Мини-инвазивных внутренней фиксации Техника для изучения иммобилизации индуцированной колено Flexion Контрактура у крыс

Резюме

Здесь мы представляем протокол для описания минимально инвазивной техники для обездвижить коленного сустава в модели крысы. Этот воспроизводимый протокол, основываясь на методе разделения мышц и навыке мини-разреза, подходит для изучения базового молекулярного механизма приобретенного совместного контрактуры.

Аннотация

Совместная контрактура, в результате длительной совместной иммобилизации, является распространенным осложнением в ортопедии. В настоящее время использование внутренней фиксации для ограничения подвижности коленного сустава является широко признанной моделью для создания экспериментальной контрактуры. Тем не менее, имплантация приложение неизбежно вызовет хирургическую травму животных. Стремясь разработать менее инвазивный подход, мы объединили мышечный разрыв разделения modus с ранее сообщалось мини-разрез мастерство во время хирургической процедуры: Два мини разрезы кожи были сделаны на боковой бедра и ноги, а затем выполнения мышечного разрыва разделения, чтобы разоблачить поверхность кости. Крыса коленного сустава постепенно обездвижены предварительно построенной внутренней фиксации примерно на 135 "колено сгибания без вмешательства основных нервов или кровеносных сосудов. Как и ожидалось, эта простая методика позволяет быстро послеоперационную реабилитацию у животных. Правильное положение внутренней фиксации было подтверждено рентгеновским или микро-КТ-анализом. Диапазон движения был значительно ограничен в обездвижении коленного сустава, чем наблюдается в контралатеральном коленном суставе, демонстрируя эффективность этой модели. Кроме того, гистологический анализ выявил развитие волокнистых осаждений и сливок в задней-superior капсулы коленного сустава с течением времени. Таким образом, эта мини-инвазивная модель может быть подходящей для имитации развития обездвиженного коленного сустава.

Введение

Совместные контрактуры определяются как ограничение в пассивном диапазоне движения (ROM) диартродиальной стык1,². Текущие методы лечения, направленные на профилактику и лечение совместного контрактуры добились определенного успеха^3,4. Тем не менее, основной молекулярный механизм приобретенного совместного контрактура остается в значительной степени неизвестным⁵. Этиология совместных контрактур в различных социальных сообществах очень разнообразна и включает всебя генетические факторы, посттравматические состояния, хронические заболевания и длительную неподвижность 6. Широко признано, что неподвижность является важнейшим вопросом в разработке приобретенных совместных контрактов⁷. Люди, которые страдают от основных совместных контрактуры может в конечном итоге привести к физической инвалидности⁸. Таким образом, стабильная и воспроизводимая модель животного необходима для исследования потенциальных патофизиологических механизмов приобретенного совместного контрактуры.

В настоящее время построен иммобилизации индуцированных коленных совместных моделей контрактуры в основном достигается за счет использования неинвазивных гипсовые слепки, внешние фиксации, и внутренние фиксации. Watanabe и др. сообщили о возможности использования гипсовой литой иммобилизации на крысиных коленных суставах⁹. Надев специальную куртку, одна сторона нижней конечности сустава крысы обездвижен литые. Крыса коленного сустава может оставаться полностью согнуты без каких-либо хирургических травм^10,11. Однако, как тазобедренного и голеностопного сустава движения также зависит от этой формы иммобилизации, которые могут увеличить степень атрофии мышц в четырехглавой феморис или гастрокнемия¹². Кроме того, отеки и скопления задних конечностей следует избегать, заменяя гипс в установленные временные моменты, что может повлиять на непрерывность неподвижности. Другой принятый метод для создания коленного совместного контрактуры модели является использование внешней хирургической фиксации. Nagai et al. объединили проволоку Киршнера и стальную проволоку в внешний фиксатор, который обездвижил коленный сустав примерно до 140 градусов сгибания^13. В этом методе смола используется для покрытия поверхности, чтобы предотвратить царапины кожи. Хотя внешняя фиксация иммобилизации является надежным и надежным^14,15, percutaneous Киршнер проволоки контактный треков может увеличить риск заражения¹⁶. По нашему собственному опыту, использование внешней техники фиксации может снизить ежедневную активность крыс за счет увеличения условного лизать поведение.

Кроме того, Trudel et al. описал хорошо принятую модель совместного контрактуры в коленном суставе крысы на основе хирургической внутренней фиксации¹⁷ (этот метод был изменен с той, которая использовалась Эвансом и коллегами¹⁸). Примечательно, что этот метод подчеркивает важность использования метода мини-разреза, чтобы свести к минимуму хирургические раны. Эффективное развитие совместной контрактной работы доказано в этой модели^19. Тем не менее, протокол о том, как выполнить минимальное вскрытие подвергать поверхность кости до сих пор неясно,²⁰. Кроме того, точное положение, где винт бурения не до конца понял. Имплантация внутренней фиксации через подкожный или субмышечный путь по-прежнему спорным²¹. Чтобы решить эти проблемы, мы модифицировали этот метод, включив соответствующий метод разделения мышечного разрыва, который позволяет мини-инвазивного воздействия костной поверхности и размещения имплантации через субмышечный канал. Этот протокол привел к быстрой послеоперационной реабилитации у крыс после операции. После совместной иммобилизации у животных развился ограниченный диапазон движения суставов, что соответствовало морфологическим изменениям капсульной адгезии, полученным в результате гистологического анализа. Мы также описываем точное возможное расположение пробуренных винтов, что подтверждается рентгеновским анализом или микро-КТ-анализом. Таким образом, это исследование было направлено на подробное описание минимально-инвазивной техники в коленном суставе контрактуры модели, которая была создана мышцы разрыв разделения modus в сочетании с мини-разрез метод. Мы считаем, что минимально инвазивные методы могут как уменьшить травмы животных, так и эффективно имитировать патологический процесс контрактуры сгибания суставов.

протокол

Все процедуры были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Третьей аффилированной больницесунского университета Сунь Ят-сен институционального ухода за животными и комитета по уходу за животными (номер разрешения: 02-165-01). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами ARRIVE.

1. Предоперационная подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показана конструкция хирургической процедуры.

1. Строго обездвижить коленный сустав пластиковой пластиной и двумя металлическими винтами при сгибании примерно на 135 градусов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните операцию на проксимальной бедренной кости и дистальной голени, не нарушая компонент ас.
2. Подготовка материалов и инструментов для внутренней фиксации.
   1. Построить полипропиленовые пластиковые пластины медицинского класса, разрезая 5 мл шприца(рисунок 2a)с помощью хирургических ножниц, чтобы соответствовать следующим размерам: длина, 25 мм; ширина, 10 мм; толщина, 1 мм(рисунок 2b). Гладкая периметр пластины скальпелем вертикально. Промыть тарелку стерильным сольным раствором, чтобы смыть мусор в три раза.
      1. Стерилизовать с 75% этанола для 4 ч следуют облучения с ультрафиолетовым светом для 3 ч.
   2. Предварительное бурение отверстий в пластиковой пластине: Подготовка ручной низкоскоростной электрической дрель со скоростью около 0-4000 об/мин(рисунок 2c). Просверлите два отверстия на обоих концах пластины, диаметры 1 мм и 0,9 мм, соответственно(рисунок 2d). Совпадение обоих концов пластины с M 1,4 мм х 8 мм и М 1,2 мм х 6 мм стальные винты, соответственно(рисунок 2e).
      1. Протрите 75% этанола и стерилизовать с ультрафиолетовым светом в течение 3 ч перед использованием.
3. Подготовка хирургических инструментов: 1 прямой Комаров типа гемостатический зажим, 1 гладкий изогнутые щипцы, 2 веки ретракторы, 1 держатель иглы, 1 ткань щипцы, 1 шов ножницами, 1 микро ткани ножницами и 1 скальпель (Рисунок 2f). Стерилизовать хирургические инструменты путем автоклавирования при 121,3 градуса по Цельсию в течение 20 мин и сушки.
4. Экспериментальные животные
   1. Используйте специфический патоген Бесплатный (SPF) класс скелетно зрелых самцов Sprague-Dawley (или Wistar) крыс, весом от 250 до 350 г в эксперименте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите для эксперимента крысы женского или мужского пола.
   2. Поместите крыс в клетки и держать в 12 ч свет / 12 ч темного цикла контролируемой лаборатории. Обеспечить достаточное питание и воду.

2. Хирургия

1. Отрегулируйте температуру. Поместите согревающую площадку на хирургическую платформу в термостатическую операционную.
2. Анестезия и подготовка кожи
   1. Взвесьте крысу с электронной шкалой и записью.
   2. Сдержать крысу и выполнить интраперитонеальную инъекцию пентобарбитала натрия (30 мг/кг) для индуцированной анестезии. Оценка того, что животное достаточно обезвлечивание с помощью ног щепотку²². Администрирование глаз спомощьей, чтобы защитить роговицу от высыхания во время операции.
   3. Бритье нижней части тела крысы, включая две задние конечности с электрическим клипера и дезинфицировать с настойкой из йода повид два раза и 75% этанола в три раза.
   4. Поместите крысы боковой, и накройте хирургическим драпировка подвергая одну сторону заднюю ногу и бедро.
   5. Снова дезинфицировать хирургическую область с помощью повидона йода.
3. Обездвижить коленный сустав с помощью внутренней фиксации с помощью мини-инвазивной техники.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите разрез правильно влажным с стерильным сольнием во время операции. Операция обычно требует двух хирургов.
   1. Отметьте направление разреза кожи. На дистальном конце бедренной кости больше trochanter, провести линию вдоль поверхности тела проекции мышечного разрыва между vastus lateralis и бицепс фемориса (Рисунок 3a). Нарезка кожи эпидермис вдоль чертежной линии приблизительно 1,5 см(рисунок 3b).
   2. Грубо вскрыть мышечный разрыв между vastus lateralis и бицепс фемориса с ткани щипцы до бедренной вал подвергается примерно 1 см в длину (рисунок3c). Используйте ретрактор для облегчения непрерывного разделения мышечного разрыва.
   3. Резка эпидермиса кожи приблизительно 1 см вдоль поверхности тела проекции мышечного зазора между tibialis передней и fibularis longus на дистальной нижней конечности (Рисунок 3d). Грубо вскрыть мышечный разрыв, пока голени подвергается примерно 1 см в длину(рисунок 3e).
   4. Разделите мягкие ткани от втягивающего втягивания и гладких щипц, держите перпендикулярно и просверлите одно отверстие диаметром 1,0 мм в бедренную вал со скоростью 1500 об/мин с помощью электрической дрель (Рисунок 3f). Надлежащее положение бурения приблизительно 8 мм ниже нижнего края большого трохантера. Быстро нажмите рану, чтобы остановить кровотечение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильный диаметр бурения может избежать внутриоперационных переломов.
   5. Просверлите отверстие диаметром 0,9 мм в голени на 4 мм ниже края гильбу цифлита(рисунок 4а). Выполните бурение тщательно, чтобы предотвратить дробление мышц или сухожилий.
   6. Используйте прямой комаров типа гемостатический зажим, чтобы сформировать субмышечный курс от отверстия голени до бедренной кости отверстие. Субмышечный туннель проходит ниже гастрокнемия в конце голени и выше ягодицы medius, ниже бицепс бедренной кости в конце бедренной кости.
   7. Используйте один M 1,4 мм х 8 мм стальной винт для обеспечения одного конца пластиковой пластины (с отверстием диаметром 1,0 мм) в проксимальной бедренной кости(рисунок 4b). Используйте один M 1,2 мм х 6 мм стальной винт для обеспечения другого конца пластиковой пластины (с отверстием диаметром 0,9 мм) в дистальной голени(рисунок 4c). Убедитесь, что коленный сустав без деформации varus.
4. Закрыть рану: Шов миофасции, глубокие фасции, и подкожной ткани с помощью 4-0 поглощаемых швов(Рисунок 4d). Закройте кожу с полямидными швами(рисунок 4f).

3. Послеоперационное управление

1. Применение послеоперационной обезболивания путем подкожной инъекции бупренорфина (0,03 мг/мл) при 0,05 мг/кг. Добавить 5 мг/мл неомицина в питьевую воду в течение 5 дней после операции.
2. Вводят обезболиваальную смесь (бупренорфин и карпрофен) соответственно на 0,05 мг/кг и 5 мг/кг подкожно два раза в день в течение по крайней мере 72 часов после операции.
3. Проверьте, была ли у задней конечности чрезмерное отек исчерщение в случае сосудистой травмы. Убедились, что крысы могут нормально ходить в случае травмы нерва во время операции.

4. Послеоперационное обследование

1. Наблюдайте заhealing хирургического разреза и физически исследуете коленный сустав для оценки ранних признаков инфекции через день после операции. Проверьте степень отеков голеностопного сустава и метакарпофалангеального сустава в случае непрерывного отека.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ранняя послеоперационная инфекция может вызвать высыхания ран, отек ног, и задержки заживления ран.
2. Выполните рентгеновское изображение задней конечности, чтобы убедиться, что правильно размещены винты на первый послеоперационный день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ микро-КТ является еще одним альтернативным вариантом для отображения правильного местоположения и направления стальных винтов.
3. Измерьте пассивный диапазон движения (ROM) для оценки развития контрактуры. Возьмите коленного сустава ROM измерения в разное время когорты послеоперационно, как описано ранее²⁰.
   1. Короче говоря, эвтаназии крыс и кожи задних конечностей. Удалить иммобилайзер и измерить угол коленного сустава с помощью механического артрометра при двух крутящего момента (667 или 1060 г/см)²³.
   2. Рассчитайте ПЗУ в результате общего контрактура, миногенной контрактуры и артрогенного контракта отдельно на основе целей расследования²⁴.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установите различные когорты времени (т.е., 1, 2, 4, 8, 16 и 32 недели) в соответствии с целями исследования. Контралатеральный коленный сустав (неоперативный или фиктивный) может служить в качестве контрольного².
4. Гистологический анализ задней капсулы коленного сустава.
   1. Приготовьте суставные ткани. Вскрыть ткани коленного сустава и исправить его с 4% параформальдегида. Decalcify и вставлять его в парафин, как сообщалось ранее²⁵. Вырезать разделы (5 мкм) на медиальном уровне мидкондиляров в сагиттальной плоскости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите для выполнения различных оценки окрашивания в том числе он, альдегид-фуксин-Массон Голднер (AFMG), Elastica-Masson, или иммуногистохимии окрашивания для гистологического исследования в совместной капсулы на основе вашего исследования целей^{15, 26}.
   2. Наблюдайте за гистоморфометрическими изменениями в задней капсуле коленного сустава. Фотография задней области коленного сустава. Наблюдайте волокнистые осаждения и изменения адгезии между соединением диафиз-синовиума и мениска⁶.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Патологические изменения совместной капсулы считаются патогенным фактором для контрактуры суставов коленного сустава. Измерьте длину, толщину, и капсульные области задней капсулы, как ранее описано в соответствии с содержанием исследований²⁷.

Результаты

Мы заметили, что крысы получили минимально инвазивной хирургии может вернуться к регулярной диете только один день после операции. В частности, хирургический разрез получил шрамы без эксцессов(рисунок 5а). Отек голеностопного сустава и метакарпофалан?...

Обсуждение

Это исследование направлено на разъяснение шаг за шагом колено сустава иммобилизации метод с использованием мини-инвазивной техники, которая позволяет быстропослеоперационной реабилитации у животных после операции. Условно, мышечный разрыв разделения подход считается минимально и?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anerdian	Shanghai Likang Ltd.	310173	antibacterial
Buprenorphine	Shanghai Shyndec Pharmaceutical Ltd.	/	analgesia
Carprofen	MCE	HY-B1227	analgesia
Cross screwdriver	STANLEY	PH0*125mm	tighten the screws
Electric drill	WEGO	185	drill hole(with stainless steel drill 0.9mm;1.0mm)
Microsurgical instruments	RWD	/	Orthopaedic surgical instruments for animals
Neomycin	Sigma	N6386	antibacterial
Sodium pentobarbital	Sigma	P3761	anaesthetize
Stainless Steel screws	WEGO	m1.4*8; m1.2*6	screw(part of internal fixation)
Syringe	WEGO	3151474	use for plastic plate(part of internal fixation)
μ-CT	ALOKA	Latheta LCT-200	in vivo CT scan