Una técnica de fijación interna miniinvasiva para el estudio de la contractura de flexión de rodilla inducida por inmovilización en ratas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para describir una técnica mínimamente invasiva para la inmovilización articular de rodilla en un modelo de rata. Este protocolo reproducible, basado en el modus de separación músculo-brecha y la habilidad de mini-incisión, es adecuado para estudiar el mecanismo molecular subyacente de la contractura articular adquirida.

Resumen

La contractura articular, resultante de una inmovilización articular prolongada, es una complicación común en la ortopedia. Actualmente, la utilización de una fijación interna para restringir la movilidad de las articulaciones de la rodilla es un modelo ampliamente aceptado para generar contractura experimental. Sin embargo, la aplicación de implantación inevitablemente causará trauma quirúrgico a los animales. Con el objetivo de desarrollar un enfoque menos invasivo, combinamos un modus de separación músculo-brecha con una habilidad de mini-incisión previamente reportada durante el procedimiento quirúrgico: Se hicieron dos mini incisiones cutáneas en el muslo lateral y la pierna, seguidas de la realización de la brecha muscular separación para exponer la superficie ósea. La articulación de la rodilla de la rata fue inmovilizada gradualmente por una fijación interna preconstruida a aproximadamente 135o flexión de la rodilla sin interferir en los nervios esenciales o los vasos sanguíneos. Como era de esperar, esta sencilla técnica permite una rápida rehabilitación postoperatoria en animales. La posición correcta de la fijación interna se confirmó mediante un análisis de rayos X o micro-CT. El rango de movimiento se restringió significativamente en la articulación inmovilizada de la rodilla que la observada en la articulación contralateral de la rodilla que demuestra la eficacia de este modelo. Además, el análisis histológico reveló el desarrollo de la deposición fibrosa y la adhesión en la cápsula de la articulación posterior-superior de la rodilla con el tiempo. Por lo tanto, este modelo mini-invasivo puede ser adecuado para imitar el desarrollo de contractura inmovilizada de la articulación de la rodilla.

Introducción

Las contracturas articulares se definen como una restricción en el rango pasivo de movimiento (ROM) de una articulación diarthrodial^1,2. Las terapias actuales destinadas a prevenir y tratar la contractura articular han alcanzado cierto éxito^3,4. Sin embargo, el mecanismo molecular subyacente de la contractura articular adquirida sigue siendo en gran medida desconocido⁵. La etiología de las contracturas articulares en diferentes comunidades sociales es muy diversa e incluyefactores genéticos, estados postraumáticos, enfermedades crónicas e inmovilidad prolongada 6. Es ampliamente aceptado que la inmovilidad es un problema crítico en el desarrollo de la contractura conjunta adquirida⁷. Las personas que sufren de una contractura articular importante pueden resultar en última instancia en discapacidad física⁸. Por lo tanto, un modelo animal estable y reproducible es necesario para investigar los posibles mecanismos fisiopatológicos de la contractura articular adquirida.

Los modelos de contractura de la articulación de rodilla inducidos por inmovilización actualse se logran principalmente mediante la utilización de moldes de yeso no invasivos, fijaciones externas y fijaciones internas. Watanabe et al. informaron de la posibilidad de utilizar inmovilización de yeso fundido en las articulaciones de la rodilla de rata⁹. Al usar una chaqueta especial, un lado de la articulación de la extremidad inferior de la rata es inmovilizado por un yeso. La articulación de la rodilla de rata puede permanecer completamente flexionada sin ningún trauma quirúrgico^10,11. Sin embargo, tanto los movimientos articulares de cadera como de tobillo también se ven afectados por esta forma de inmovilización, que puede aumentar el grado de atrofia muscular en cuádriceps femoris o gastrocnemius^12. Además, el edema y la congestión de las extremidades posteriores deben evitarse reemplazando el yeso en los puntos de tiempo establecidos, lo que puede afectar a la continuidad de la inmovilidad. Otro método aceptado para el establecimiento de un modelo de contractura articular de rodilla es el uso de fijación quirúrgica externa. Nagai y otros combinaron alambre Kirschner y alambre de acero en un fijador externo, que inmovilizó la articulación de la rodilla a aproximadamente 140o de flexión^13. En este método, se utiliza una resina para cubrir la superficie para evitar arañazos en la piel. Aunque la inmovilización de fijación externa es robusta y confiable^14,15, percutáneo Kirschner pistas de alambre puede aumentar el riesgo de infección¹⁶. En nuestra propia experiencia, el uso de la técnica de fijación externa puede reducir la actividad diaria de las ratas debido a un aumento en el comportamiento de lamer condicionado.

Alternativamente, Trudel et al. describieron un modelo bien aceptado de contractura articular en la articulación de la rodilla de rata basado en una fijación interna quirúrgica¹⁷ (este método fue modificado del utilizado por Evans y sus colegas^18). En particular, este método destaca la importancia de utilizar una técnica de mini-incisión para minimizar las heridas quirúrgicas. El desarrollo eficiente de la contractura conjunta ha sido demostrado en este modelo^19. Sin embargo, el protocolo sobre cómo realizar una disección mínima para exponer la superficie ósea todavía no está claro²⁰. Además, la posición precisa donde el tornillo está perforando no se entiende completamente. La implantación de la fijación interna a través de una vía subcutánea o submuscular sigue siendo controvertida²¹. Para resolver estos problemas, hemos modificado este método mediante la inclusión de un modus de separación músculo-brecha adecuado, que permite una exposición mini-invasiva de la superficie ósea y la colocación de la implantación a través de un canal submuscular. Este protocolo condujo a una rápida rehabilitación postoperatoria en ratas después de la cirugía. Los animales desarrollaron un rango limitado de movimiento articular después de la inmovilización articular, que fue consistente con los cambios morfológicos de adhesión capsular obtenidos del análisis histológico. También describimos una posible ubicación exacta de los tornillos perforados como se confirma mediante el análisis de rayos X o el análisis de micro-CT. Por lo tanto, este estudio tenía como objetivo describir en detalle una técnica mínima-invasiva en un modelo de contractura articular de rodilla que fue establecida por un modus de separación músculo-brecha combinado con un método de mini-incisión. Creemos que las técnicas mínimamente invasivas pueden reducir el trauma animal e imitar eficazmente el proceso patológico de la contractura de flexión articular.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Tercer Hospital Afiliado del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Sun Yat-sen (número de permiso: 02-165-01). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de ARRIVE.

1. Preparación preoperatoria

NOTA: La Figura 1 muestra el diseño del procedimiento quirúrgico.

1. Inmovilizar rígidamente la articulación de la rodilla con una placa de plástico y dos tornillos metálicos a una flexión de aproximadamente 135o.
   NOTA: Realice la cirugía en el fémur proximal y la tibia distal sin violar el componente articular.
2. Preparar materiales e instrumentos para la fijación interna.
   1. Construir placas de plástico de polipropileno de grado médico cortando una jeringa de 5 ml (Figura2a) utilizando una tijera quirúrgica para adaptarse a las siguientes dimensiones: longitud, 25 mm; ancho, 10 mm; espesor, 1 mm (Figura2b). Suaviza el perímetro de la placa con un bisturí verticalmente. Enjuague el plato con solución salina estéril para lavar los desechos tres veces.
      1. Esterilice con 75% de etanol durante 4 h seguido de irradiar con luz ultravioleta durante 3 h.
   2. Agujeros de preperforación en la placa de plástico: Preparar un taladro eléctrico de baja velocidad de mano con una velocidad de aproximadamente 0-4000 rpm (Figura2c). Taladre dos orificios en ambos extremos de la placa, los diámetros son de 1 mm y 0,9 mm, respectivamente (Figura2d). Coincide con ambos extremos de la placa con tornillos de acero M 1,4 mm x 8 mm y M 1,2 mm x 6 mm, respectivamente (Figura2e).
      1. Limpie con 75% de etanol y esterilizar con luz UV durante 3 horas antes de su uso.
3. Preparar instrumentos quirúrgicos: 1 abrazadera hemostática de tipo Mosquito recta, 1 fórceps curvados lisos, 2 retractores de párpados, 1 porta agujas, 1 fórceps de tejido, 1 tijera de sutura, 1 tijera de micro tejido y 1 bisturí (Figura2f). Esterilice los instrumentos quirúrgicos autoclavendo a 121,3 oC durante 20 minutos y secarlos.
4. Animales experimentales
   1. Utilice ratas macho Sprague-Dawley (o Wistar) de grado específico libre de patógenos (SPF) con un peso de 250 a 350 g en el experimento.
      NOTA: Elija ratas hembra o macho para el experimento.
   2. Coloque las ratas en jaulas y guárdelas en una sala de laboratorio controlada por ciclo oscuro de 12 h/12 h. Proporcionar alimentos y agua adecuados.

2. Cirugía

1. Ajuste la temperatura. Coloque una almohadilla de calentamiento en una plataforma quirúrgica en un quirófano termostático.
2. Anestesia y preparación de la piel
   1. Pesar la rata con una báscula electrónica y un registro.
   2. Restringir la rata y realizar una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (30 mg/kg) a la anestesia inducida. Evaluación de que el animal está suficientemente anestesiado utilizando el pellizco de los dedos del dedo del tiempo²². Administrar los ojos con lubricante para proteger la córnea de secarse durante la cirugía.
   3. Afeitar el cuerpo inferior de la rata incluyendo las dos extremidades traseras con una cortadora eléctrica y desinfectar con una tintura de yodo de povidona dos veces y 75% etanol tres veces.
   4. Coloque la rata lateralmente y cúbrala con la cortina quirúrgica exponiendo una pata trasera lateral y cadera.
   5. Desinfectar el área quirúrgica de nuevo con yodo povidona.
3. Inmovilizar la articulación de la rodilla con fijación interna utilizando una técnica mini-invasiva.
   NOTA: Mantenga la incisión bien húmeda con solución salina estéril durante la operación. La cirugía generalmente requiere dos cirujanos.
   1. Marque la dirección de la incisión cutánea. En el extremo distal del fémur trocánter mayor, dibuje una línea a lo largo de la proyección de la superficie corporal de la brecha muscular entre el vastus lateralis y el bíceps femoris (Figura3a). Incise la piel de la epidermis a lo largo de la línea de dibujo aproximadamente 1,5 cm (Figura 3b).
   2. Diseccionar con sorditancia la brecha muscular entre vastus lateralis y bíceps femoris con un fórceps tisular hasta que el eje femoral se exponga aproximadamente 1 cm de longitud (Figura3c). Utilice el retractor para facilitar la separación continua de la brecha muscular.
   3. Incise la piel de la epidermis aproximadamente 1 cm a lo largo de la proyección de la superficie corporal de la brecha muscular entre el tibialis anterior y el fibularis longus en la extremidad inferior distal (Figura3d). Diseccionar con rodeos la brecha muscular hasta que la tibia se exponga aproximadamente 1 cm de longitud (Figura3e).
   4. Separe los tejidos blandos por el retractor y los fórceps lisos, mantenga perpendicular y taladre un agujero de 1,0 mm de diámetro en el eje femoral a una velocidad de 1.500 rpm utilizando un taladro eléctrico (Figura3f). La posición de perforación adecuada es aproximadamente 8 mm por debajo del borde inferior del trocánter mayor. Presione rápidamente la herida para detener el sangrado.
      NOTA: El diámetro de perforación adecuado puede evitar fracturas intraoperatorias.
   5. Taladre un agujero de 0,9 mm de diámetro en la tibia aproximadamente 4 mm por debajo del borde de la fusión tibiofibular (Figura4a). Realizar la perforación cuidadosamente para evitar el aplastamiento de los músculos o tendones.
   6. Utilice la abrazadera hemostática recta Mosquito-Type para formar un curso submuscular desde el agujero de la tibia hasta el agujero del fémur. El túnel submuscular pasa por debajo del gastrocnemius en el extremo de la tibia y por encima del glúteo medius,por debajo del bíceps femoris en el extremo del fémur.
   7. Utilice un tornillo de acero M de 1,4 mm x 8 mm para fijar un extremo de la placa de plástico (con el orificio de 1,0 mm de diámetro) en el fémur proximal (Figura4b). Utilice un tornillo de acero M 1,2 mm x 6 mm para fijar otro extremo de la placa de plástico (con el orificio de 0,9 mm de diámetro) en la tibia distal (Figura4c). Asegurar la articulación de la rodilla sin deformidad varus.
4. Cerrar la herida: Sutura la miofascia, las fascias profundas y el tejido subcutáneo usando 4-0 suturas absorbibles (Figura4d). Cierre la piel con suturas de poliamida (Figura 4f).

3. Gestión postoperatoria

1. Aplicar analgesia postoperatoria mediante inyección subcutánea de buprenorfina (0,03 mg/ml) a 0,05 mg/kg . Añadir 5 mg/ml de neomicina en agua potable durante 5 días después de la cirugía.
2. Inyectar la mezcla de analgesia (Buprenorfina y Carprofeno) respectivamente a 0,05 mg/kg y 5 mg/kg por vía subcutánea dos veces al día durante al menos 72 horas después de la operación.
3. Compruebe si la extremidad posterior tenía sobreedema en caso de lesión vascular. Se aseguró de que las ratas puedan caminar normalmente en caso de lesión nerviosa durante la cirugía.

4. Examen postoperatorio

1. Observar la curación de la incisión quirúrgica y examinar físicamente la articulación de la rodilla para evaluar los primeros signos de infección cada dos días postoperatorio. Compruebe el grado de hinchazón del tobillo y la articulación metacarpofalángica en caso de edema continuo.
   NOTA: La infección postoperatoria temprana puede causar exudado de la herida, hinchazón de las piernas y retraso en la cicatrización de la herida.
2. Realice imágenes de rayos X de la extremidad posterior para asegurarse de que los tornillos colocados correctamente en el primer día postoperatorio.
   NOTA: Un análisis de escaneo Micro-CT es otra opción alternativa para mostrar la ubicación adecuada y la dirección de los tornillos de acero.
3. Mida el rango pasivo de movimiento (ROM) para evaluar el desarrollo de la contractura. Tome una medida ROM de la articulación de la rodilla en diferentes cohortes de tiempo postoperatoriamente como se describió anteriormente²⁰.
   1. En resumen, eutanasia las ratas y la piel de las extremidades posteriores. Retire el inmovilizador y mida el ángulo de la articulación de la rodilla utilizando un artrómetro mecánico a dos pares de torsión (667 o 1.060 g/cm)²³.
   2. Calcular la ROM como resultado de la contractura total, la contractura miogénica y la contractura artrogénica por separado sobre la base de los objetivos de investigación²⁴.
      NOTA: Establezca diferentes cohortes de tiempo (es decir, 1, 2, 4, 8, 16 y 32 semanas) de acuerdo con los objetivos de investigación. La articulación contralateral de la rodilla (no operativa o atravesada) puede servir como control².
4. Análisis histológico de las cápsulas posteriores de la articulación de la rodilla.
   1. Prepare los tejidos articulares. Diseccionar el tejido articular de la rodilla y fijarlo con 4% paraformaldehído. Descalficar e incrustar en parafina como se informó anteriormente²⁵. Cortar las secciones (5 m) en el nivel medio midcondylar en el plano sagital.
      NOTA: Elija realizar diferentes tinción evaluantes, incluyendo HE, aldehído-fuchsin-Masson Goldner (AFMG), Elastica-Masson, o la tinción inmunohistoquímica para el estudio histológico en la cápsula articular basado en los objetivos de estudio^{15, 26}.
   2. Observar cambios histomorfométricos en las cápsulas posteriores de la articulación de la rodilla. Fotografíe la región posterior de la articulación de la rodilla. Observar la deposición fibrosa y los cambios de adhesión entrela unión diafísica-sinovium y el menisco 6.
      NOTA: Los cambios patológicos de la cápsula articular se consideran un factor patógeno para la contractura articular de la rodilla. Mida la longitud, el grosor y las áreas capsulares de la cápsula posterior como se describió anteriormente de acuerdo con el contenido de la investigación²⁷.

Resultados

Observamos que las ratas recibidas cirugía mínimamente invasiva pueden volver a la dieta regular sólo un día postoperatorio. En particular, la incisión quirúrgica ha cicatrizado sin exudado (Figura5a). La hinchazón del tobillo y las articulaciones metacarpofalángicas en la extremidad posterior operativa ha desaparecido casi por completo dos días después de la operación (Figura5b)en comparación con el lado contralatera...

Discusión

Este estudio tenía como objetivo dilucidar un método de inmovilización de la articulación de rodilla paso a paso utilizando una técnica mini-invasiva que permite una rápida rehabilitación postoperatoria en animales después de la cirugía. Convencionalmente, se cree que el enfoque de separación músculo-brecha es una técnica mínimamente invasiva en la cirugía ortopédica. Como era de esperar, encontramos que las ratas pueden volver a una dieta normal y actividades sólo un día postoperatorio, que fue consiste...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anerdian	Shanghai Likang Ltd.	310173	antibacterial
Buprenorphine	Shanghai Shyndec Pharmaceutical Ltd.	/	analgesia
Carprofen	MCE	HY-B1227	analgesia
Cross screwdriver	STANLEY	PH0*125mm	tighten the screws
Electric drill	WEGO	185	drill hole(with stainless steel drill 0.9mm;1.0mm)
Microsurgical instruments	RWD	/	Orthopaedic surgical instruments for animals
Neomycin	Sigma	N6386	antibacterial
Sodium pentobarbital	Sigma	P3761	anaesthetize
Stainless Steel screws	WEGO	m1.4*8; m1.2*6	screw(part of internal fixation)
Syringe	WEGO	3151474	use for plastic plate(part of internal fixation)
μ-CT	ALOKA	Latheta LCT-200	in vivo CT scan