Islak eğirme esaslı kalıplama işlemi doku rejenerasyonu için jelatin

Özet

Geliştirilen ve jelatin tabanlı Biyomalzeme doku Mühendisliği uygulama için kullanılacak inşası için ıslak eğirme kavramı dayalı bir iletişim kuralı tanımlayın.

Özet

Bu makalede monofilament iplik veya uygun diğer biçimleri jelatin, doğal bir polimer imal etmek ucuz bir yöntem sunuyor. Islak yöntemi iplik, jelatin lifler uygun koagülasyon ortamda düzgün ekstrüzyon tarafından üretilmektedir. İşlevsel yüzey bu jelatin lifleri ve doku özelliklerini taklit yeteneğini artırmak için jelatin tüp forma bu kavramı bakarak kalıplanmış. Tüp Bebek ve içinde vivo testleri tarafından muayene, jelatin tüpler doku Mühendisliği uygulama için büyük bir potansiyel göstermek. Görevi uygun dolgu boşluğu malzemesi, jelatin Borular hasarlı bölgeyi dokusunda (örneğin, sinirli ya da Kardiyovasküler sistemde) yerine gibi doğrudan yerine kök hücreler ve nöro çevrim sağlayarak yeniden oluşturma işlemi tanıtmak için kullanılabilir. Bu protokol üzerinde doğal bir polimer esaslı bir biomaterial oluşturmak için ayrıntılı bir yönerge sağlar ve uygulanması büyük yarar doku rejenerasyonu stratejileri gerçekleştirmek için yardım Bağdaşık doğal polimerler geliştirilmesi bekleniyor.

Giriş

Doku rejenerasyonu en son gelişme tıbbi tedaviler yeni tedavi stratejileri geliştirilmesi için bir meydan okuma gösteren doku Mühendisliği uygulama içerir. Örneğin, sınırlı potansiyeli sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi, aşağıdaki yaralanma veya hastalık, dünya çapında bir önemli sağlık sorunu teşkil etmektedir. Sinir sistemi ile ilgili patofizyolojik süreçlerin karmaşıklığı, nedeniyle geleneksel otogrefti kullanımı veya sabitleme cerrahi uygulamaları fonksiyonel sonuçlar avantajlar gösterilmiştir, ancak için güçlü hiçbir kanıt Omurilik fiksasyon ameliyat^1,2etkileri. Hasarlı bölgeyi, doku kaybetti ve sonunda yoğun gliyal yara^4,5şekillendirme hypertrophically indüklenen astrocytes³ile eski yerine koymak. Bu matris sinir kurtarılması^6,7 işlev ve ki, bloklar böylece, büyük ölçüde engel olduğunu rejenerasyon bir engel olarak davranır. Bu nedenle, uygun doldurma boşluğu malzeme doku kaybı önlemek ve hasarlı bölgeyi bütünlüğünü muhafaza yanı sıra sinir hücreleri doğrudan değiştirme sağlayan bağ dokusu skar ilişkili oluşumunu azaltmak için bekleniyor ve devresi Axon rejenerasyon teşvik etmek.

Polimer Biyomalzeme iskele için doku yenileme terapisi, hücre veya axon davranış ve doku ilerleme doğal hücre dışı Matriks (ECM) desteği ile düzenlenmesi dayalı olarak tercih edilmiştir. Fiber biçimi genellikle onun tek boyutlu yapısı⁸sayesinde çeşitli malzemeler için bir yapı taşı olarak kabul edilir. Lifler genellikle eritebilir ekstrüzyon veya ıslak eğirme yöntemi tarafından elde edilebilir; Ancak, büyük boy ve maliyet ekipman ve bu yöntemler gerçekleştirmek için zorluk zor vardır. Buna ek olarak, polimer lifleri için ilgili çalışmaları çoğunluğu sentetik veya kompozit malzemeler üzerinde odaklanmıştır. Biomaterial kaynağı olarak doğal polimerler daha iyi Biyouyumluluk özellikleri insan vücudu için sunuyoruz. Yine de, doğal polimer lifleri hizalama elde etmek için sentetik polimer kaynakları⁹/ nispeten daha zordur. Bu nedenle, doğal bir polimer protein zengin bir kaynak olarak biomaterial lifleri dönüşüm önemli bir stratejidir — sadece biomaterial lifleri olabilir doğrudan hammadde, böylece monomerleri, gereksiz bir dönüşümü kaçınarak dan izole ama protein lifleri de iyi görünüm ve olumlu özelliklerini¹⁰var.

Bu bağlamda, biz doğal polimer lifleri için doku Mühendisliği laboratuvar ölçekte uygulanacak ıslak eğirme, temel kavramı ile üretim için bir ucuz işleme yöntemi açıklanmaktadır. Islak iplik ekstrüzyon ve uygun polimer nonsolvent içine bir polimer çözüm koagülasyon tarafından gerçekleştirilir. Uygun, yapışkan çözümünü koagülasyon orta katkılı polimer molekülleri erimeye neden olur. Faz geçiş yoluyla filamentler sonra onların çözünürlük kaybetmek ve bir katı polimer faz¹¹şeklinde çöktürülmüş. Bu konsepte atıfta, biz o zaman jelatin geliştirme tüp şekle doku rejenerasyonu uygulama için uygun olarak kabul edilir bir kalıplama işlemi tarafından genişletilmiş. Buna ek olarak, özünde, biz de herhangi bir şekil jelatin liflerinden malzemenin gelişebilir (örneğin, jelatin conduit yerleştirilmiştir birkaç jelatin lifleri), diğeri için istenen uygulamalar.

Jelatin, bir biyolojik doğal polimer denatüre ve hidrolize kolajen herhangi bir semicrystalline, amorf veya üçlü sarmal devlet kollajen¹²de dahil olmak üzere oluşturulur. Bu kolajen olduğunu tüm bağ dokusu, sinir büyüme indükler ana ECM protein yapısına benzeyen omurgalı ve omurgasız^13,14, temel yapısal protein bilindiği ve, aynı anda, omurilik yaralanmaları sırasında salgılanan glikozaminoglikan büyük miktarda yerini alır. Bu nedenle, bir kaynak olarak jelatin kullanımı tıbbi herhangi bir araç için mükemmel bir seçim olurdu. Ucuz bir kaynak olmasının yanı sıra, jelatin de biyolojik olarak parçalanabilen ve cytocompatible ve klinik olarak kanıtlanmış bir geçici dolgu¹⁵kusur olmak. , Tüp forma geliştirilen tüp bebek ve içinde vivo testleri burada açıklanan göstermek jelatin bir mükemmel Biyouyumluluk ve gelecekteki doku mühendisliği uygulamaları için uygunluk var. Kültürlü insan yağ kök hücreleri ile jelatin tüpleri pozitif testin bir sinir hücre marker olarak boyama kullanarak hücre farklılaşması nöral progenitör hücre içine geliştirmek. Ayrıca, jelatin boşluk, bu çalışmada, kurulan yöntemi tarafından üretilen gibi dolgu olarak yönetilebilir ve güvenli olması ve büyük yarar şu anda geliştirme doku için Bağdaşık doğal polimerler gelişmekte olan doku mühendisleri için bekleniyor rejenerasyon stratejileri.

Protokol

Yağlı doku ortopedik ameliyatlar kurumsal inceleme kurulu, Tri-hizmet genel hastane tarafından sertifikalı olarak elde edilmiştir, Taipei, Tayvan, R.O.C. yordamlar hayvan konular içeren ulusal, hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış olan Savunma Tıp Merkezi, Tayvan (R.O.C).

1. işlem iplik ıslak

1. Çözüm hazırlık
   1. 5 g jelatin tozu %5 (w/v) çözüm konsantrasyonu elde etmek için çift distile su 100 ml geçiyoruz.
   2. Karışımı yavaş yavaş 60-70 ° C'de herhangi bir kabarcıklar olmadan tamamen homojen bir dağılım elde etmek için gecede ilave edin.
2. İplik ıslak
   1. Fiber oluşumu
      Not: Yönteminin şematik Resim 1içindeAgösterilir. İplik kurulum Peristaltik pompa makine ile donatılmış yüksek hassasiyetli hız sağlar ( Tablo malzemelerigörmek) ve akışını düzgün teslimini kontrol eder.
      1. 26 G x 1/2 inç (0,45 mm x 12 mm) şırınga çözüm enjektör açık vinil tüp içine takın.
      2. 100 mL % 99.5 aseton çözeltisi koagülasyon banyo kullanılmak üzere bir kabı cam hazırlayın.
      3. Peristaltik pompa makine 21 rpm'de (3.25 mL/dk) yap, birkaç saniye içinde aseton çözüm kadar inişli çıkışlı önce stand jelatin çözüm.
      4. Jelatin lifleri aseton çözümden çıkar ve onları %2.5 (w/v) polycaprolactone/diklorometan (PCL/DCM) çözüm 1:20 (w/w) içine bırakın.
      5. PCL/DCM çözüm kuru lifler, oda sıcaklığında başlık altında bir gecede jelatin izin.
   2. Tüp oluşumu
      Not: Yönteminin şematik Resim 1'Bgösterilir.
      1. 24 G x 3/4 inç (0.7 mm x 19 mm) periferik Venöz kateter tüp kalıp olarak kullanın.
      2. Kateter jelatin çözüm içine yük ve 3 için yerde kal s.
      3. Kateter aseton çözüm içine yük ve 1 dakika tutun.
      4. Kateter yeniden jelatin çözüm yükleyin ve 3 için yerde kal s.
      5. Bu alternatif yordam 20 x tekrarlayın.
      6. Kateter aseton çözümden çıkar ve 5 min için oda sıcaklığında kuru kalıp tüp izin.
      7. Yavaşça kateter jelatin tüpünden bir hemostat kullanarak çıkar ve dikkatle jelatin tüp bir bardak PCL/DCM çözüm daldırma (w/v) % 2.5 ile Pasteur pipet aktarmak.
      8. Pasteur pipet içeren jelatin tüp ve PCL/DCM çözüm kuru, oda sıcaklığında başlık altında bir gecede izin.

2. Morfoloji jelatin tüp

1. Kurutulmuş jelatin tüp parçası üzerinde karbon saplama takma.
2. Örnek iyon sputter coater makine koymak ( Tablo malzemelerigörmek) ve örnek altın 60 kat s; sonra morfolojisi elektron mikroskobu tarama yoluyla gözlemlemek ( Tablo malzemelerigörmek).

3. Kültür insan yağ kök hücrelerin

1. (Klinik cerrahi ile sözlü Yağ dokusundan elde edilen) yağlı doku 10 mL 0.1 M fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), % 1 penisilin/streptomisin ve % 0.1 glikoz transferi çözeltisi içeren bir Petri kabına yerleştirin.
2. Belgili tanımlık doku küçük parçalara (1 mm²' den az) bir neşter bıçakla kesti.
3. 15 mL plastik tüp ve 5 min için 500 x g , santrifüj içine belgili tanımlık doku transfer.
4. Süpernatant kaldırmak ve oksijen bir atmosferde 37 ° C'de % 0,1 collagenase ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM, 4 mM L-glutamin, 1 mM sodyum pyruvate ve 15 mg/L fenol red oluşan) 10 mL içeren bir plastik tüp tortu kuluçkaya % 95 hava ve % 5 CO₂, 1 gün için içeren.
5. 500 x g 5 min için de plastik tüp santrifüj kapasitesi, dikkatle süpernatant atın (tortu dokunmatik değil) ve sonra tortu yavaşça 10 mL % 10 fetal sığır serum (FBS) içeren DMEM ekleyerek askıya alma ve 37 ° C'de 1 gün için stand izin , bir oksijen atmosferde içeren % 95 hava ve % 5 CO₂.
6. 500 x g 5 min için de plastik tüp santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatli atmak; sonra kök hücre orta (keratinosit serum-Alerjik orta (K-SFM), %5 FBS, N-asetil-L-sistein, askorbik asit-2-fosfat, streptomisin ve Amfoterisin oluşan) tortu askıya alma, bu transfer için 1 mL 4 mL içeren bir T25 kültür şişesi ekleyin kök hücre orta ve oksijen bir atmosferde % 95 hava ve % 5 CO₂içeren 37 ° C'de 3 gündür stand izin verin.
7. Süpernatant atmak, 1 mL % 0.25 tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin ve kültür balonun altındaki hücreleri ayırmak için % 95 hava ve % 5 CO₂ 3,5 dakika, içeren bir oksijen atmosferde 37 ° C'de kuluçkaya.
8. 1 mL FBS ekleyin, karışım askıya alma ve bir microcentrifuge tüp aktarın.
9. Süspansiyon vasıl 500 x g 3,5 dk santrifüj kapasitesi, tortu kök hücre orta 1 mL ile askıya alma ve kök hücre orta 5 mL içeren kültür şişeye nakletmek; daha sonra bir oksijen atmosferde % 95 hava ve % 5 CO₂içeren 37 ° C'de tutmak.
10. Alt kültür 3 günde kök hücre orta değiştirerek korumak.

4. hücre jelatin Tube tarımı

1. Jelatin tüp 2s için UV ışığıyla sterilize; o zaman, %75 (v/v) etanol bırakın ve yıkayın kalan etanol kaldırmak için kök hücre orta ile 2 x.
2. İnsan yağ kök hücreleri (hASCs) kültür balonun toplamak.
   1. Orta kültür balonun kaldırın.
   2. 1 mL % 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve oksijen bir atmosferde % 95 hava ve % 5 hASCs kültür balonun altından ayırmak için 3,5 dakika, CO₂ içeren 37 ° C'de kuluçkaya.
   3. 1 mL FBS ekleyin, karışım askıya alma ve bir microcentrifuge tüp aktarın.
   4. Microcentrifuge tüp vasıl 500 x g 3,5 dk santrifüj kapasitesi; o zaman, dikkatlice süpernatant atın ve tortu kök hücre orta 1 mL ile askıya alma.
3. Jelatin tüp kök hücre orta 3 mL içeren bir 6-şey tabağına yerleştirin ve 4 x 10⁴ hASCs tüp / tohum; Onları içeren % 95 hava ve % 5 CO₂oksijen bir atmosferde 37 ° C'de 2 hafta kuluçkaya.
4. Kök hücre orta 3 günde yeterli beslenme için hücre büyümesini sağlamak için değiştirin.

5. Immunocytochemistry

1. Kök hücre orta kaldırmak ve PBS ile iyi yıkayın.
2. Buzul, oda sıcaklığında 30 dakika % 0,1 asetik asitle hücreleri ile tüp düzeltmek.
3. De 2 x PBS ile yıkayın.
4. Bir yüzey aktif (NP-40, % 0.05) Ekle ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
5. PBS ile de 3 x yıkayın.
6. % 2 normal keçi serum ekleyin ve 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
7. Çözüm dikkatle boşaltmak, birincil antikor (nöral progenitör hücre işaretçisi) testin eklemek ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya
8. PBS ile de 3 x yıkayın.
9. İkincil antikor eşek mouse-floresein isothiocyanate (FITC) ekleyin ve 2 h için örnek anlatmamanı.
10. PBS ile de 3 x yıkayın.
11. Çekirdeklerin leke ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya Höchst 33342 1 mL ekleyin.
12. İyi yıkamak yavaşça ve floresan mikroskop altında gözlemlemek.

6 vivo Biyouyumluluk testi.

Not: 201-225 g arasında bir ağırlık ile rats başarıyla bu iletişim kuralını kullanan test edilmiştir.

1. Anestezi
   1. Neden ve anestezi korumak; tercihen, bir fare (8 haftalık Sprague Dawley rat, kadın) ile tiletamine ve zolazepam bir kas içi enjeksiyon anestezi (25 mg / kg + 25 mg / kg, sırasıyla) ve xylazine (5 mg/kg). Anesthetization onaylamak için sıçan parmak basarak bir ağrı stimülasyon testi gerçekleştirin.
2. Sterilizasyon cerrahi sitesi
   1. Tıraş ve (boyun arkası) üzerinde fare trapezius alan cilt temizlemek ve cilt (100 mg/mL) aseptik durumunu hazırlamak için povidone-iyot losyon ile silin.
   2. Bakteri transfer ve cerrahi sitesi sonraki kirlenme azaltmak için steril cerrahi perdeler fareyle kapsar.
3. Jelatin tüp implantasyonu
   1. Yavaşça fare trapezius alan Cerrahi makas ile deriyi kesme.
   2. Bir yara 2 cm oluşturun ve fasya ve kas arasında doğrudan katmandaki jelatin tüpü yerleştirin.
4. Postimplantation cerrahi
   1. Naylon dikiş yarayla kapatın ve povidone-iyot çözüm (100 mg/mL) ile silin.
   2. Fareyi ketoprofen (2.5 mg/kg) ve sülfadiyazin (15 mg/kg) bir kas içi enjeksiyon yoluyla teşvik.
   3. 7 gün için aseptik şartlarda sıçan tutmak.
5. Ötenazi
   1. Sıçan ötenazi için Travma kuralları uyarınca CO₂ Havasızlıktan Boğulma yoluyla euthanized. Kalp atışı sağlamak için göğüs dokunarak takip ayak ve kuyruk tutam tarafından fare ölümü onaylayın.
   2. Fareyi yavaşça bir neşter bıçakla kesmek, implante dokuyu ve gözlem için fotoğraf çekmek.

Sonuçlar

Bu çalışmada, biz lifleri (Şekil 2A) içine jelatin ve tüpler (Şekil 2B, C) kullanıcı dostu ıslak eğirme kavramı aracılığıyla geliştirdi. Bu jelatin-esaslı malzemeler şekillerini bağlı olarak tıbbi herhangi bir aracı olarak yararlı olabilir. İşlevsel yüzey ve çerçeve gibi malzemelerin doku rejenerasyonu için daha uygun olduğunu göz önünde bulundurursak, tüp bebek...

Tartışmalar

Biz jelatin tabanlı Biyomalzeme gelişimi basit bir ıslak doku rejenerasyonu için doğal polimerler çalışmada uygulanan teknik iplik kullanarak sundu. Bu eser olasılığını jelatin imalat jelatin kendisi özelliklerini optimize etmek amacı ile diğer kaynaklardan ek olmadan büyük protein kaynağı olarak gösterdi. Jelatin tabanlı Biyomalzeme gelişimi tamamen oda sıcaklığında (22-26 ° C) gerçekleştirilmiştir. Bir nazik çözüm iletişim kuralına, önemli bir adım olarak bir kesin çözüm konsant...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution preparation:
Gelatin type B (porcine)	Ferak	Art. -Nr. 10733	500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump	Gilson	Model M312	Minipuls*3
Plastic tube connector	World Precision Instruments	14011	1 box
Syringe	Sterican	5A06258541	26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone	Ferak	Art. -Nr. 00010	2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500	Perstorp	24980-41-4	-
Dichloromethane	Scharlau	CL03421000	1 L vial
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	-
Hemostat	Shinetec instruments	ST-B021	-
Peripheral venous catheter (Introcan Certo)	B. Braun	1B03258241	24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine	Hitachi	e1010	-
Scanning electron microscopy	Hitachi	S-3000N	-
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA	Gibco	488625	100 mL vial
Fetal bovine serum	Gibco	923119	500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium	Gibco	31600-034	Powder
Keratinocyte-SFM medium	Gibco	10744-019	500 mL vial
T25 culture flask	TPP	90025	VENT type
6-well plate	Falcon	1209938	-
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline	Gibco	654471	500 mL vial
Acetic acid glacial	Ferak	Art. -Nr. 00697	500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution)	Sigma	056K0151	500 mL vial
Normal goat serum	Vector Laboratories	S-1000-20	20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-23927	-
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody)	Santa Cruz Biotechnology	SC-2099	-
Hoechst 33342	Anaspec	AS-83218	5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam	Virbac	BC91	5 mL vial
Xylazine	Bayer korea	KR03227	10 mL vial
Ketoprofen	Astar	1406232	2 mL vial
Povidone-iodine solution	Everstar	HA161202	4 L barrel
Cefazolin	China Chemical & Pharmaceutical	18P909	1 g vial
Scalpel blade	Shinetec instruments	ST-B021	-
Surgical scissor	Shinetec instruments	ST-B021	-