Una tecnica di fissazione interna mini-invasiva per studiare la contrattura di flessione del ginocchio indotta dall'immobilizzazione nei ratti

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per descrivere una tecnica minimamente invasiva per l'immobilizzazione dell'articolazione del ginocchio in un modello di ratto. Questo protocollo riproducibile, basato sul modus di separazione muscolo-gap e sull'abilità mini-incisione, è adatto per studiare il meccanismo molecolare sottostante della contrattura articolare acquisita.

Abstract

La contrattura congiunta, risultante da una prolungata immobilizzazione articolare, è una complicazione comune nell'ortopedia. Attualmente, l'utilizzo di una fissazione interna per limitare la mobilità delle articolazioni del ginocchio è un modello ampiamente accettato per generare contrattura sperimentale. Tuttavia, l'applicazione di impianto causerà inevitabilmente traumi chirurgici per gli animali. Con l'obiettivo di sviluppare un approccio meno invasivo, abbiamo combinato un modus di separazione muscolo-gap con una mini-incisione segnalata in precedenza durante la procedura chirurgica: due mini incisioni cutanee sono state fatte sulla coscia laterale e sulla gamba, seguite dall'esecuzione di muscolo-gap separazione per esporre la superficie ossea. L'articolazione del ginocchio del ratto è stata gradualmente immobilizzata da una fissazione interna precostruita a circa 135 gradi di flessione del ginocchio senza interferire i nervi essenziali o i vasi sanguigni. Come previsto, questa semplice tecnica consente una rapida riabilitazione postoperatoria negli animali. La corretta posizione della fissazione interna è stata confermata da un'analisi di scansione a raggi X o micro-CT. La gamma di movimento è stata significativamente limitata nell'articolazione del ginocchio immobilizzata rispetto a quella osservata nell'articolazione del ginocchio contralaterale che dimostra l'efficacia di questo modello. Inoltre, l'analisi istologica ha rivelato lo sviluppo della deposizione fibrosa e dell'adesione nella capsula dell'articolazione del ginocchio superiore posteriore nel tempo. Così, questo modello mini-invasivo può essere adatto per imitare lo sviluppo di contrattura articolazione ginocchiina immobilizzata.

Introduzione

Le contratture congiunte sono definite come una restrizione nella gamma passiva di movimento (ROM) di un giunto diartrodiale^1,2. Le attuali terapie volte a prevenire e trattare lacontrattura congiunta hanno ottenuto un certo successo 3,⁴. Tuttavia, il meccanismo molecolare sottostante della contrattura congiunta acquisita rimane in gran parte sconosciuto⁵. L'eziologia delle contratture congiunte in diverse comunità sociali è molto diversificata e comprende fattori genetici, stati post-traumatici, malattie croniche e immobilità prolungata⁶. È ampiamente accettato che l'immobilità è una questione critica nello sviluppo della contrattura congiunta acquisita⁷. Le persone che soffrono di importanti contratture congiunte possono in ultima analisi causare disabilità fisiche⁸. Pertanto, è necessario un modello animale stabile e riproducibile per studiare i potenziali meccanismi patofisiologici della contrattura congiunta acquisita.

I modelli di contrattura articolare dell'articolazione del ginocchio attualmente costruiti sono per lo più realizzati utilizzando calchi in gesso non invasivi, fissazioni esterne e fissazioni interne. Watanabe et al. ha riferito la possibilità di utilizzare l'immobilizzazione del gesso sulle articolazioni del ginocchio del ratto⁹. Indossando una giacca speciale, un lato dell'articolazione dell'arto inferiore del ratto è immobilizzato da un calco. L'articolazione del ginocchio del ratto può rimanere completamente flesso senza alcun trauma chirurgico^10,11. Tuttavia, entrambi i movimenti dell'articolazione dell'anca e della caviglia sono anche influenzati da questa forma di immobilizzazione, che può aumentare il grado di atrofia muscolare in quadricipiti femoris o gastrocnemius¹². Inoltre, l'edema e la congestione degli arti posteriori devono essere evitati sostituendo il cast in punti temporali prestabiliti, che possono influenzare la continuità dell'immobilità. Un altro metodo accettato per la creazione di un modello di contrattura articolare del ginocchio è l'utilizzo di fissazione chirurgica esterna. Il filo di Kirschner e il filo d'acciaio combinavano il filo Kirschner in un fissatore esterno, che immobilizzava l'articolazione del ginocchio a circa 140 gradi di flessione¹³. In questo metodo, una resina viene utilizzata per coprire la superficie per evitare graffi cutanei. Anche se l'immobilizzazione della fissazione esterna è robusta e affidabile¹⁴,^15,tracce percutanee del filo Kirschner possono aumentare il rischio di infezione¹⁶. Nella nostra esperienza, utilizzando la tecnica di fissazione esterna può ridurre l'attività quotidiana dei ratti a causa di un aumento del comportamento leccare condizionato.

In alternativa, Trudel e altri hanno descritto un modello ben accettato di contrattura articolare nell'articolazione del ginocchio del ratto basato su una fissazione interna chirurgica¹⁷ (questo metodo è stato modificato rispetto a quello utilizzato da Evans e colleghi¹⁸). In particolare, questo metodo sottolinea l'importanza di utilizzare una tecnica di mini-incisione per ridurre al minimo le ferite chirurgiche. L'efficiente sviluppo della contrattura congiunta è stato dimostrato nel modello^19. Tuttavia, il protocollo su come eseguire una dissezione minima per esporre la superficie ossea non è ancora chiaro²⁰. Inoltre, la posizione precisa in cui la vite è foratura non è completamente compresa. L'impianto della fissazione interna attraverso un modo sottocutaneo o submuscolare è ancora controverso²¹. Per risolvere questi problemi, abbiamo modificato questo metodo includendo un appropriato modus di separazione muscolo-gap, che consente un'esposizione mini-invasiva della superficie ossea e il posizionamento dell'impianto attraverso un canale submuscolare. Questo protocollo ha portato a una rapida riabilitazione postoperatoria nei ratti dopo l'intervento chirurgico. Gli animali hanno sviluppato una gamma limitata di movimento articolare dopo l'immobilizzazione articolare, che era coerente con i cambiamenti morfologici dell'adesione capsulare ottenuti dall'analisi istologica. Descriviamo anche un'esatta possibile posizione delle viti trapanate come confermato dall'analisi a raggi X o dall'analisi micro-CT. Così, questo studio mirava a descrivere in dettaglio una tecnica minima-invasiva in un modello di contrattura articolare del ginocchio che è stato stabilito da un modus di separazione muscolo-gap combinato con un metodo mini-incisione. Crediamo che le tecniche minimamente invasive possano ridurre il trauma animale e imitare efficacemente il processo patologico della contrattura di flessione articolare.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal Terzo Ospedale Affiliato di Sun Yat-sen University institutional animali care and use committee (numero di autorizzazione: 02-165-01). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati secondo le linee guida DI ARRIVE.

1. Preparazione preoperatoria

NOTA: La figura 1 mostra la progettazione della procedura chirurgica.

1. Immobilizzarigidamente l'articolazione del ginocchio con una piastra di plastica e due viti metalliche a circa 135 gradi di flessione.
   NOTA: Eseguire l'intervento chirurgico al femore prossimale e la tibia distale senza violare il componente articolare.
2. Preparare materiali e strumenti per la fissazione interna.
   1. Costruire una placche di plastica in polipropilene di grado medico tagliando una siringa da 5 mL (Figura 2a) utilizzando una forbice chirurgica per adattarsi alle seguenti dimensioni: lunghezza, 25 mm; larghezza, 10 mm; spessore, 1 mm (Figura 2b). Ammorbidire il perimetro della piastra con un bisturi verticalmente. Sciacquare la piastra con salina sterile per lavare via i detriti di tre volte.
      1. Sterilizzare con 75% etanolo per 4 h seguito da irradiazione con luce ultravioletta per 3 h.
   2. Pre-fori nella piastra di plastica: Preparare un trapano elettrico a bassa velocità portatile con una velocità di circa 0-4000 rpm (Figura 2c). Foratura due fori a entrambe le estremità della piastra, diametri sono 1 mm e 0,9 mm, rispettivamente (Figura 2d). Abbinare entrambe le estremità della piastra con viti in acciaio M 1,4 mm x 8 mm e M 1,2 mm x 6 mm, rispettivamente (Figura 2e).
      1. Pulire con 75% etanolo e sterilizzare con luce UV per 3 h prima dell'uso.
3. Preparare strumenti chirurgici: 1 morsetto emostatico dritto tipo mosquito, 1 pinza curva liscia, 1 retrattore palpebrale, 1 portaa ago,1 pinza tissutale, 1 forbice di sutura, 1 forbice micro tessuto e 1 bisturi (Figura2f). Sterilizzare gli strumenti chirurgici autoclaving a 121.3 S per 20 min e l'essiccazione.
4. Animali sperimentali
   1. Utilizzare specifici ratti Sprague-Dawley (o Wistar) maschi secchi (o Wistar), del peso compreso tra 250 e 350 g nell'esperimento.
      NOTA: scegliere ratti maschi o femmine per l'esperimento.
   2. Mettere i ratti in gabbia e conservarli in una sala da laboratorio controllata dal ciclo scuro da 12 h. Fornire cibo e acqua adeguati.

2. Chirurgia

1. Regolare la temperatura. Posizionare una piastra di riscaldamento su una piattaforma chirurgica in una sala operatoria termostatica.
2. Anestesia e preparazione della pelle
   1. Pesare il ratto con una bilancia elettronica e registrare.
   2. Restringere il ratto ed eseguire un'iniezione intraperitale di pentobarbital di sodio (30 mg/kg) per l'anestesia indotta. Valutazione che l'animale è sufficientemente anestesizzato utilizzando il pizzico di dita²². Somministrare gli occhi con lubrificante per proteggere la cornea dall'essiccazione durante l'intervento chirurgico.
   3. Rasare il corpo inferiore del ratto, compresi i due arti posteriori con un clipper elettrico e disinfettare con una tintura di iodio povidone due volte e 75% etanolo tre volte.
   4. Posizionare il ratto lateralmente, e coprire con il drappo chirurgico esponendo una gamba posteriore laterale e l'anca.
   5. Disinfettare nuovamente l'area chirurgica con iodio povidone.
3. Immobilizzare l'articolazione del ginocchio con fissazione interna utilizzando una tecnica mini-invasiva.
   NOTA: Mantenere l'incisione correttamente umida con salina sterile durante l'operazione. L'intervento chirurgico di solito richiede due chirurghi.
   1. Contrassegnare la direzione di incisione cutanea. All'estremità distale del femore maggiore trochanter, tracciare una linea lungo la proiezione della superficie del corpo del divario muscolare tra il vasto lateralis e bicipiti femoris (Figura 3a). Incitare la pelle dell'epidermide lungo la linea di disegno approssimativamente 1,5 cm (Figura 3b).
   2. Alta sezionata il divario muscolare tra vastus lateralis e bicipiti femoris con una forzati tissutale fino a quando l'albero femorale non viene esposto di circa 1 cm di lunghezza (Figura 3c). Utilizzare il retrattore per facilitare la separazione continua del gap muscolare.
   3. Incise la pelle dell'epidermide approssimativa di 1 cm lungo la proiezione della superficie del corpo del divario muscolare tra il tibialis anteriore e fibularis longus sull'estremità inferiore distale (Figura 3d). Contunta mente sezionare il divario muscolare fino a quando la tibia è esposta circa 1 cm di lunghezza (Figura 3e).
   4. Separare i tessuti molli dal retrattore e le pinze lisce, mantenere perpendicolare e praticare un foro di 1,0 mm di diametro nell'albero femorale ad una velocità di 1.500 rpm utilizzando un trapano elettrico (Figura 3f). La posizione di perforazione corretta è approssimativamente 8 mm sotto il bordo inferiore del trochanter maggiore. Premi rapidamente la ferita per smettere di sanguinare.
      NOTA: Un diametro corretto della perforazione può evitare fratture intraoperatorie.
   5. Forare un foro di 0,9 mm di diametro nella tibia approssimativamente 4 mm sotto il bordo della fusione tibiofibular (Figura 4a). Eseguire la perforazione con attenzione per evitare la frantumazione di muscoli o tendini.
   6. Utilizzare la pinza emostatica dritto Mosquito-Type per formare un corso submuscolare dal foro tibia al foro del femore. Il tunnel submuscolare passa sotto il gastrocnemio nell'estremità della tibia e sopra il gluteo medius, sotto i bicipiti femori nella fine del femore.
   7. Utilizzare una vite di acciaio M 1,4 mm x 8 mm per fissare un'estremità della piastra di plastica (con il foro di diametro 1,0 mm) nel femore prossimale (Figura 4b). Utilizzare una vite di acciaio M 1,2 mm x 6 mm per fissare un'altra estremità della piastra di plastica (con il foro di diametro 0,9 mm) nella tibia distale (Figura 4c). Assicurarsi l'articolazione del ginocchio senza deformità varus.
4. Chiudere la ferita: Suturare la miofascia, la fasciatura profonda e il tessuto sottocutaneo utilizzando suture assorbibili 4-0 (Figura 4d). Chiudere la pelle con suture polyamide (Figura 4f).

3. Gestione postoperatoria

1. Applicare l'analgesia postoperatoria attraverso l'iniezione sottocutanea di Buprenorphine (0,03 mg/mL) a 0,05 mg/kg . Aggiungere 5 mg/mL di neomicina in acqua potabile per 5 giorni dopo l'intervento chirurgico.
2. Iniettare la miscela di analgesia (Buprenorphine e Carprofen) rispettivamente a 0,05mg/kg e 5 mg/kg sottocutaneamente due volte al giorno per almeno 72 ore dopo l'operazione.
3. Controllare se l'arto posteriore aveva un esema in caso di lesioni vascolari. Fatto in modo che i ratti possono camminare normalmente in caso di lesioni nervose durante l'intervento chirurgico.

4. Esame postoperatorio

1. Osservare la guarigione dell'incisione chirurgica ed esaminare fisicamente l'articolazione del ginocchio per valutare i primi segni di infezione a giorni alterativi. Controllare il grado di gonfiore della caviglia e dell'articolazione metacarpophalangeale in caso di edema continuo.
   NOTA: L'infezione postoperatoria precoce può causare l'essuting della ferita, il gonfiore delle gambe e un ritardo nella guarigione delle ferite.
2. Eseguire l'imaging a raggi X dell'arto posteriore per assicurarsi che le viti siano posizionate correttamente il primo giorno postoperatorio.
   NOTA: Un'analisi di scansione Micro-CT è un'altra opzione alternativa per visualizzare la posizione corretta e la direzione delle viti in acciaio.
3. Misurare l'intervallo passivo di movimento (ROM) per valutare lo sviluppo della contrattura. Eseguire una misurazione della ROM articolare del ginocchio in tempi diversi postoperatori come descritto in precedenza²⁰.
   1. In breve, eutanasia i ratti e la pelle degli arti posteriori. Rimuovere l'immobilizzatore e misurare l'angolo dell'articolazione del ginocchio utilizzando un artrometro meccanico a due coppia (667 o 1.060 g/cm)²³.
   2. Calcolare separatamente la ROM in seguito alla contrattura totale, alla contrattura miogenica e alla contrattura artrogenica in base agli obiettivi dell'indagine²⁴.
      NOTA: Impostare coorti di tempo diverse (cioè 1, 2, 4, 8, 16 e 32 settimane) in base agli obiettivi della ricerca. L'articolazione del ginocchio contralaterale (non operativa o operata da finzione) può fungere da controllo².
4. Analisi istologica delle capsule dell'articolazione del ginocchio posteriore.
   1. Preparare i tessuti articolari. Dissezionare il tessuto articolare del ginocchio e fissarlo con 4% paraformaldeide. Decalcizzarlo e incorporarlo in paraffina come riportato in precedenza²⁵. Tagliare le sezioni (5 m) al livello mediale del midcondylar nel piano sagittale.
      NOTA: Scegliere di eseguire diverse caratteristiche di valutazione tra cui HE, aldehyde-fuchsin-Masson Goldner (AFMG), Elastica-Masson, o immunohistochimica colorazione per lo studio istologico nella capsula congiunta in base agli obiettivi dello studio^{15, 26}.
   2. Osservare i cambiamenti istomorfatrici nelle capsule dell'articolazione posteriore del ginocchio. Fotografare la regione posteriore dell'articolazione del ginocchio. Osservare la deposizione fibrosa e i cambiamenti di adesione tra la giunzione diafisi-sinovic e il menisco⁶.
      NOTA: I cambiamenti patologici della capsula articolare sono considerati un fattore patogeno per la contrattura articolare del ginocchio. Misurare la lunghezza, lo spessore e le aree capsulari della capsula posteriore come descritto in precedenza in base al contenuto di ricerca²⁷.

Risultati

Abbiamo osservato che i ratti hanno ricevuto un intervento chirurgico minimamente invasivo possono tornare alla dieta normale solo un giorno postoperatorio. In particolare, l'incisione chirurgica ha segnato senza esordare (Figura 5a). Il gonfiore della caviglia e delle articolazioni metacarpophalangeal nell'arto posteriore operativo è quasi del tutto scomparso due giorni postoperatori (Figura 5b) rispetto al lato contralaterale ...

Discussione

Questo studio mirava a chiarire un metodo di immobilizzazione dell'articolazione del ginocchio passo-passo utilizzando una tecnica mini-invasiva che consente una riabilitazione postoperatoria rapida negli animali dopo l'intervento chirurgico. Convenzionalmente, l'approccio di separazione muscolo-gap è pensato per essere una tecnica minimamente invasiva nella chirurgia ortopedica. Come previsto, abbiamo scoperto che i ratti possono tornare a una dieta normale e attività solo un giorno postoperatorio, che era coerente co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anerdian	Shanghai Likang Ltd.	310173	antibacterial
Buprenorphine	Shanghai Shyndec Pharmaceutical Ltd.	/	analgesia
Carprofen	MCE	HY-B1227	analgesia
Cross screwdriver	STANLEY	PH0*125mm	tighten the screws
Electric drill	WEGO	185	drill hole(with stainless steel drill 0.9mm;1.0mm)
Microsurgical instruments	RWD	/	Orthopaedic surgical instruments for animals
Neomycin	Sigma	N6386	antibacterial
Sodium pentobarbital	Sigma	P3761	anaesthetize
Stainless Steel screws	WEGO	m1.4*8; m1.2*6	screw(part of internal fixation)
Syringe	WEGO	3151474	use for plastic plate(part of internal fixation)
μ-CT	ALOKA	Latheta LCT-200	in vivo CT scan