ラットの固定化誘発膝屈曲収縮を研究するための小型侵襲的内部固定技術

要約

ここでは、ラットモデルにおける膝関節固定化のための最小限に侵襲的な技術を説明するプロトコルを提示する。この再現可能なプロトコルは、筋肉ギャップ分離様式およびミニ切開スキルに基づいて、獲得された関節収縮の基礎となる分子機構の研究に適している。

要約

関節収縮は、長期の関節固定化に起因し、整形外科における一般的な合併症である。現在、膝関節の可動性を制限する内部固定を利用することは、実験的な拘縮を生成するために広く受け入れられているモデルである。しかし、移植アプリケーションは必然的に動物に外科的外傷を引き起こす。より侵襲性の低いアプローチを開発することを目指して、我々は、外科的処置の間に以前に報告されたミニ切開のスキルと筋肉ギャップ分離のモダスを組み合わせた:2つのミニ皮膚切開は、横腿と脚に行われ、続いて筋肉ギャップを行った骨表面を露出させる分離。ラット膝関節は、本質的な神経や血管を妨害することなく、約135°膝屈曲で事前に構築された内部固定によって徐々に固定化された。予想通り、この簡単な技術は動物の急速な術後のリハビリテーションを可能にする。内部固定の正しい位置はX線かマイクロCTスキャン分析によって確認された。運動の範囲は、このモデルの有効性を実証する反対膝関節で観察されるものよりも固定化された膝関節で有意に制限された。また、組織学的分析は、時間の経過とともに後部優れた膝関節カプセルにおける線維性沈着および付着の発達を明らかにした。したがって、この小型侵襲的モデルは、固定化された膝関節収縮の発達を模倣するのに適してもよい。

概要

関節収縮は、直径関節1、2のパッシブ範囲の運動(ROM)の制限として定義される。関節収縮を予防し、治療することを目指す現在の治療法は、いくつかの成功を達成しています^3,4.しかし、獲得した関節拘縮の基礎となる分子機構は、ほとんど不明5.異なる社会共同体における関節収縮の病因は非常に多様であり、遺伝的要因、外傷後状態、慢性疾患、および長期の不動6を含む。取得した共同契約7の開発において、不動性が重要な問題であると広く受け入れられている。主要な関節収縮に苦しむ人々は、最終的に身体障害8をもたらす可能性があります。したがって、獲得した関節拘縮の潜在的な病態生理学的メカニズムを調べるための安定で再現可能な動物モデルが必要である。

現在造られた固定化誘発膝関節収縮モデルは非侵襲的な石膏鋳造物、外的な固定および内部固定を利用することによって主に達成される。渡辺らは、ラット膝関節に石膏キャスト固定化の可能性を報告^した9.特別なジャケットを着用することにより、ラットの下肢関節の片側が鋳造物によって固定される。ラット膝関節は、外科的外傷10、11なしで完全に屈曲したままにしておくことができます。しかし、股関節と足首の関節の動きもこの形態の固定化の影響を受け、四頭筋大腿骨または胃炎12における筋萎縮の程度を増加させる可能性がある。さらに、後肢の上血腫および輻輳は、不動の連続性に影響を与える可能性のある設定された時点でキャストを置き換えることによって避けなければならない。膝関節拘縮モデルの確立のためのもう一つの受け入れられた方法は、外部外科的固定を使用しています。Nagaiらはキルシュナーワイヤーとスチールワイヤーを外部固定器に組み合わせ、膝関節を約140°の屈^曲13に固定した。この方法では、樹脂を使用して表面を覆い、皮膚の傷を防ぎます。外部固定固定固定は堅牢で信頼性が高い14、15、経皮的キルシュナーワイヤピントラックは感染のリスクを高める可能性^{があります16.}私たち自身の経験では、外部固定技術を使用すると、条件付きなめる行動の増加に起因するラットの毎日の活動を減少させる可能性があります。

あるいは、Trudel et al.は、外科的内部^固定17に基づくラット膝関節における関節収縮のよく受け入れられたモデルを説明した(この方法は、Evansおよび^同僚18によって使用されるものから改変された)。特に、この方法は、外科的創傷を最小限に抑えるためにミニ切開技術を利用することの重要性を強調する。共同拘縮の効率的な開発は、この^モデル19で証明されています。しかし、骨表面を露出させる最小限の解剖を行う方法に関するプロトコルは、依然として不明^である20.また、ネジが掘削される正確な位置は十分に理解されていません。皮下または筋肉下の方法を介した内部固定の移植は、依然として論争の的^である21.これらの問題を解決するために、骨表面の小侵襲的な露出と筋肉チャネルを介した移植の配置を可能にする適切な筋肉ギャップ分離モダスを含めることによって、この方法を修正しました。このプロトコルは、手術後のラットの迅速な術後リハビリテーションにつながった。動物は、関節固定後の運動の限られた関節範囲を開発しました, これは、組織学的分析から得られたカプセル接着の形態的変化と一致しました.また、X線解析またはマイクロCT解析で確認した掘削ねじの正確な位置についても説明します。そこで本研究は、筋ギャップ分離法とミニ切開法を組み合わせた筋ギャップ分離法によって確立された膝関節収縮モデルにおける最小限侵襲的手法を詳細に説明することを目的とした。我々は、最小限に侵略的な技術は、動物の外傷を減らし、関節屈曲収縮の病理学的プロセスを効果的に模倣することができると信じています。

プロトコル

すべての手順は、実験動物のケアと使用のためのガイドに従って行われ、サンヤットセン大学の第三付属病院によって承認されました (許可番号: 02-165-01).すべての動物実験はARRIVEガイドラインに従って行われた。

1. 術前の準備

注:図1は、外科的処置の設計を示す。

1. 約135°の屈曲でプラスチック板および2つの金属ねじによって膝の接合箇所を堅く固定する。
   注:関節成分に違反することなく、近位大腿骨と遠位脛骨で手術を行います。
2. 内部固定のための材料および器械を準備する。
   1. 次の次元に合うように外科はさみを使用して5 mLの注射器(図2a)を切断することによって医学等級のポリプロピレンプラスチック版を作る:長さ、25のmm;幅、10ミリメートル。厚さ、1 mm (図 2b)。プレートの周囲をメスで垂直に滑らかにします。生理生理生理知でプレートを洗い流し、破片を3回洗い流します。
      1. 75%エタノールを4時間殺菌し、その後3時間紫外線を照射します。
   2. プラスチック板のプレドリル穴:約0-4000 rpm(図2c)の速度で手持ち型低速電気ドリルを準備します。プレートの両端に2つの穴を開け、直径はそれぞれ1mmと0.9mmです(図2d)。プレートの両端を M 1.4 mm x 8 mm、M 1.2 mm x 6 mm のスチール ネジをそれぞれ使用します(図2e)。
      1. 75%のエタノールで拭き取り、使用前に3時間UV光で殺菌します。
3. 手術器具を準備する:1つのまっすぐな蚊型止血クランプ、1つの滑らかな湾曲した鉗子、2つのまぶたのリトラクタ、1つの針ホルダー、1つのティッシュ鉗子、1つの縫合はさみ、1マイクロティッシュはさみおよび1メス(図2f)。121.3 °Cでオートクレーブで20分間の乾燥と乾燥によって外科器具を殺菌する。
4. 実験動物
   1. 特定病原体フリー(SPF)グレードの骨格的に成熟した雄スプラーグドーリー(またはウィスター)ラットを使用し、実験で250〜350gの間の重量を量る。
      注:実験のために雌または雄のラットのいずれかを選択します。
   2. ラットをケージに入れ、12時間の光/12h暗いサイクル制御の実験室に保管してください。十分な食料と水を提供する。

2. 手術

1. 温度を調整します。サーモスタット手術室の外科プラットホームの上に暖かいパッドを置く。
2. 麻酔と皮膚の調製
   1. ラットを電子スケールと記録で計量します。
   2. ラットを抑制し、誘発麻酔にペントバルビタールナトリウム(30 mg/kg)の食後注射を行う。動物がつま先^ピンチ22を用いて十分に麻酔されていることを評価する。手術中に角膜が乾燥するのを防ぐために潤滑剤で目を管理します。
   3. 電気バリカンで2つの後肢を含むラットの下半身を剃り、ポビドネヨウ素のチンキで2回、75%エタノールを3回消毒する。
   4. ラットを横に置き、片側の後ろ足と股関節を露出させる外科ドレープで覆います。
   5. ポビドネヨウ素で再び外科領域を消毒する。
3. ミニ侵襲的な技術を使用して内部固定と膝の関節を固定する。
   注:手術中に無菌生理生理で適切に湿った切開を保ちます。外科手術は通常2人の外科医を必要とする。
   1. 皮膚切開の方向をマークします。大腿骨より大きなトロチャンターの遠位端で、広大な横子と二頭筋大腿骨の間の筋肉ギャップの体表面投影に沿って線を引く(図3a)。約1.5cm(図3b)の描画線に沿って表皮を切開する。
   2. 大腿骨の軸が長さ約1cm露出するまで、組織鉗子で大腿骨と二頭筋の間の筋肉のギャップを率直に解剖する(図3c)。リトラクタを使用して、筋肉のギャップを連続的に分離します。
   3. 脛骨前肢と線維症の間の筋差の体表面投影に沿って表皮を約1cm切開する(図3d)。脛痛が露出するまで筋肉の隙間を率直に解剖する(図3e)。
   4. リトラクタと滑らかな鉗子によって柔らかいティッシュを分離し、垂直に保ち、電気ドリルを使用して1,500 rpmの速度で大腿骨シャフトに1.0mmの直径の穴を開けます(図3f)。適切な掘削位置は、より大きなトロチャンターの下端より約8mm下です。創傷を素早く押して出血を止める。
      注:適切な掘削直径は、術中骨折を回避することができます。
   5. 脛骨融合の縁の下の約4mmの脛骨に直径0.9mmの穴を1つドリルします(図4a)。筋肉や腱の破砕を防ぐために慎重に掘削を行います。
   6. まっすぐな蚊型止血クランプを使用して、脛骨穴から大腿骨の穴に筋肉の下のコースを形成します。皮下トンネルは脛骨端の胃腸骨の下を通過し、大腿骨の二頭筋大腿骨の下に、大腿骨の下の臀部メディウスの上を通過する。
   7. 近位大腿骨のプラスチック板の一端(直径1.0mmの穴付き)を固定するには、M 1.4 mm x 8 mm のスチール ネジを 1 本使用します(図4b)。遠位脛骨(図4c)のプラスチック板の別の端(直径0.9mmの穴付き)を固定するには、1本のM 1.2 mm x 6 mmのスチールネジを使用します。変態のない膝関節を確保します。
4. 創傷を閉じる:4-0吸収性縫合糸を使用して筋筋膜、深筋膜、皮下組織を縫合する(図4d)。ポリアミド縫合糸で肌を閉じます(図4f)。

3. 術後管理

1. 0.05 mg/kg でブプレノルフィン (0.03 mg/mL) の皮下注射を介して術後鎮鎮薬を適用します。.手術後5日間飲料水に5mg/mLネオマイシンを加えます。
2. 鎮鎮薬混合物(ブプレノルフィンとカルプロフェン)をそれぞれ0.05mg/kgと5mg/kgを皮下に1日2回、少なくとも72時間の術後に注入する。
3. 血管損傷の場合、後肢に過剰な経腫があったかどうかを確認します。ラットが手術中に神経損傷の場合に正常に歩くことができることを確認しました。

4. 術後検査

1. 外科的切開の治癒を観察し、術後1日おきに感染の早期徴候を評価するために膝関節を物理的に検査する。連続性浮腫の場合は、足首とメタカルポパランガル関節の腫れの程度を確認してください。
   注:早期術後感染は、創傷の排泄物、脚の腫脹、および創傷治癒の遅延を引き起こす可能性がある。
2. 後肢のX線イメージングを実行して、最初の術後の日にネジを正しく配置していることを確認します。
   注:マイクロCTスキャン解析は、スチールネジの適切な位置と方向を表示する別のオプションです。
3. パッシブモーション範囲(ROM)を測定して、収縮の発達を評価します。前述^の20のように、術後の異なる時間コホートで膝関節ROM測定を取る。
   1. 簡単に言えば、ラットを安楽死させ、後肢を皮膚にする。イモビライザーを取り外し、2つのトルク(667または1,060 g/cm)23で機械的なアートロメーターを使用して膝関節角度を測定します。
   2. 調査^目的24に基づいて、総拘縮、筋原性拘縮、および関節収縮の結果としてROMを計算する。
      注:研究目標に従って異なる時間コホート(すなわち、1、2、4、8、16、および32週間)を設定します。反対の膝関節(非手術またはシャム操作)は、^{コントロール2}として機能することができます。
4. 後膝関節カプセルの組織学的解析
   1. 関節組織を準備します。膝関節組織を解剖し、4%のパラホルムアルデヒドで固定します。以前に報告^された25のように、デカール化し、パラフィンに埋め込む.矢状面の中間中間中間濃度で断面(5μm)を切ります。
      注:HE、アルデヒド・フクシン・マッソン・ゴールドナー(AFMG)、エラスティカ・マッソン、または研究目的に基づく関節カプセルにおける組織学的研究のための免疫組織化学染色を含む異なる評価染色を行うことを選択します^{15, 26}.
   2. 後膝関節カプセルのヒストモルフォメトリック変化を観察する。膝関節の後部領域を撮影します。ジアフィシス・シノビウム接合部とメニスカス6との間の線維性沈着および接着変化を観察する。
      注:関節カプセルの病理学的変化は、膝関節収縮の病原性因子であると考えられている。研究^内容27に従って前述したように後カプセルの長さ、厚さ、およびカプセル領域を測定する。

結果

我々は、最小限に侵襲的な手術を受けたラットが術後わずか1日で通常の食事に戻ることができることを観察した。特に、外科的切開は、外気を持たずに瘢痕化している(図5a)。術後部肢における足首およびメタカルポパランゲアル関節の腫れは、術後2日目にほぼ完全に消失している(図5b)。初期感染の...

ディスカッション

本研究は、手術後の動物の迅速な術後リハビリテーションを可能にする小型侵襲的手法を用いて、段階的な膝関節固定化法の解明を目指した。従来、筋ギャップ分離アプローチは整形外科において最小限に侵襲的な技術であると考えられている。予想通り、ラットは手術後1日で通常の食事と活動に戻ることができることがわかった。さらに、手術後に動脈や神経損傷は起こらず、筋ギャップ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anerdian	Shanghai Likang Ltd.	310173	antibacterial
Buprenorphine	Shanghai Shyndec Pharmaceutical Ltd.	/	analgesia
Carprofen	MCE	HY-B1227	analgesia
Cross screwdriver	STANLEY	PH0*125mm	tighten the screws
Electric drill	WEGO	185	drill hole(with stainless steel drill 0.9mm;1.0mm)
Microsurgical instruments	RWD	/	Orthopaedic surgical instruments for animals
Neomycin	Sigma	N6386	antibacterial
Sodium pentobarbital	Sigma	P3761	anaesthetize
Stainless Steel screws	WEGO	m1.4*8; m1.2*6	screw(part of internal fixation)
Syringe	WEGO	3151474	use for plastic plate(part of internal fixation)
μ-CT	ALOKA	Latheta LCT-200	in vivo CT scan