Eine Mini-invasive interne Fixierungstechnik zum Studium der Immobilisierung-induzierten Knieflexionskontraktur bei Ratten

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Beschreibung einer minimalinvasiven Technik zur Immobilisierung von Kniegelenken in einem Rattenmodell vor. Dieses reproduzierbare Protokoll, das auf dem Modus der Muskel-Lücken-Trennung und der Mini-Inzisionsfähigkeit basiert, eignet sich für die Untersuchung des zugrunde liegenden molekularen Mechanismus der erworbenen Gelenkkontraktur.

Zusammenfassung

Die gemeinsame Kontraktur, die aus einer längeren Gelenkimmobilisierung resultiert, ist eine häufige Komplikation in der Orthopädie. Derzeit ist die Verwendung einer internen Fixierung zur Einschränkung der Kniegelenksbeweglichkeit ein weithin akzeptiertes Modell, um experimentelle Kontraktur zu erzeugen. Die Implantation wird jedoch unweigerlich zu chirurgischen Traumata für die Tiere führen. Mit dem Ziel, einen weniger invasiven Ansatz zu entwickeln, kombinierten wir einen Muskel-Lücken-Trennungsmodus mit einer zuvor gemeldeten Mini-Inzisionsfähigkeit während des chirurgischen Eingriffs: Zwei Mini-Hautschnitte wurden an seitlichem Oberschenkel und Bein gemacht, gefolgt von einer Muskellücke Trennung, um die Knochenoberfläche freizulegen. Das Kniegelenk der Ratte wurde nach und nach durch eine vorkonstruierte innere Fixierung bei ca. 135° Kniebeugung immobilisiert, ohne wesentliche Nerven oder Blutgefäße zu stören. Wie erwartet, ermöglicht diese einfache Technik eine schnelle postoperative Rehabilitation bei Tieren. Die korrekte Position der internen Fixierung wurde durch eine Röntgen- oder Mikro-CT-Scananalyse bestätigt. Der Bewegungsumfang war im immobilisierten Kniegelenk deutlich eingeschränkt als im kontralateralen Kniegelenk, das die Wirksamkeit dieses Modells demonstrierte. Außerdem ergab die histologische Analyse die Entwicklung von faseriger Ablagerung und Haftung in der hinteren-überlegenen Kniegelenkkapsel im Laufe der Zeit. Somit kann dieses Mini-invasive Modell geeignet sein, um die Entwicklung von immobilisierten Kniegelenkkontrakturen nachzuahmen.

Einleitung

Gemeinsame Kontrakturen sind definiert als eine Beschränkung im passiven Bewegungsbereich (ROM) eines Diaarthrodialgelenks^1,2. Die aktuellen Therapien zur Vorbeugung und Behandlung von Gelenkkontrakturen haben einige Erfolge erzielt^3,4. Der zugrunde liegende molekulare Mechanismus der erworbenen gemeinsamen Kontraktur bleibt jedoch weitgehend unbekannt⁵. Die Ätiologie der gemeinsamen Kontrakturen in verschiedenen sozialen Gemeinschaften ist sehr vielfältig und umfasst genetische Faktoren, posttraumatische Zustände, chronische Krankheiten und anhaltende Immobilität⁶. Es ist allgemein anerkannt, dass Immobilität ein kritisches Thema bei der Entwicklung der erworbenen gemeinsamen Verträge⁷ist. Menschen, die unter größeren gemeinsamen Verträgen leiden, können letztlich zu einer körperlichen Behinderung führen⁸. Daher ist ein stabiles und reproduzierbares Tiermodell notwendig, um die möglichen pathophysiologischen Mechanismen der erworbenen Gelenkkontraktur zu untersuchen.

Die derzeit aufgebauten Immobilisierungs-induzierten Kniegelenkkontrakturmodelle werden meist durch den Einsatz nicht-invasiver Gipsabgüsse, externer Fixierungen und interner Fixierungen erreicht. Watanabe et al. berichteten über die Möglichkeit der Verwendung von Gipsguss-Immobilisierung auf Rattenkniegelenke⁹. Durch das Tragen einer speziellen Jacke wird eine Seite des unteren Gelenks der Ratte durch einen Guss immobilisiert. Das Kniegelenk der Ratte kann ohne chirurgisches Trauma vollständig gebeugt bleiben^10,11. Jedoch, sowohl die Hüft- und Knöchelgelenkbewegungen sind auch von dieser Form der Immobilisierung betroffen, die den Grad der Muskelatrophie bei Quadrizeps femoris oder Gastrocnemius¹²erhöhen kann. Darüber hinaus müssen Ödeme und Staus der Hinterbeine vermieden werden, indem die Umwandlung zu festgelegten Zeitpunkten ersetzt wird, was die Kontinuität der Unbeweglichkeit beeinträchtigen kann. Eine weitere akzeptierte Methode zur Etablierung eines Kniegelenk-Kontrakturmodells ist die Verwendung externer chirurgischer Fixierung. Nagai et al. kombinierten Kirschnerdraht und Stahldraht zu einem externen Fixator, der das Kniegelenk auf ca. 140° Flexion¹³immobilisierte. Bei dieser Methode wird ein Harz verwendet, um die Oberfläche zu bedecken, um Hautkratzer zu verhindern. Obwohl die externe Fixierungsimmobilisierung robust und zuverlässig ist^14,15, perkutane Kirschner Drahtstiftspuren können das Infektionsrisiko erhöhen¹⁶. Nach unserer eigenen Erfahrung kann die Verwendung der externen Fixierungstechnik die tägliche Aktivität von Ratten aufgrund einer Zunahme des konditionierten Leckverhaltens reduzieren.

Alternativ beschrieben Trudel et al. ein gut akzeptiertes Modell der Gelenkkontraktur im Kniegelenk der Ratte auf der Grundlage einer chirurgischen inneren Fixierung¹⁷ (diese Methode wurde von der von Evans und Kollegen¹⁸verwendeten methode modifiziert). Diese Methode unterstreicht insbesondere die Bedeutung der Verwendung einer Mini-Inzisionstechnik, um die chirurgischen Wunden zu minimieren. Die effiziente Entwicklung der gemeinsamen Auftragsvergabewurde in diesem Modell 19 nachgewiesen. Das Protokoll, wie eine minimale Sezierung zum Belichten der Knochenoberfläche durchgeführt werden soll, ist jedoch noch unklar²⁰. Auch die genaue Position, an der die Schraube bohrt, ist nicht vollständig verstanden. Die Implantation der inneren Fixierung durch eine subkutane oder submuskuläre Weise ist noch umstritten²¹. Um diese Probleme zu lösen, haben wir diese Methode modifiziert, indem wir einen geeigneten Muskel-Lücken-Trennmodus einbeziehen, der eine mini-invasive Exposition der Knochenoberfläche und die Platzierung der Implantation durch einen submuskulären Kanal ermöglicht. Dieses Protokoll führte zu einer schnellen postoperativen Rehabilitation bei Ratten nach einer Operation. Die Tiere entwickelten nach der gelenken Immobilisierung einen begrenzten Gelenkbewegungsbereich, der mit morphologischen Veränderungen der kapselförmigen Adhäsion aus der histologischen Analyse übereinstimmte. Wir beschreiben auch eine genaue mögliche Position der gebohrten Schrauben, wie durch Röntgenanalyse oder Mikro-CT-Analyse bestätigt. So zielte diese Studie darauf ab, eine minimal-invasive Technik in einem Kniegelenkskontrakturmodell im Detail zu beschreiben, die durch einen Muskel-Lücken-Trennmodus in Kombination mit einer Mini-Inzisionsmethode etabliert wurde. Wir glauben, dass minimalinvasive Techniken sowohl Tiertraumata reduzieren als auch den pathologischen Prozess der gelenken Flexionskontraktur effektiv nachahmen können.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden vom Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University institutional animal care and use Committee (Genehmigungsnummer: 02-165-01) genehmigt. Alle Tierversuche wurden nach den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

1. Präoperative Zubereitung

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt das Design des chirurgischen Eingriffs.

1. Das Kniegelenk mit einer Kunststoffplatte und zwei Metallschrauben bei ca. 135° Flexion fest immobilisieren.
   HINWEIS: Führen Sie die Operation am proximalen Oberschenkelknochen und der distalen Tibia durch, ohne die Gelenkkomponente zu verletzen.
2. Bereiten Sie Materialien und Instrumente für die interne Fixierung vor.
   1. Konstruieren Sie eine medizinische Qualität Polypropylen Kunststoffplatten durch Schneiden einer 5 ml Spritze (Abbildung2a) mit einer chirurgischen Schere, um die folgenden Abmessungen zu passen: Länge, 25 mm; Breite, 10 mm; Dicke, 1 mm (Abbildung 2b). Glätten Sie den Umfang der Platte mit einem Skalpell vertikal. Spülen Sie die Platte mit steriler Kochsaline, um den Schmutz um das Dreifache abzuwaschen.
      1. Sterilisieren Sie mit 75% Ethanol für 4 h, gefolgt von Bestrahlung mit ultraviolettem Licht für 3 h.
   2. Vorbohren von Löchern in der Kunststoffplatte: Bereiten Sie einen handgehaltenen Elektrobohrer mit einer Geschwindigkeit von etwa 0-4000 Umdrehungen pro Minute vor (Abbildung 2c). Bohren Sie zwei Löcher an beiden Enden der Platte, Durchmesser sind 1 mm bzw. 0,9 mm, bzw. (Abbildung2d). Passen Sie beide Enden der Platte mit M 1,4 mm x 8 mm und M 1,2 mm x 6 mm Stahlschrauben bzw. (Abbildung2e).
      1. Mit 75% Ethanol abwischen und vor Gebrauch mit UV-Licht für 3 h sterilisieren.
3. Bereiten Sie chirurgische Instrumente vor: 1 gerade Moskitostatik-Klemme, 1 glatte gekrümmte Zange, 2 Augenlid-Retraktoren, 1 Nadelhalter, 1 Gewebezange, 1 Nahtschere, 1 Mikrogewebeschere und 1 Skalpell (Abbildung 2f). Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren bei 121,3 °C für 20 min und Trocknen.
4. Versuchstiere
   1. Verwenden Sie Specific Pathogen Free (SPF) Grade skelettreifen männlichen Sprague-Dawley (oder Wistar) Ratten, die zwischen 250 - 350 g im Experiment wiegen.
      HINWEIS: Wählen Sie entweder weibliche oder männliche Ratten für das Experiment.
   2. Legen Sie die Ratten in Käfige und halten Sie sie in einem 12 h licht/12 h dunklen, zyklusgesteuerten Laborraum auf. Versorgen Sie ausreichend Nahrung und Wasser.

2. Chirurgie

1. Stellen Sie die Temperatur ein. Legen Sie ein wärmendes Pad auf eine chirurgische Plattform in einem thermostatischen Operationssaal.
2. Anästhesie und Hautpräparation
   1. Wiegen Sie die Ratte mit einer elektronischen Waage und Aufzeichnung.
   2. Halten Sie die Ratte zurück und führen Sie eine intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital (30 mg/kg) in induzierte Anästhesie durch. Beurteilung, dass das Tier mit der Zehenzange ausreichend beästheisiert ist²². Verabreichen Sie die Augen mit Schmiermittel, um die Hornhaut während der Operation vor dem Trocknen zu schützen.
   3. Rasieren Sie den Unterkörper der Ratte einschließlich der beiden Hinterbeine mit einem elektrischen Clipper und desinfizieren Sie mit einer Tinktur Povidon Jod zweimal und 75% Ethanol dreimal.
   4. Legen Sie die Ratte seitlich, und decken Sie mit dem chirurgischen Vorhang, der eine Seite hinter Bein und Hüfte aussetzt.
   5. Desinfizieren Sie den Operationsbereich erneut mit Povidon-Jod.
3. Immobilisieren Sie das Kniegelenk mit interner Fixierung mit einer Mini-invasiven Technik.
   HINWEIS: Halten Sie den Schnitt während der Operation richtig feucht mit steriler Saline. Die Operation erfordert in der Regel zwei Chirurgen.
   1. Markieren Sie die Richtung des Hautschnitts. Zeichnen Sie am distalen Ende des Oberschenkelknochens einen größeren Trochanter entlang der Körperoberflächenprojektion des Muskelspalts zwischen vastus lateralis und biceps femoris (Abbildung 3a). Incise die Epidermis Haut entlang der Zeichnungslinie ca. 1,5 cm (Abbildung 3b).
   2. Sezieren Sie den Muskelspalt zwischen vastus lateralis und biceps femoris mit einer Gewebezange, bis der Oberschenkelschaft etwa 1 cm lang ausgesetzt ist (Abbildung 3c). Verwenden Sie den Retraktor, um die kontinuierliche Trennung des Muskelspalts zu erleichtern.
   3. Incise die Epidermis Haut ca. 1 cm entlang der Körperoberfläche Projektion des Muskelspalts zwischen dem tibialis anterior und fibularis longus auf die distale untere Extremität (Abbildung 3d). Sezieren Sie den Muskelspalt unverblümt, bis die Tibia etwa 1 cm lang ausgesetzt ist (Abbildung 3e).
   4. Trennen Sie die Weichgewebe durch den Retraktor und die glatten Zangen, halten Sie senkrecht und bohren Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 1,0 mm in die Oberschenkelwelle mit einer Geschwindigkeit von 1.500 Umdrehungen pro Minute mit einem elektrischen Bohrer (Abbildung3f). Die richtige Bohrposition beträgt ca. 8 mm unter dem unteren Rand des größeren Trochanters. Drücken Sie schnell die Wunde, um die Blutung zu stoppen.
      HINWEIS: Der richtige Bohrdurchmesser kann intraoperative Frakturen vermeiden.
   5. Bohren Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 0,9 mm in die Tibia ca. 4 mm unterhalb des Rands der tiiofibulären Fusion (Abbildung 4a). Führen Sie das Bohren sorgfältig durch, um das Zerkleinern von Muskeln oder Sehnen zu verhindern.
   6. Verwenden Sie die gerade Moskitostatikklemme, um einen submuskulären Kurs vom Tibialoch zum Oberschenkelknochenloch zu bilden. Der submuskuläre Tunnel verläuft unterhalb des Gastrocnemius im Tibia-Ende und oberhalb des Gluteus medius, unterhalb des Bizeps femoris im Oberschenkelknochenende.
   7. Verwenden Sie eine M 1,4 mm x 8 mm Stahlschraube, um ein Ende der Kunststoffplatte (mit dem Loch mit 1,0 mm Durchmesser) im proximalen Oberschenkelknochen zu befestigen (Abbildung 4b). Verwenden Sie eine M 1,2 mm x 6 mm Stahlschraube, um ein weiteres Ende der Kunststoffplatte (mit dem Loch 0,9 mm Durchmesser) in der distalen Tibia zu sichern (Abbildung 4c). Stellen Sie das Kniegelenk ohne Varusdeformität sicher.
4. Schließen Sie die Wunde: Naht der Myofaszie, tiefe Faszien und subkutanes Gewebe mit 4-0 resorbierbaren Nähten (Abbildung 4d). Schließen Sie die Haut mit Polyamid-Nähten (Abbildung 4f).

3. Postoperatives Management

1. Tragen Sie die postoperative Analgesie durch subkutane Injektion von Buprenorphin (0,03 mg/ml) bei 0,05 mg/kg auf. Fügen Sie 5 mg/ml Neomycin 5 Tage nach der Operation in Trinkwasser ein.
2. Injizieren Sie das Analgesiegemisch (Buprenorphin und Carprofen) jeweils mit 0,05mg/kg und 5 mg/kg zweimal täglich für mindestens 72 Stunden nach der Operation.
3. Prüfen Sie, ob die Hintergliedmaße bei Gefäßverletzungen ein Überödem hatte. Stellen Sie sicher, dass die Ratten im Falle einer Nervenverletzung während der Operation normal laufen können.

4. Postoperative Untersuchung

1. Beobachten Sie die Heilung des chirurgischen Schnitts und untersuchen Sie das Kniegelenk körperlich, um frühe Anzeichen einer Infektion jeden zweiten Tag postoperativ zu bewerten. Überprüfen Sie den Grad der Schwellung des Knöchels und des metacarpophalangealen Gelenks bei kontinuierlichen Ödemen.
   HINWEIS: Eine frühe postoperative Infektion kann zu Wundexut, Beinschwellung und verzögerter Wundheilung führen.
2. Führen Sie eine Röntgenaufnahme des Hinterteils durch, um sicherzustellen, dass die Schrauben am ersten postoperativen Tag korrekt platziert werden.
   HINWEIS: Eine Micro-CT-Scananalyse ist eine weitere Alternative, um die richtige Position und die Richtung der Stahlschrauben anzuzeigen.
3. Messen Sie den passiven Bewegungsbereich (ROM), um die Entwicklung von Kontrakturen zu bewerten. Nehmen Sie eine Kniegelenk ROM-Messung zu verschiedenen Zeit Kohorten postoperativ wie zuvor beschrieben²⁰.
   1. Kurz gesagt, euthanisieren Sie die Ratten und Haut die Hinterbeine. Entfernen Sie die Wegfahrsperre und messen Sie den Kniegelenkwinkel mit einem mechanischen Arthrometer bei zwei Drehmomenten (667 oder 1.060 g/cm)²³.
   2. Berechnen Sie das ROM als Ergebnis der Gesamtkontraktur, der myogenen Kontraktur und der arthrogenen Kontraktur getrennt auf der Grundlage der Untersuchungsziele²⁴.
      HINWEIS: Legen Sie verschiedene Zeitkohorten (d. h. 1, 2, 4, 8, 16 und 32 Wochen) entsprechend den Forschungszielen fest. Das kontralaterale Kniegelenk (nicht-operativ oder scheinbetätigt) kann als Kontrolle^{dienen 2}.
4. Histologische Analyse der hinteren Kniegelenkkapseln.
   1. Bereiten Sie das Gelenkgewebe vor. Sezieren Sie das Kniegelenkgewebe und fixieren Sie es mit 4% Paraformaldehyd. Entkalken und einbetten Sie es in Paraffin, wie zuvor berichtet²⁵. Schneiden Sie die Abschnitte (5 m) auf der medialen Midkondylar-Ebene in der sagittalen Ebene.
      HINWEIS: Wählen Sie verschiedene Bewertung Färbung einschließlich HE, Aldehyd-Fuchsin-Masson Goldner (AFMG), Elastica-Masson, oder Immunhistochemie Färbung für histologische Studie in der Gelenkkapsel auf der Grundlage Ihrer Studienziele^{15, 26}.
   2. Beobachten Sie histomorphometrische Veränderungen in den hinteren Kniegelenkkapseln. Fotografieren Sie den hinteren Bereich des Kniegelenks. Beobachten Sie faserige Ablagerungen und Haftänderungen zwischen der Diaphysen-Synovium-Kreuzung und dem Meniskus⁶.
      HINWEIS: Pathologische Veränderungen der Gelenkkapsel gelten als pathogener Faktor für die Kontraktur der Kniegelenke. Messen Sie die Länge, die Dicke und die Kapselbereiche der hinteren Kapsel, wie zuvor gemäß dem Forschungsinhalt²⁷beschrieben.

Ergebnisse

Wir beobachteten, dass Ratten, die minimal-invasive Operationen erhielten, nur einen Tag nach der Operation zur regulären Ernährung zurückkehren können. Insbesondere hat sich der chirurgische Schnitt ohne Exulat vernarbt (Abbildung 5a). Die Schwellung des Knöchels und der metacarpophalangealen Gelenke im operativen Hinterglied ist zwei Tage postoperativ fast vollständig verschwunden (Abbildung 5b) im Vergleich zur kontralat...

Diskussion

Diese Studie zielte darauf ab, eine schrittweise Methode der Immobilisierung des Kniegelenks mit einer Mini-invasiven Technik aufzuklären, die eine schnelle postoperative Rehabilitation bei Tieren nach einer Operation ermöglicht. Konventionell wird der Muskel-Lücken-Trennungsansatz als minimalinvasive Technik in der orthopädischen Chirurgie angesehen. Wie erwartet, fanden wir heraus, dass Ratten zu einer normalen Ernährung und Aktivitäten nur einen Tag postoperativ zurückkehren können, was mit der vorherigen Stud...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anerdian	Shanghai Likang Ltd.	310173	antibacterial
Buprenorphine	Shanghai Shyndec Pharmaceutical Ltd.	/	analgesia
Carprofen	MCE	HY-B1227	analgesia
Cross screwdriver	STANLEY	PH0*125mm	tighten the screws
Electric drill	WEGO	185	drill hole(with stainless steel drill 0.9mm;1.0mm)
Microsurgical instruments	RWD	/	Orthopaedic surgical instruments for animals
Neomycin	Sigma	N6386	antibacterial
Sodium pentobarbital	Sigma	P3761	anaesthetize
Stainless Steel screws	WEGO	m1.4*8; m1.2*6	screw(part of internal fixation)
Syringe	WEGO	3151474	use for plastic plate(part of internal fixation)
μ-CT	ALOKA	Latheta LCT-200	in vivo CT scan