail a démontré la possibilité de fabrication de la gélatine comme source de protéines grande sans l’ajout d’autres sources, dans le but d’optimiser les propriétés de la gélatine lui-même. Le développement des biomatériaux axée sur la gélatine a été entièrement réalis?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution preparation:
Gelatin type B (porcine)	Ferak	Art. -Nr. 10733	500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump	Gilson	Model M312	Minipuls*3
Plastic tube connector	World Precision Instruments	14011	1 box
Syringe	Sterican	5A06258541	26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone	Ferak	Art. -Nr. 00010	2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4	-
Dichloromethane	Scharlau	CL03421000	1 L vial
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	-
Hemostat	Shinetec instruments	ST-B021	-
Peripheral venous catheter (Introcan Certo)	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine	Hitachi	e1010	-
Scanning electron microscopy	Hitachi	S-3000N	-
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA	Gibco	488625	100 mL vial
Fetal bovine serum	Gibco	923119	500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium	Gibco	31600-034	Powder
Keratinocyte-SFM medium	Gibco	10744-019	500 mL vial
T25 culture flask	TPP	90025	VENT type
6-well plate	Falcon	1209938	-
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline	Gibco	654471	500 mL vial
Acetic acid glacial	Ferak	Art. -Nr. 00697	500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution)	Sigma	056K0151	500 mL vial
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000-20	20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927	-
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099	-
Hoechst 33342	Anaspec	AS-83218	5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam	Virbac	BC91	5 mL vial
Xylazine	Bayer korea	KR03227	10 mL vial
Ketoprofen	Astar	1406232	2 mL vial
Povidone-iodine solution	Everstar	HA161202	4 L barrel
Cefazolin	China Chemical & Pharmaceutical	18P909	1 g vial
Scalpel blade	Shinetec instruments	ST-B021	-
Surgical scissor	Shinetec instruments	ST-B021	-