쥐에서 고정 유도 무릎 굴곡 계약을 연구하기위한 미니 침략적 인 내부 고정 기술

요약

여기서, 우리는 쥐 모델에서 무릎 관절 고정에 대한 최소 침습 기술을 설명하는 프로토콜을 제시한다. 근육 갭 분리 modus 및 미니 절개 기술에 기초하는 이 재현 가능한 프로토콜은 취득한 합동 계약의 근본적인 분자 기계장치를 공부하기위해 적당합니다.

초록

장기간 관절 고정으로 인한 관절 계약은 정형 외과에서 일반적인 합병증입니다. 현재, 무릎 관절 이동성을 제한하기 위해 내부 고정을 활용하는 것은 실험 계약을 생성하는 널리 받아 들여지는 모델이다. 그러나, 이식 응용 프로그램은 필연적으로 동물에 외과 외상을 일으킬 것입니다. 덜 침습적 인 접근 방식을 개발하는 것을 목표로, 우리는 수술 절차 동안 이전에보고 된 미니 절개 기술과 근육 갭 분리 modus를 결합 : 두 개의 미니 피부 절개는 측면 허벅지와 다리에 만들어졌다, 근육 갭을 수행 한 다음 분리하여 뼈 표면을 노출시면 쥐 무릎 관절은 필수 신경이나 혈관을 방해하지 않고 약 135 ° 무릎 굴곡에서 미리 구성된 내부 고정에 의해 점차적으로 고정되었다. 예상대로,이 간단한 기술은 동물의 신속한 수술 후 재활을 허용합니다. 내부 고정의 정확한 위치는 엑스레이 또는 마이크로 CT 스캐닝 분석을 통해 확인되었습니다. 운동의 범위는 이 모델의 효과를 입증하는 반대쪽 무릎 관절에서 관찰된 것보다 고정된 무릎 관절에서 현저하게 제한되었다. 게다가, 조직학 분석은 시간이 지남에 따라 후방 우수한 무릎 관절 캡슐에 섬유 증착 및 접착의 개발을 밝혀. 따라서, 이러한 미니 침습 모델은 고정화 무릎 관절 수축의 발달을 모방하는 데 적합할 수 있다.

서문

조인트 계약은 이단관절^1,2의수동 운동 범위(ROM)에 대한 제한으로 정의된다. 공동 계약을 예방하고 치료하는 것을 목표로 하는 현재의 치료법은 몇 가지 성공을 거두었습니다^3,4. 그러나, 취득한 합동 계약의 근본적인 분자 기계장치는 크게 알려지지 않은 5. 다른 사회 사회에 있는 합동 계약의 병인은 매우 다양하고 유전 요인, 외상 후 국가,만성 질병 및 머리말을 붙인 부동성 6를 포함합니다. 부동성이 인수 공동 계약 7의 개발에 중요한 문제라는것이 널리 받아들여지고 있습니다. 주요 공동 계약으로 고통받는 사람들은 궁극적으로 신체 장애를 초래할 수 있습니다⁸. 따라서, 획득한 공동 계약의 잠재적인 병리생리학적 메커니즘을 조사하기 위해서는 안정적이고 재현 가능한 동물 모델이 필요하다.

현재 내장 된 고정 유도 무릎 관절 계약 모델은 주로 비 침습적 인 석고 주조, 외부 고정 및 내부 고정을 활용하여 달성된다. 와타나베 등은 쥐 무릎 관절에 석고 주조 고정의사용 가능성을보고 9. 특수 재킷을 착용함으로써, 쥐의 하반신 관절의 한쪽은 캐스트에 의해 고정된다. 쥐 무릎 관절은 어떤 외과 외상 없이 완전히 구부러진 남아 있습니다^10,11. 그러나, 엉덩이와 발목 관절 운동 모두 또한 고관절의 이러한 형태에 의해 영향을 받는다, 이는 사두근 femoris 또는 위장관12에서 근육 위축의 정도를 증가시킬 수있다. 또한, 부종과 뒷다리의 혼잡은 부동성의 연속성에 영향을 미칠 수있는 설정 된 시점에서 캐스트를 교체하여 피해야한다. 무릎 관절 계약 모델의 설립을위한 또 다른 허용 방법은 외부 수술 고정을 사용하는 것입니다. Nagai 등은 Kirschner 와이어와 강철 와이어를 외부 고정기로 결합하여 무릎 관절을 약 140 °의 굴곡^13으로고정시켰습니다. 이 방법에서는 수지가 피부 흠집을 방지하기 위해 표면을 덮는 데 사용됩니다. 외부 고정 고정 고정은 강력하고 신뢰할 수있는^14,15,경피 키르슈너 와이어 핀 트랙은 감염의 위험을 증가시킬 수 있지만¹⁶. 우리 자신의 경험에서, 외부 고정 기술을 사용 하 여 조건 된 핥기 행동의 증가 로 인해 쥐의 일일 활동을 줄일 수 있습니다.

대안적으로, Trudel 등은 외과적 내부 고정(17)에 기초하여 쥐 무릎 관절에서 관절 계약의 잘 받아들여진 모델을 기술하였다(이 방법은 에반스 및^{동료(18)에}의해 사용되는 것으로부터 변형되었다. 특히,이 방법은 수술 상처를 최소화하기 위해 미니 절개 기술을 활용하는 중요성을 강조한다. 공동 계약의 효율적인 개발은이 모델^19에서입증되었습니다. 그러나, 뼈 표면을 노출시키기 위해 최소한의 해부를 수행하는 방법에 대한 프로토콜은 여전히 불분명하다^20. 또한 나사가 드릴링되는 정확한 위치는 완전히 이해되지 않습니다. 피하 또는 하부 근육 방법을 통해 내부 고정의 이식은 여전히 논란의^{여지가 21.} 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 뼈 표면의 미니 침습적 노출과 근력 채널을 통해 이식의 배치를 허용하는 적절한 근육 갭 분리 modus를 포함하여이 방법을 수정했습니다. 이 프로토콜은 수술 후 쥐에서 빠른 수술 후 재활을 주도. 동물은 조직학적 분석에서 얻은 캡슐 부착의 형태학적 변화와 일치하는 관절 고정 후 제한된 관절 운동 범위를 개발했습니다. 또한 X선 분석 또는 마이크로 CT 분석에 의해 확인된 드릴 나사의 정확한 위치를 설명합니다. 따라서, 본 연구는 미니 절개 방법과 결합된 근육 갭 분리 모듈에 의해 확립된 무릎 관절 수축 모델에서 최소 침습적 기술을 상세히 설명하는 것을 목표로 하였다. 우리는 최소 침습 기술이 동물 외상을 감소시키고 효과적으로 관절 굴곡 계약의 병리학 적 과정을 모방 할 수 있다고 생각합니다.

프로토콜

모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었으며, 선야센 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 제 3 제휴 병원에 의해 승인되었다 (허가 번호: 02-165-01). 모든 동물 실험은 도착 지침에 따라 수행되었다.

1. 수술 전 준비

참고: 그림 1은 외과 적 수술의 디자인을 보여줍니다.

1. 약 135° 굴곡에서 플라스틱 플레이트와 두 개의 금속 나사로 무릎 관절을 단단히 고정시됩니다.
   참고 : 관절 구성 요소를 위반하지 않고 근위 대퇴골과 말단 경골에서 수술을 수행합니다.
2. 내부 고정을 위해 재료와 악기를 준비합니다.
   1. 다음과 같은 치수에 맞게 수술 용 가위를 사용하여 5mL 주사기 (그림 2a)를 절단하여 의료 용 폴리 프로필렌 플라스틱 플레이트를 구성 : 길이, 25 mm; 너비, 10mm; 두께, 1mm (그림2b). 메스로 플레이트 둘레를 수직으로 부드럽게 합니다. 멸균 식염수로 접시를 헹구어 이물질을 3회 씻어내소.
      1. 75% 에탄올을 4시간 동안 살균한 다음 3시간 동안 자외선을 조사합니다.
   2. 플라스틱 플레이트의 사전 드릴링 구멍: 약 0-4000rpm의 속도로 휴대용 저속 전기드릴을 준비합니다(그림 2c). 플레이트의 양쪽 끝에 두 개의 구멍을 뚫고 직경은 각각 1mm및 0.9 mm입니다(그림 2d). 플레이트의 양 끝을 M 1.4mm x 8mm 및 M 1.2mm x 6mm 강철 나사(그림2e)와일치시다.
      1. 75% 에탄올로 닦고 사용하기 전에 3시간 동안 자외선으로 살균합니다.
3. 수술 기구 준비: 1 스트레이트 모기형 지혈식 클램프 1개, 부드러운 곡면 집게 1개, 눈꺼풀 리트랙터 2개, 바늘 홀더 1개, 조직집게 1개, 봉합가 가위 1개, 마이크로 티슈 가위 1개, 메스 1개(그림 2f). 121.3 °C에서 20 분 동안 오토클레이브하여 수술 기구를 살균하고 건조시십시오.
4. 실험 동물
   1. 실험에서 250-350 g의 무게를 가리는 특정 병원균 프리(SPF) 등급골격 성숙한 수컷 스프라그-도울리(또는 Wistar) 랫트(Sprague-Dawley) 랫트(Sprague-Dawley) 랫트(Spf)를 사용한다.
      참고: 실험을 위해 암컷 또는 수컷 쥐를 선택합니다.
   2. 쥐를 케이지에 넣고 12 시간 빛 / 12 h 암흑 주기 제어 실험실 방에 보관하십시오. 적절한 음식과 물을 제공하십시오.

2. 수술

1. 온도를 조정합니다. 온도 조절 수술실에 수술 용 플랫폼에 온난화 패드를 놓습니다.
2. 마취 및 피부 준비
   1. 전자 눈금과 기록으로 쥐를 무게.
   2. 쥐를 억제하고 유도 마취에 나트륨 펜토 바르 비탈 (30 mg/kg)의 복강 내 주입을 수행합니다. 동물이 발가락 핀치(22)를 사용하여 충분히 마취되고있음을 평가한다. 수술 중 각막이 건조되지 않도록 윤활유로 눈을 관리하십시오.
   3. 전기 클리퍼로 두 개의 뒷다리를 포함한 쥐의 하체를 면도하고 포비돈의 팅크를 두 번, 75% 에탄올을 세 번 소독합니다.
   4. 쥐를 옆으로 놓고 한쪽 뒷다리와 엉덩이를 노출하는 수술용 드레이프로 덮습니다.
   5. 포비도 요오드로 수술 부위를 다시 소독하십시오.
3. 미니 침습 기술을 사용하여 내부 고정으로 무릎 관절을 고정시.
   참고: 수술 중 멸균 식염수로 절개를 제대로 촉촉하게 유지하십시오. 수술은 일반적으로 두 명의 외과 의사가 필요합니다.
   1. 피부 절개 방향을 표시합니다. 대퇴골의 말단에서 큰 트로칸터, 광대 한 측면과 이두근 femoris 사이의 근육 갭의 신체 표면 투영을 따라 선을 그립니다 (그림3a). 드로잉 라인을 따라 표피 피부를 절개하여 약 1.5cm (그림 3b).
   2. 대퇴 축이 약 1cm 길이에 노출 될 때까지 조직 집게로 광대 측면과 이두근 femoris 사이의 근육 간격을 무딘 해부 (그림3c). 근육 갭의 지속적인 분리를 용이하게하기 위해 리트랙터를 사용합니다.
   3. 표피 피부를 근사 1 cm를 따라 경골 전방과 피블리리스 경골 사이의 근육 갭의 체내 돌출을 따라 말단 하부 말단에 절개(도3d). 경골이 약 1cm 길이에 노출 될 때까지 근육 간격을둔하게 해부하십시오 (그림 3e).
   4. 리트랙터와 매끄러운 집게에 의해 연조직을 분리하고, 수직으로 유지하고 1.0 mm 직경의 구멍을 전기 드릴을 사용하여 1,500 rpm의 속도로 대퇴 축에 드릴합니다(그림3f). 적절한 드릴링 위치는 더 큰 트로챈터의 아래쪽 가장자리 보다 약 8mm 낮습니다. 출혈을 멈추기 위해 상처를 빠르게 누릅니다.
      참고: 적절한 드릴링 직경은 수술 중 골절을 방지할 수 있습니다.
   5. 경골 융합의 가장자리 아래 경골 약 4mm에 직경 0.9 mm 구멍을 드릴(그림4a). 근육이나 힘줄의 분쇄를 방지하기 위해 신중하게 드릴링을 수행합니다.
   6. 직선 모기 형 지혈 클램프를 사용하여 경골 구멍에서 대퇴골 구멍까지 근육 속 코스를 형성하십시오. 근막 터널은 경골 말단의 위암혈성 아래와 둔부 메디우스위, 대퇴골 말단의 이두근 페모리스 아래를 지나갑니다.
   7. M 1.4mm x 8mm 강철 나사 하나를 사용하여 근접 대퇴골에서 플라스틱 플레이트의 한쪽 끝(직경 1.0mm 구멍)을 고정합니다(그림4b). 하나의 M 1.2 mm x 6mm 강철 나사를 사용하여 원위 경골 (그림 4c)에서 플라스틱 플레이트의다른 끝 (직경 0.9 mm 구멍)을 고정하십시오. varus 기형없이 무릎 관절을 확인합니다.
4. 상처를 닫습니다 : 4-0 흡수 성 봉합사를 사용하여 근막, 깊은 근막 및 피하 조직을봉합하십시오 (그림 4d). 폴리아미드 봉합사(그림4f)로피부를 닫습니다.

3. 수술 후 관리

1. 0.05 mg/kg에서 Buprenorphine (0.03 mg/mL)의 피하 주사를 통해 수술 후 진통을 적용하십시오. 추가 5 mg/mL Neomycin 에 대 한 식수에 5 수술 후 일.
2. 진통 혼합물 (Buprenorphine 및 Carprofen)을 각각 0.05mg / kg 및 5 mg / kg의 피하로 하루에 두 번 적어도 72 시간 수술 후 주입하십시오.
3. 혈관 손상의 경우 뒷다리가 과도하게 부종이 있었는지 확인하십시오. 쥐는 수술 중 신경 손상의 경우에 정상적으로 걸을 수 있는지 확인.

4. 수술 후 검사

1. 수술 절개의 치유를 관찰하고 물리적으로 수술 후 매일 감염의 초기 징후를 평가하기 위해 무릎 관절을 검사. 지속적인 부종의 경우 발목과 메타 카르포팔란게알 관절의 붓기 정도를 확인하십시오.
   참고 : 초기 수술 후 감염은 상처 삼출, 다리 부종 및 지연 된 상처 치유를 일으킬 수 있습니다.
2. 뒷다리의 X선 이미징을 수행하여 첫 수술 후 날에 나사를 올바르게 배치하도록 합니다.
   참고: 마이크로 CT 스캔 해석은 강철 나사의 적절한 위치와 방향을 표시하는 또 다른 대안 옵션입니다.
3. 동의 범위(ROM)를 측정하여 계약의 개발을 평가합니다. 앞서^20일설명한 바와 같이 수술 후 다른 시간 코호트에서 무릎 관절 ROM 측정을 수행한다.
   1. 간단히 말해서, 쥐와 피부 뒷다리를 안락사. 이모빌라이저를 제거하고 2개의 토크(667 또는 1,060 g/cm)에서 기계식 관절계를사용하여 무릎 관절 각도를 측정한다(23).
   2. 조사 목적^24에기초하여 총 계약, 근생 계약 및 관절성 계약의 결과로 서롬을 계산한다.
      참고: 연구 목표에 따라 다른 시간 코호트(예: 1, 2, 4, 8, 16 및 32주)를 설정합니다. 반대 쪽 무릎 관절 (비 수술 또는 sham-조작) 대조군 으로 역할을 할 수^있습니다2.
4. 후방 무릎 관절 캡슐의 조직 학적 분석.
   1. 관절 조직을 준비하십시오. 무릎 관절 조직을 해부하고 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하십시오. decalcify 및 이전에보고 된 대로 파라핀에 포함²⁵. 시상 평면의 내측 중간 콘디내르 수준에서 단면(5 μm)을 잘라냅니다.
      참고 : HE, 알데히드 - 푸친 - 마슨 골드너 (AFMG), Elastica - Masson, 또는 연구 목표에 따라 관절 캡슐에서 조직학적 연구를위한 면역 조직 화학 염색을 포함하여 다른 평가 염색을 수행하도록 선택^{15, 26}.
   2. 후방 무릎 관절 캡슐의 조직 체형 변화를 관찰하십시오. 무릎 관절의 후방 부위를 촬영합니다. 편도체-시노비움 접합부와 반월 상 연골 사이의 섬유증 및유착 변화를 관찰한다 6.
      참고 : 관절 캡슐의 병리학 적 변화는 무릎 관절 계약에 대한 병원성 요인으로 간주됩니다. 연구 내용^27에따라 상술한 바와 같이 후방 캡슐의 길이, 두께 및 캡큘러 영역을 측정한다.

결과

우리는 쥐가 최소 침습 수술을 받은 단 하루 수술 후 일반 식단으로 돌아갈 수 있다는 것을 관찰했습니다. 특히, 외과 절개는 삼출없이 상처를 입었습니다(도5a). 수술 뒷다리에서 발목과 메타카르포팔란게아 관절의 부종은 수술 후 이틀 간거의 전적으로 사라졌다(도 5b)는 반대측과 비교했을 때(도5c). 초기...

토론

이 연구는 수술 후 동물의 신속한 수술 후 재활을 허용하는 미니 침습 적 기술을 사용하여 단계별 무릎 관절 고정 방법을 설명하기위한 것입니다. 종래, 근육 갭 분리 접근은 정형 외과 수술에서 최소 침습 기술로 생각된다. 예상대로, 우리는 쥐가 이전 연구와 일치하는 수술 후 정상적인 식이 요법과 활동으로 돌아갈 수 있다는 것을 발견했습니다. 더욱이, 수술 후 동맥이나 신경 손상이 발생하지 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anerdian	Shanghai Likang Ltd.	310173	antibacterial
Buprenorphine	Shanghai Shyndec Pharmaceutical Ltd.	/	analgesia
Carprofen	MCE	HY-B1227	analgesia
Cross screwdriver	STANLEY	PH0*125mm	tighten the screws
Electric drill	WEGO	185	drill hole(with stainless steel drill 0.9mm;1.0mm)
Microsurgical instruments	RWD	/	Orthopaedic surgical instruments for animals
Neomycin	Sigma	N6386	antibacterial
Sodium pentobarbital	Sigma	P3761	anaesthetize
Stainless Steel screws	WEGO	m1.4*8; m1.2*6	screw(part of internal fixation)
Syringe	WEGO	3151474	use for plastic plate(part of internal fixation)
μ-CT	ALOKA	Latheta LCT-200	in vivo CT scan