Técnica de fixação interna mini-invasiva para estudo de contratura de flexão de joelho induzida por imobilização em ratos

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para descrever uma técnica minimamente invasora para a imobilização da junção de joelho em um modelo do rato. Este protocolo reprodutível, baseando-se no modus da separação da músculo-abertura e na habilidade da mini-incisão, é apropriado para estudar o mecanismo molecular subjacente da contratura comum adquirida.

Resumo

A contratura articular, resultante de uma imobilização articular prolongada, é uma complicação comum na ortopedia. Atualmente, a utilização de uma fixação interna para restringir a mobilidade articular do joelho é um modelo amplamente aceito para gerar contratura experimental. No entanto, a implantação da aplicação irá inevitavelmente causar trauma cirúrgico aos animais. Com o objetivo de desenvolver uma abordagem menos invasiva, combinamos um modus de separação músculo-Gap com uma habilidade de miniincisão previamente relatada durante o procedimento cirúrgico: duas mini incisões cutâneas foram feitas na coxa e perna laterais, seguidas pela realização de Gap muscular separação para expor a superfície óssea. A articulação do joelho do rato foi imobilizada gradualmente por uma fixação interna pré-construída na flexão de aproximadamente 135 ° joelho sem interferir nervos essenciais ou vasos sanguíneos. Como esperado, esta técnica simples permite a reabilitação postoperative rápida nos animais. A posição correta da fixação interna foi confirmada por um raio x ou por uma análise da varredura do Micro-CT. A amplitude de movimento foi significativamente restrita na articulação do joelho imobilizada do que a observada na articulação do joelho contralateral demonstrando a efetividade desse modelo. Adicionalmente, a análise histológica revelou o desenvolvimento do depósito e da adesão fibrosos na cápsula da junção do joelho do posterior-superior sobre o tempo. Assim, este modelo mini-invasor pode ser apropriado para imitar o desenvolvimento da contratura imobilizada da junção de joelho.

Introdução

As contraturas articulares são definidas como uma restrição no intervalo passivo de movimento (ADM) de uma articulação diartrodial^1,2. As terapias atuais visando prevenir e tratar a contratura articular alcançaram algum sucesso^3,4. Entretanto, o mecanismo molecular subjacente da contratura comum adquirida permanece em grande parte desconhecido⁵. A etiologia das contraturas articulares em diferentes comunidades sociais é altamente diversa e inclui fatores genéticos, Estados pós-traumáticos, doenças crônicas e imobilidade prolongada⁶. É amplamente aceito que a imobilidade é uma questão crítica no desenvolvimento da contratura conjunta adquirida⁷. Os povos que sofrem da contratura comum principal podem finalmente conduzir à inabilidade física⁸. Assim, um modelo animal estável e reprodutível é necessário para investigar os mecanismos patofisiológicos potenciais da contratura comum adquirida.

Os modelos de contratura de articulação de joelho induzida por imobilização atualmente construídos são alcançados principalmente utilizando moldes de gesso não invasivos, fixações externas e fixações internas. Watanabe et al. relataram a possibilidade do uso de imobilização gessada em articulações do joelho de ratos⁹. Usando um revestimento especial, um lado da junção do membro mais baixo do rato é imobilizado por um molde. A articulação do joelho do rato pode permanecer completamente flexiada sem nenhum traumatismo cirúrgico^10,11. No entanto, tanto os movimentos da articulação do quadril como do tornozelo também são afetados por esta forma de imobilização, o que pode aumentar o grau de atrofia muscular no quadríceps femoral ou gastrocnêmio¹². Além disso, o edema e o congestionamento dos membros posteriores devem ser evitados substituindo o elenco em pontos de tempo estabelecidos, o que pode afetar a continuidade da imobilidade. Outro método aceito para o estabelecimento de um modelo de contratura da articulação do joelho está usando a fixação cirúrgica externa. Nagai et al. fio de Kirschner combinado e fio de aço em um fixador externo, que imobilizou a articulação do joelho para aproximadamente 140 ° de flexão¹³. Neste método, uma resina é usada para cobrir a superfície para evitar arranhões na pele. Embora a imobilização da fixação externa seja robusta e confiável^14,15, as faixas percutâneas do pino do fio de Kirschner podem aumentar o risco de infecção¹⁶. Em nossa própria experiência, usar a técnica de fixação externa pode reduzir a atividade diária de ratos devido a um aumento no comportamento de lamber condicionado.

Alternativamente, Trudel et al. descreveram um modelo bem aceito de contratura articular na articulação do joelho de ratos com base em uma fixação cirúrgica interna¹⁷ (este método foi modificado a partir do usado por Evans e colegas¹⁸). Notavelmente, este método destaca a importância de se utilizar uma técnica de miniincisão para minimizar as feridas cirúrgicas. O desenvolvimento eficiente da contratura articular tem sido comprovado neste modelo¹⁹. Entretanto, o protocolo em como executar uma dissecção mínima para expor a superfície do osso é ainda obscuro²⁰. Também, a posição exata onde o parafuso está perfurando não é compreendida inteiramente. A implantação da fixação interna por via subcutânea ou submuscular ainda é controversa²¹. Para resolver estes problemas, nós modificamos este método incluindo um modus de separação apropriado do músculo-Gap, que permita uma exposição mini-invasora da superfície do osso e a colocação da implantação através de um canal submuscular. Este protocolo conduziu à reabilitação postoperative rápida nos ratos após a cirurgia. Os animais desenvolveram uma amplitude de movimento articular limitada após imobilização articular, o que foi consistente com alterações morfológicas da aderência capsular obtidas a partir da análise histológica. Nós igualmente descrevemos uma posição possível exata dos parafusos perfurados como confirmado pela análise do raio X ou pela análise do Micro-CT. Assim, este estudo objetivou descrever em detalhe uma técnica minimamente invasiva em um modelo de contratura de articulação do joelho que foi estabelecido por um modus de separação músculo-Gap combinado com um método de miniincisão. Nós acreditamos que as técnicas minimamente invasoras podem ambos reduzir o traumatismo animal e imitar eficazmente o processo patológico da contratura comum da flexão.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo terceiro hospital afiliado da Sun Yat-Sen Universidade de cuidados de animais institucionais e Comitê de uso (número de permissão: 02-165-01). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes da chegada.

1. preparação pré-operatória

Nota: a Figura 1 mostra o delineamento do procedimento cirúrgico.

1. Imobilizar rigidamente a articulação do joelho com uma placa plástica e dois parafusos metálicos a aproximadamente 135 ° de flexão.
   Nota: Realize a cirurgia no fêmur proximal e na tíbia distal sem violar o componente articular.
2. Preparar materiais e instrumentos para fixação interna.
   1. Construa uma placa plástica do polypropylene da classe médica cortando uma seringa de 5 mL (Figura 2a) usando uma tesoura cirúrgica para caber as seguintes dimensões: comprimento, 25 milímetros; largura, 10 mm; espessura, 1 mm (Figura 2b). Alise o perímetro da placa com um bisturi verticalmente. Lave a placa com soro fisiológico estéril para lavar os detritos por três vezes.
      1. Esterilizar com 75% de etanol por 4 h seguido de irradiar com luz ultravioleta por 3 h.
   2. Furos de pré-perfuração na placa plástica: Prepare uma broca elétrica de baixa velocidade à mão com uma velocidade de cerca de 0-4000 rpm (Figura 2C). Faça dois furos em ambas as extremidades da placa, os diâmetros são de 1 mm e 0,9 mm, respectivamente (Figura 2D). Combine ambas as extremidades da chapa com parafusos M 1,4 mm x 8 mm e M 1,2 mm x 6 mm de aço, respectivamente (Figura 2e).
      1. Limpe com 75% etanol e esterilize com luz UV para 3 h antes de usar.
3. Prepare instrumentos cirúrgicos: 1 braçadeira hemostática reta do mosquito-tipo, 1 fórceps curvado liso, 2 retratores da pálpebra, 1 agulha-suporte, 1 fórceps do tecido, 1 tesoura da sutura, 1 micro tecido Scissor e 1 Bisturi (Figura 2F). Esterilizar os instrumentos cirúrgicos por autoclavagem a 121,3 ° c por 20 min e secagem.
4. Animais experimentais
   1. Use os ratos machos Sprague-Dawley (ou Wistar) da classe esqueleticamente maduro (SPF), pesando entre 250-350 g no experimento.
      Nota: escolha ratos fêmeas ou machos para o experimento.
   2. Coloque os ratos em gaiolas e manter em um 12 h luz/12 h escuro ciclo-controlado sala de laboratório. Forneça o alimento e a água adequados.

2. cirurgia

1. Ajuste a temperatura. Coloc uma almofada de aquecimento em uma plataforma cirúrgica em uma sala de operação termostática.
2. Anestesia e preparação da pele
   1. Pesar o rato com uma balança electrónica e gravar.
   2. Contenha o rato e realize uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (30 mg/kg) para anestesia induzida. Avaliando que o animal está suficientemente anestesiado com a pinça do dedo do pé²². Administrar os olhos com lubrificante para proteger a córnea da secagem durante a cirurgia.
   3. Raspar o corpo inferior do rato, incluindo os dois membros traseiros com uma tosquiadeira elétrica e desinfectar com uma tintura de iodo povidona duas vezes e 75% etanol três vezes.
   4. Coloc o rato lateralmente, e cubra com o Drape cirúrgico expondo um lado traseiro da perna e do quadril.
   5. Desinfete a área cirúrgica novamente com iodo povidona.
3. Imobilize a articulação do joelho com fixação interna usando uma técnica mini-invasiva.
   Nota: manter a incisão adequadamente húmida com soro fisiológico estéril durante a operação. A cirurgia geralmente requer dois cirurgiões.
   1. Marque a direção da incisão da pele. Na extremidade distal do trocânter maior do fêmur, traçar uma linha ao longo da projeção de superfície do corpo da lacuna muscular entre o vasto vasto lateral e bíceps femoral (Figura 3a). Incise a pele da epiderme ao longo da linha de desenho aproximada 1,5 cm (Figura 3B).
   2. Dissecar bluntly a abertura do músculo entre vasto vasto lateral e bíceps femoral com um fórceps do tecido até que o eixo femoral esteja exposto aproximadamente 1 cm do comprimento (Figura 3C). Use o retractor para facilitar a separação contínua da lacuna muscular.
   3. Incise a pele da epiderme aproximada de 1 cm ao longo da projeção da superfície do corpo da lacuna muscular entre os tibial anterior e fibular longo na extremidade inferior distal (Figura 3D). Dissecar sem rodeios a lacuna muscular até que a tíbia seja exposta aproximadamente 1 cm de comprimento (Figura 3E).
   4. Separe os tecidos moles pelo retractor e pelo fórceps liso, mantenha perpendicular e perfure um furo do diâmetro de 1,0 milímetros no eixo femoral em uma velocidade de 1.500 rpm usando uma broca elétrica (Figura 3F). A posição apropriada da perfuração é aproximada 8 milímetros abaixo da borda mais baixa do trocânter maior. Pressione rapidamente a ferida para parar de sangrar.
      Nota: o diâmetro apropriado da perfuração pode evitar fraturas Intraoperatórias.
   5. Perfurar um furo de 0,9 mm de diâmetro na tíbia aproximada 4 mm abaixo da borda da fusão tibiofibular (figura 4a). Realize a perfuração com cuidado para evitar o esmagamento dos músculos ou tendões.
   6. Use a braçadeira hemostática reta do mosquito-tipo para dar forma a um curso submuscular do furo da tíbia ao furo do fêmur. O túnel submuscular passa abaixo do gastrocnêmio na extremidade da tíbia e acima do medius do glúteo, abaixo do bíceps femoral na extremidade do fémur.
   7. Utilize um parafuso de aço de M 1,4 mm x 8 mm para fixar uma extremidade da placa plástica (com o orifício de 1,0 mm de diâmetro) no fêmur proximal (Figura 4B). Utilize um parafuso de aço de M 1,2 mm x 6 mm para fixar outra extremidade da placa plástica (com o orifício de 0,9 mm de diâmetro) na tíbia distal (Figura 4C). Assegure a articulação do joelho sem deformidade em varo.
4. Fechar a ferida: sutura da Miofascia, FASCIAE profunda e tecido subcutâneo usando 4-0 Suturas absorvíveis (Figura 4D). Feche a pele com suturas de poliamida (Figura 4F).

3. gestão pós-operatória

1. Aplicar analgesia pós-operatória por injeção subcutânea de buprenorfina (0, 3 mg/mL) a 0, 5 mg/kg. Adicionar 5 mg/mL de neomicina em água potável durante 5 dias após a cirurgia.
2. Injete a mistura de analgesia (buprenorfina e carprofeno) respectivamente em 0,05 mg/kg e 5 mg/kg por via subcutânea duas vezes por dia durante pelo menos 72 horas após a operação.
3. Verific se o membro traseiro teve o excesso-edema em caso da lesão vascular. Certificou-se de que os ratos podem andar normalmente no caso de ferimento do nervo durante a cirurgia.

4. exame pós-operatório

1. Observe a cicatrização da incisão cirúrgica e examine fisicamente a articulação do joelho para avaliar os sinais precoces da infecção a cada outro dia no pós-operatório. Verific o grau de inchamento do tornozelo e da junção metacarpophalangeal em caso do edema contínuo.
   Nota: a infecção pós-operatória precoce pode causar exsudato da ferida, inchaço das pernas e cicatrização tardia da ferida.
2. Realize a imagem latente do raio X do hindmembro para assegurar-se de que coloc corretamente os parafusos no primeiro dia postoperative.
   Nota: uma análise de varredura Micro-CT é outra opção alternativa para exibir a localização adequada e a direção dos parafusos de aço.
3. Meça a amplitude de movimento passiva (ADM) para avaliar o desenvolvimento da contratura. Tome uma medida da ROM da junção do joelho em coortes diferentes do tempo postoperatively como descrito previamente²⁰.
   1. Em suma, eutanizar os ratos e a pele dos membros posteriores. Retire o imobilizador e meça o ângulo da articulação do joelho usando um artrómetro mecânico em dois torques (667 ou 1.060 g/cm)²³.
   2. Calcule a ADM como resultado da contratura total, da contratura miogênica e da contratura artrogênica separadamente com base nos objetivos de investigação²⁴.
      Nota: definir diferentes coortes de tempo (i.e., 1, 2, 4, 8, 16 e 32 semanas) de acordo com os objetivos da pesquisa. A articulação do joelho contralateral (não operatória ou Sham-operated) pode servir como controle².
4. Análise histológica das cápsulas da articulação do joelho do posterior.
   1. Prepare os tecidos articulares. Dissecar o tecido articular do joelho e corrigi-lo com 4% paraformaldeído. Descalcificar e inseri-lo em parafina como relatado anteriormente²⁵. Corte as secções (5 μm) no nível médio-côndilar medial no plano sagital.
      Nota: opte por realizar diferentes manchas de avaliação, incluindo ele, aldeído-fuchsin-Masson Goldner (AFMG), elastica – Masson, ou coloração imuno-histoquímica para estudo histológico na cápsula articular com base em seus objetivos de estudo^15, a ²⁶.
   2. Observar alterações histomorfométricas nas cápsulas da articulação do joelho posterior. Fotografe a região posterior da articulação do joelho. Observar a deposição fibrosa e as alterações de aderência entre a junção diáfise-sinovium e o menisco⁶.
      Nota: as alterações patológicas da cápsula articular são consideradas um fator patogénico para a contratura da articulação do joelho. Meça o comprimento, a espessura, e as áreas capsular da cápsula do posterior como descrito previamente de acordo com o índice²⁷da pesquisa.

Resultados

Nós observamos que os ratos receberam a cirurgia mìnima invasora podem retornar à dieta regular apenas um dia postoperatively. Em particular, a incisão cirúrgica tem cicatrizes sem exsudato (Figura 5a). O inchaço do tornozelo e as articulações metacarpofalangeanas no membro posterior operatório praticamente desapareceram dois dias após o pós-operatório (Figura 5b) quando comparados com o lado contralateral (

Discussão

Este estudo objetivou elucidar um método de imobilização da articulação do joelho passo a passo utilizando uma técnica mini-invasiva que permite a rápida reabilitação pós-operatória em animais após a cirurgia. Convencionalmente, a aproximação da separação do músculo-Gap é pensada para ser uma técnica minimamente invasora na cirurgia ortopédica. Como esperado, verificou-se que os ratos podem retornar a uma dieta normal e atividades apenas um dia no pós-operatório, o que foi consistente com o estudo a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anerdian	Shanghai Likang Ltd.	310173	antibacterial
Buprenorphine	Shanghai Shyndec Pharmaceutical Ltd.	/	analgesia
Carprofen	MCE	HY-B1227	analgesia
Cross screwdriver	STANLEY	PH0*125mm	tighten the screws
Electric drill	WEGO	185	drill hole(with stainless steel drill 0.9mm;1.0mm)
Microsurgical instruments	RWD	/	Orthopaedic surgical instruments for animals
Neomycin	Sigma	N6386	antibacterial
Sodium pentobarbital	Sigma	P3761	anaesthetize
Stainless Steel screws	WEGO	m1.4*8; m1.2*6	screw(part of internal fixation)
Syringe	WEGO	3151474	use for plastic plate(part of internal fixation)
μ-CT	ALOKA	Latheta LCT-200	in vivo CT scan