Une technique de fixation interne mini-invasive pour étudier la contracture de flexion du genou induite par l'immobilisation chez les rats

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour décrire une technique mini-invasive pour l'immobilisation d'articulation de genou dans un modèle de rat. Ce protocole reproductible, basant sur le modus de séparation de muscle-écart et la compétence de mini-incision, est approprié pour étudier le mécanisme moléculaire sous-jacent de la contracture commune acquise.

Résumé

La contracture articulaire, résultant d'une immobilisation articulaire prolongée, est une complication commune dans l'orthopédie. Actuellement, l'utilisation d'une fixation interne pour restreindre la mobilité des articulations du genou est un modèle largement accepté pour générer une contracture expérimentale. Cependant, l'application d'implantation causera inévitablement le trauma chirurgical aux animaux. Visant à développer une approche moins invasive, nous avons combiné un modus de séparation de muscle-écart avec une compétence précédemment rapportée de mini-incision pendant l'intervention chirurgicale : deux mini incisions de peau ont été faites sur la cuisse et la jambe latérales, suivies en exécutant l'exécution de muscle-écart séparation pour exposer la surface osseuse. L'articulation du genou du rat a été progressivement immobilisée par une fixation interne préconstruite à environ 135 degrés de flexion du genou sans interférer entre les nerfs essentiels ou les vaisseaux sanguins. Comme prévu, cette technique simple permet une réadaptation postopératoire rapide chez les animaux. La position correcte de la fixation interne a été confirmée par une analyse de radiographie ou de micro-CT. L'ordre de mouvement a été sensiblement restreint dans l'articulation immobilisée de genou que celle observée dans l'articulation contralatérale de genou démontrant l'efficacité de ce modèle. En outre, l'analyse histologique a indiqué le développement du dépôt fibreux et de l'adhérence dans la capsule postérieure-supérieure d'articulation de genou au fil du temps. Ainsi, ce modèle mini-invasif peut être approprié pour imiter le développement de la contracture immobilisée d'articulation de genou.

Introduction

Les contractures conjointes sont définies comme une restriction dans l'aire de répartition passive du mouvement (ROM) d'une articulation diarthrodiadiale^1,2. Les thérapies actuelles visant à prévenir et à traiter la contracture articulaire ont obtenu un certain succès^3,4. Cependant, le mécanisme moléculaire sous-jacent de la contracture articulaire acquise reste largement inconnu⁵. L'étiologie des contractures articulaires dans différentes communautés sociales est très diversifiée et comprend des facteurs génétiques, des états post-traumatiques, des maladies chroniques et une immobilité prolongée⁶. Il est largement admis que l'immobilité est une question cruciale dans le développement de la contracture conjointe acquise⁷. Les personnes qui souffrent d'une contracture articulaire importante peuvent en fin de compte entraîner une incapacité physique⁸. Ainsi, un modèle animal stable et reproductible est nécessaire pour étudier les mécanismes pathophysiologiques potentiels de la contracture articulaire acquise.

Les modèles de contracture articulaire du genou actuellement construits induits par l'immobilisation sont principalement réalisés en utilisant des moulages en plâtre non invasifs, des fixations externes et des fixations internes. Watanabe et coll. ont signalé la possibilité d'utiliser l'immobilisation de plâtre sur les articulations du genou de rat⁹. En portant une veste spéciale, un côté de l'articulation du membre inférieur du rat est immobilisé par un plâtre. L'articulation du genou rat peut rester entièrement fléchis sans aucun traumatisme chirurgical^10,11. Cependant, les mouvements articulaires de hanche et de cheville sont également affectés par cette forme d'immobilisation, qui peut augmenter le degré d'atrophie de muscle dans le femoris de quadriceps ou le gastrocnemius^12. En outre, l'œdème et la congestion des membres postérieurs doivent être évités en remplaçant la fonte aux points fixes, ce qui peut affecter la continuité de l'immobilité. Une autre méthode acceptée pour l'établissement d'un modèle de contracture articulaire du genou est l'utilisation de fixation chirurgicale externe. Nagai et coll. ont combiné le fil kirschner et le fil d'acier dans un fixateur externe, ce qui a immobilisé l'articulation du genou à environ 140 degrés de flexion¹³. Dans cette méthode, une résine est utilisée pour couvrir la surface pour prévenir les égratignures cutanées. Bien que l'immobilisation de fixation externe soit robuste et fiable^14,15, percutané Kirschner pistes broches de fil peut augmenter le risque d'infection¹⁶. Dans notre propre expérience, l'utilisation de la technique de fixation externe peut réduire l'activité quotidienne des rats en raison d'une augmentation du comportement de lécher conditionné.

Par ailleurs, Trudel et coll. ont décrit un modèle bien accepté de contracture articulaire dans l'articulation du genou du rat à partir d'une fixation interne chirurgicale¹⁷ (cette méthode a été modifiée par rapport à celle utilisée par Evans et ses collègues¹⁸). Notamment, cette méthode souligne l'importance d'utiliser une technique de mini-incision pour minimiser les plaies chirurgicales. Le développement efficace de la contracture conjointe a été prouvé dans ce modèle¹⁹. Cependant, le protocole sur la façon d'effectuer une dissection minimale pour exposer la surface osseuse n'est pas encore clair²⁰. En outre, la position précise où la vis est de forage n'est pas entièrement comprise. L'implantation de la fixation interne par une voie sous-cutanée ou submusculaire est encore controversée²¹. Pour résoudre ces problèmes, nous avons modifié cette méthode en incluant un modus approprié de séparation de muscle-écart, qui permet une exposition mini-invasive de la surface d'os et le placement de l'implantation par un canal submusculaire. Ce protocole a mené à la réadaptation postopératoire rapide chez les rats après chirurgie. Les animaux ont développé une gamme limitée de mouvement commun après immobilisation commune, qui était compatible aux changements morphologiques de l'adhérence capsulaire obtenues de l'analyse histologique. Nous décrivons également un emplacement exact possible des vis forées comme confirmé par l'analyse de rayon X ou l'analyse de micro-CT. Ainsi, cette étude visait à décrire en détail une technique mini-invasive dans un modèle de contracture articulaire du genou qui a été établi par un modus de séparation de muscle-écart combiné avec une méthode de mini-incision. Nous croyons que les techniques mini-invasives peuvent à la fois réduire les traumatismes animaux et imiter efficacement le processus pathologique de la contracture de flexion articulaire.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément au Guide pour l'entretien et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le troisième hôpital affilié de l'Université Sun Yat-sen comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (numéro d'autorisation : 02-165-01). Toutes les expériences animales ont été réalisées selon les directives de l'ARRIVE.

1. Préparation préopératoire

REMARQUE : La figure 1 montre la conception de l'intervention chirurgicale.

1. Immobiliser rigoureusement l'articulation du genou avec une plaque de plastique et deux vis métalliques à environ 135 degrés de flexion.
   REMARQUE : Effectuez la chirurgie au fémur proximal et au tibia distal sans violer le composant commun.
2. Préparer les matériaux et les instruments pour la fixation interne.
   1. Construire une plaque en plastique en polypropylène de qualité médicale en coupant une seringue de 5 ml (Figure 2a) à l'aide d'un ciseaux chirurgicaux pour s'adapter aux dimensions suivantes : longueur, 25 mm; largeur, 10 mm; épaisseur, 1 mm (Figure 2b). Lisser le périmètre de la plaque avec un scalpel verticalement. Rincer la plaque avec de la saline stérile pour laver les débris par trois fois.
      1. Stériliser avec 75% d'éthanol pendant 4 h suivi d'irradiation avec la lumière ultraviolette pendant 3 h.
   2. Pré-forage des trous dans la plaque de plastique : Préparer une perceuse électrique à basse vitesse à la main à une vitesse d'environ 0 à 4 0000 tr/min (figure 2c). Percer deux trous aux deux extrémités de la plaque, les diamètres sont de 1 mm et 0,9 mm, respectivement (Figure 2d). Associez les deux extrémités de la plaque à des vis en acier M 1,4 mm x 8 mm et 1,2 mm x 6 mm, respectivement (figure 2e).
      1. Essuyer avec 75% d'éthanol et stériliser avec de la lumière UV pendant 3 h avant utilisation.
3. Préparer les instruments chirurgicaux : 1 pince hémostatique droite de type moustique, 1 forceps incurvés lisses, 2 rétracteurs de paupières, 1 porte-aiguille, 1 forceps de tissu, 1 ciseaux de suture, 1 ciseaux de tissu micro et 1 scalpel (Figure 2f). Stériliser les instruments chirurgicaux en autoclant à 121,3 oC pendant 20 min et en lesséchant.
4. Animaux expérimentaux
   1. Utilisez des rats mâles Sprague-Dawley (ou Wistar) de grade spécifique Pathogen Free (SPF), pesant entre 250 et 350 g dans l'expérience.
      REMARQUE : Choisissez des rats femelles ou mâles pour l'expérience.
   2. Placez les rats dans des cages et conservez-les dans une salle de laboratoire à cycle foncé de 12 h/12 h. Fournir de la nourriture et de l'eau adéquates.

2. Chirurgie

1. Ajuster la température. Placez un coussin chauffant sur une plate-forme chirurgicale dans une salle d'opération thermostatique.
2. Anesthésie et préparation de la peau
   1. Peser le rat avec une balance électronique et enregistrer.
   2. Retenez le rat et effectuez une injection intrapéritonéale de pentobarbital de sodium (30 mg/kg) à l'anesthésie induite. Évaluer que l'animal est suffisamment anesthésié à l'aide de la pince de l'orteil²². Administrer les yeux avec du lubrifiant pour protéger la cornée contre le séchage pendant la chirurgie.
   3. Raser le bas du corps du rat, y compris les deux membres postérieurs avec une tondeuse électrique et désinfecter avec une teinture d'iode de povidone deux fois et 75% d'éthanol trois fois.
   4. Placez le rat latéralement, et couvrir avec le drapé chirurgical exposant une jambe arrière latérale et la hanche.
   5. Désinfecter à nouveau le secteur chirurgical avec de l'iode de povidone.
3. Immobiliser l'articulation du genou avec fixation interne en utilisant une technique mini-invasive.
   REMARQUE : Gardez l'incision bien humide avec saline stérile pendant l'opération. La chirurgie nécessite généralement deux chirurgiens.
   1. Marquez la direction de l'incision cutanée. À l'extrémité distale du plus grand trochanter de fémur, tracez une ligne le long de la projection de surface de corps de l'écart de muscle entre le vaste lateralis et le femoris de biceps (figure 3a). Incise la peau d'épiderme le long de la ligne de dessin approximative ment 1,5 cm (Figure 3b).
   2. Disséquer émoussé l'écart musculaire entre vastus lateralis et biceps femoris avec un forceps tissulaire jusqu'à ce que l'arbre fémoral soit exposé d'environ 1 cm de longueur (figure 3c). Utilisez le rétracteur pour faciliter la séparation continue de l'écart musculaire.
   3. Incise la peau épiderme approximative ment 1 cm le long de la projection de surface du corps de l'écart musculaire entre le tibialis antérieur et fibularis longus sur l'extrémité inférieure distale (Figure 3d). Disséquer émoussé l'écart musculaire jusqu'à ce que le tibia soit exposé d'environ 1 cm de longueur (Figure 3e).
   4. Séparer les tissus mous par le rétracteur et les forceps lisses, garder perpendiculaire et percer un trou de 1,0 mm de diamètre dans l'arbre fémoral à une vitesse de 1500 tr/min à l'aide d'une perceuse électrique (Figure 3f). La position de forage appropriée est d'environ 8 mm sous le bord inférieur du plus grand trochanter. Appuyez rapidement sur la plaie pour arrêter de saigner.
      REMARQUE : Le diamètre approprié de forage peut éviter des ruptures peropératoires.
   5. Percer un trou de 0,9 mm de diamètre dans le tibia environ 4 mm sous le bord de la fusion tibiofibulaire (Figure 4a). Effectuez le forage avec soin pour empêcher l'écrasement des muscles ou des tendons.
   6. Utilisez la pince hémostatique droite mosquito-Type pour former un cours submusculaire du trou du tibia au trou du fémur. Le tunnel submusculaire passe sous le gastrocnemius dans l'extrémité du tibia et au-dessus du fessier medius,en dessous du biceps femoris à l'extrémité du fémur.
   7. Utilisez une vis en acier M 1,4 mm x 8 mm pour fixer une extrémité de la plaque de plastique (avec le trou de 1,0 mm de diamètre) dans le fémur proximal (figure 4b). Utilisez une vis en acier M 1,2 mm x 6 mm pour fixer une autre extrémité de la plaque de plastique (avec le trou de 0,9 mm de diamètre) dans le tibia distal (figure 4c). Assurer l'articulation du genou sans déformation du varus.
4. Fermer la plaie : Suturer le myofascia, le fasciae profond et le tissu sous-cutané à l'aide de sutures absorbables 4-0 (figure4d). Fermer la peau avec des sutures en polyamide (Figure 4f).

3. Gestion postopératoire

1. Appliquer l'analgésie postopératoire par injection sous-cutanée de Buprenorphine (0,03 mg/mL) à 0,05 mg/kg. Ajouter 5 mg/mL de néomycine dans l'eau potable pendant 5 jours après la chirurgie.
2. Injecter le mélange d'analgésie (Buprenorphine et Carprofen) respectivement à 0,05 mg/kg et 5 mg/kg sous-cutané deux fois par jour pendant au moins 72 heures après l'opération.
3. Vérifiez si le membre postérieur avait un sur-œdème en cas de lésion vasculaire. S'assurer que les rats peuvent marcher normalement dans le cas d'une lésion nerveuse pendant la chirurgie.

4. Examen postopératoire

1. Observez la guérison de l'incision chirurgicale et examinez physiquement l'articulation du genou pour évaluer les signes précoces de l'infection tous les deux jours postopératoirement. Vérifiez le degré de gonflement de la cheville et de l'articulation métacarpophalangeal en cas d'œdème continu.
   REMARQUE : L'infection postopératoire tôt peut causer l'exsudat de blessure, l'enflure de jambe, et la guérison retardée de blessure.
2. Effectuer l'imagerie par rayons X de l'arrière-pays pour s'assurer que les vis correctement placées le premier jour postopératoire.
   REMARQUE : Une analyse de balayage de Micro-CT est une autre option alternative pour afficher l'emplacement approprié et la direction des vis en acier.
3. Mesurer l'ordre passif du mouvement (ROM) pour évaluer le développement de la contracture. Prenez une mesure de ROM d'articulation de genou à différentes cohortes de temps postopératoirement comme décrit précédemment²⁰.
   1. En bref, euthanasiez les rats et écorchez les membres postérieurs. Retirez l'immobilisateur et mesurez l'angle de l'articulation du genou à l'aide d'un arthromètre mécanique à deux couples (667 ou 1 060 g/cm)²³.
   2. Calculer le ROM à la suite de la contracture totale, de la contracture myogénique et de la contracture arthrogénique séparément en fonction des objectifs de l'enquête²⁴.
      REMARQUE : Établides différentes cohortes de temps (c.-à-d. 1, 2, 4, 8, 16 et 32 semaines) selon les objectifs de recherche. L'articulation contralatérale du genou (non opératoire ou si opératoire) peut servir de contrôle².
4. Analyse histologique des capsules postérieures d'articulation de genou.
   1. Préparer les tissus articulaires. Disséquer le tissu articulaire du genou et le fixer avec 4% de paraformaldéhyde. Décalcifiez-le et intégrez-le dans la paraffine comme précédemment rapporté²⁵. Couper les sections (5 m) au niveau médian du midcondylar dans le plan sagittal.
      REMARQUE: Choisissez d'effectuer différentes colorations d'évaluation, y compris HE, aldéhyde-fuchsin-Masson Goldner (AFMG), Elastica-Masson, ou immunohistochemistry coloration pour l'étude histologique dans la capsule articulaire basée sur vos objectifs d'étude^{15, 26}.
   2. Observez les changements histomorphométriques dans les capsules postérieures d'articulation de genou. Photographiez la région postérieure de l'articulation du genou. Observez les changements de dépôt et d'adhérence fibreux entre la jonction diaphysis-synovium et le ménisque⁶.
      REMARQUE : Les changements pathologiques de la capsule commune sont considérés comme un facteur pathogène pour la contracture articulaire du genou. Mesurer la longueur, l'épaisseur et les zones capsulaires de la capsule postérieure décrites précédemment selon le contenu de la recherche²⁷.

Résultats

Nous avons observé que les rats ont reçu la chirurgie mini-invasive peut retourner au régime régulier juste un jour postopératoirement. En particulier, l'incision chirurgicale a marqué sans exsudation (Figure 5a). L'enflure de la cheville et des articulations métacarpophalangeales dans le membre postérieur opératoire a presque entièrement disparu deux jours après l'opération (Figure 5b) par rapport au côté contralat...

Discussion

Cette étude visait à élucider une méthode d'immobilisation articulaire du genou étape par étape à l'aide d'une technique mini-invasive qui permet une réadaptation postopératoire rapide chez les animaux après la chirurgie. Conventionnellement, l'approche de séparation de muscle-écart est pensée pour être une technique mini-invasive dans la chirurgie orthopédique. Comme prévu, nous avons constaté que les rats peuvent revenir à un régime alimentaire normal et les activités juste un jour postopératoireme...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anerdian	Shanghai Likang Ltd.	310173	antibacterial
Buprenorphine	Shanghai Shyndec Pharmaceutical Ltd.	/	analgesia
Carprofen	MCE	HY-B1227	analgesia
Cross screwdriver	STANLEY	PH0*125mm	tighten the screws
Electric drill	WEGO	185	drill hole(with stainless steel drill 0.9mm;1.0mm)
Microsurgical instruments	RWD	/	Orthopaedic surgical instruments for animals
Neomycin	Sigma	N6386	antibacterial
Sodium pentobarbital	Sigma	P3761	anaesthetize
Stainless Steel screws	WEGO	m1.4*8; m1.2*6	screw(part of internal fixation)
Syringe	WEGO	3151474	use for plastic plate(part of internal fixation)
μ-CT	ALOKA	Latheta LCT-200	in vivo CT scan