Preparación de la médula ósea entera para el análisis de citometría de masa de células de linaje neutrófilo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para procesar la médula ósea fresca (BM) aislada del ratón o humana para el análisis de citometría de masa de alta dimensión (citometría por tiempo de vuelo, CyTOF) de células de linaje neutrófilo.

Resumen

En este artículo, presentamos un protocolo que está optimizado para preservar las células de linaje neutrófilo en BM fresco para el análisis completo de BM CyTOF. Utilizamos un panel CyTOF de 39 anticuerpos sesgado por mieloides para evaluar el sistema hematopoyético con un enfoque en las células de linaje neutrófilo mediante el uso de este protocolo. El resultado de CyTOF se analizó con un algoritmo de reducción dimensional de recursos abiertos, viSNE, y los datos se presentaron para demostrar el resultado de este protocolo. Hemos descubierto nuevas poblaciones celulares de linaje neutrófilo basadas en este protocolo. Este protocolo de preparación fresca de BM entera puede utilizarse para 1), análisis CyTOF para descubrir poblaciones celulares no identificadas de BM entera, 2), investigando defectos enteros de BM para pacientes con trastornos de la sangre como leucemia, 3), ayudando a la optimización de protocolos de citometría de flujo activado por fluorescencia que utilizan BM fresco y entero.

Introducción

En las últimas décadas, los métodos de citometría han sido una poderosa herramienta para investigar el sistema hematopoyético en el BM. Estos métodos incluyen la citometría de flujo activada por fluorescencia y el nuevo método de CyTOF utilizando anticuerpos etiquetados con metales pesados. Han dado lugar a descubrimientos de muchos tipos de células en una muestra biológica heterogénea mediante la identificación de sus perfiles únicos de expresión de marcadores de superficie. El aumento de las superposiciones de espectro que se asocia con más canales conduce a una mayor inexactitud de los datos en aplicaciones de citometría de flujo activada por fluorescencia. Por lo tanto, las células no deseadas se eliminan rutinariamente con el fin de enriquecer las poblaciones celulares de interés para el análisis de citometría de flujo activado por fluorescencia. Por ejemplo, Ly6G (o Gr-1) y CD11b se consideran marcadores de células mieloides maduras y las células Ly6G⁺ (o Gr-1⁺) y CD11b⁺ se eliminan rutinariamente de las muestras de BM mediante el uso de kits de enriquecimiento magnético antes del análisis de citometría de flujo de células hematopoyéticas de tallo y progenitoras (HSCCP) o combinando estos marcadores en un canal de cóctel de volcado^1,2,3. Otro ejemplo es que los neutrófilos se eliminan rutinariamente de la muestra de sangre humana para enriquecer las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para estudios inmunológicos. Sin embargo, la médula ósea entera aislada del ratón o del ser humano rara vez se investiga intacta para el análisis de citometría.

Recientemente, CyTOF se ha convertido en una herramienta revolucionaria para investigar el sistema hematopoyético^4,5,6. Con CyTOF, los anticuerpos etiquetados con fluoróforos son reemplazados por anticuerpos etiquetados con reportero de elementos pesados. Este método permite la medición de más de 40 marcadores simultáneamente sin la preocupación de la superposición de espectro. Ha permitido el análisis de muestras biológicas intactas sin pasos previos al agotamiento o un canal de descarga. Por lo tanto, podemos ver el sistema hematopoyético de forma exhaustiva con dimensionalidad de alto contenido a partir de las gráficas de citometría de flujo 2D convencionales. Las poblaciones celulares omitidas en el pasado durante el proceso de agotamiento o gating ahora pueden ser sacadas a la luz con los datos de alta dimensión generados por CyTOF^4,5. Hemos diseñado un panel de anticuerpos que mide simultáneamente 39 parámetros en el sistema hematopoyético con un enfoque en el linage mieloide⁷. En comparación con los datos convencionales de citometría de flujo, la interpretación y visualización de los datos de alta dimensión de una sola célula sin precedentes generados por CyTOF es un reto. Científicos computacionales han desarrollado técnicas de reducción de dimensionalidad para la visualización de conjuntos de datos de alta dimensión. En este artículo, usamos el algoritmo, viSNE, que utiliza la técnica t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) para analizar los datos CyTOF y presentar el resultado de alta dimensión en un mapa de 2 dimensiones mientras se conserva la estructura de alta dimensión de los datos^8,9,10. En la gráfica tSNE, las celdas similares se agrupan en subconjuntos y el color se utiliza para resaltar la entidad de las celdas. Por ejemplo, en la Figura 1 las celdas mieloides se distribuyen en varios subconjuntos de celdas en función de las similitudes de sus patrones de expresión de 33 marcadores de superficie resultantes de CyTOF (Figura1)⁴. Aquí investigamos la médula ósea del ratón con nuestro panel CyTOF de 39 marcadores previamente reportado por el análisis de viSNE⁷. El análisis viSNE de nuestros datos CyTOF reveló una población celular no identificada que mostró características de HSPC (CD117⁺) y neutrófilos (Ly6G⁺) (Figura2)⁷.

En conclusión, presentamos un protocolo para procesar la médula ósea entera fresca para el análisis de CyTOF. En este artículo, utilizamos la médula ósea de ratón como ejemplo, mientras que este protocolo también se puede utilizar para procesar muestras de médula ósea humana. Los detalles específicos de las muestras de médula ósea humana también se observan en el protocolo. La ventaja de este protocolo es que contiene detalles como el tiempo de incubación y la temperatura que fueron optimizados para preservar las células de linaje neutrófilo en toda la médula ósea para permitir la investigación en la médula ósea entera intacta. Este protocolo también se puede modificar fácilmente para aplicaciones de citometría de flujo activada por fluorescencia.

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Protocolo

Todos los experimentos siguieron las directrices aprobadas del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto La Jolla para la Alergia e Inmunología, y la aprobación para el uso de roedores se obtuvo del Instituto La Jolla para la Alergia y la Inmunología de acuerdo con los criterios descritos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Cosecha de médula ósea del ratón (BM)

1. Compre ratones C57BL/6J de un proveedor comercial. Alimente la dieta estándar de comida para roedores y manifieste en jaulas de microisolator en una instalación libre de patógenos.
2. Utilice ratones machos, de 6 a 10 semanas de edad, con fines experimentales. Eutanasia por inhalación de CO2 seguida de la luxación cervical.
3. Coloque el ratón sobre una almohadilla quirúrgica estéril con el lado del abdomen hacia arriba. Esterilice la piel del abdomen y el área de las extremidades posteriores pulverizando 70% de etanol. Use un par de tijeras quirúrgicas de diselación para abrir la cavidad abdominal.
4. Retire la piel para exponer las extremidades posteriores. Usa un par de fórceps de apósito de punta contundente para sujetar la tibia del ratón justo debajo del tobillo. Usa otro par de fórceps de vendaje curvo para estabilizar la tibia debajo de los fórceps de apósito de punta roma. Romper la tibia y exponer el hueso arrancando el músculo con los fórceps de apósito de punta roma.
   NOTA: La tibia está unida holgadamente a la articulación de la rodilla y se puede elegir fácilmente mediante el uso de los fórceps de apósito de punta contundente.
5. Coloque la tibia en frío 1x PBS.
6. A continuación, mueva los fórceps de apósito curvo estabilizador hacia abajo hasta el fémur. Deslice los fórceps de apósito de punta contundente por debajo de la articulación de la rodilla y sostenga la rótula. Disloque la rótula tirando suavemente hacia arriba. Exponer el fémur arrancando el músculo unido a la rótula. Sostenga el fémur expuesto por los fórceps de apósito curvo y corte el fémur desde la parte inferior del hueso usando tijeras quirúrgicas disecantes.
7. Coloque el fémur en frío 1x PBS.
8. Haga un agujero en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml con una aguja de 18 G.
9. Coloque la tibia y el fémur en el mismo tubo de microcentrífuga de 0,5 ml con el extremo abierto de los huesos mirando hacia abajo hacia el agujero.
10. Coloque el tubo de 0,5 ml que contiene la tibia y el fémur en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
11. Gire los tubos de doble capa que contienen tibia y fémur a 5.510 x g durante 30 s en la microcentrífuga.
12. Asegúrese de que el BM se extrae de los huesos y se peletó en la parte inferior del tubo. Revuelve el tubo de 0,5 ml que contiene los huesos sagrados. El ratón BM está listo para los siguientes pasos.
    NOTA: La BM humana se cosecha a recursos clínicos como se describió anteriormente¹¹.

2. Células de mancha BM para CyTOF

1. Resuspenda el BM en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC). Para BM humano, resuspenda toda la BM en un volumen 10x de 1 búfer de lisis de glóbulos rojos (RBC). Incubar durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
2. Gire el tubo a 350 x g durante 5 min a 4 oC. Para BM humano, repita los pasos 2.1 y 2.2 antes de continuar con el paso 2.3.
3. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y dejar el pellet sin interrupciones. Resuspenda el pellet con 1 ml de frío 1x PBS. Filtrar el pellet en un tubo cónico de 15 ml a través de un colador de células de 70 m. Las células BM ahora están completamente aisladas en el tubo de los restos musculares y óseos. Lave las células añadiendo 9 ml de frío 1x PBS en el tubo.
4. Gire el tubo de 15 ml a 350 x g durante 5 minutos a 4 oC.
5. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender las células BM con PBS frío de 10 ml. Tome una alícuota de células para contar. Cuente las células usando un hemocaquítómetro.
6. Células Aliquot 5 x 10⁶ BM en un nuevo tubo de 15 ml para la tinción CyTOF.
7. Gire la alícuota del tubo de 15 ml a 350 x g durante 5 min a 4 oC.
8. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender las células BM con 125 nM cisplatino en 1 mL de tampón de tinción CyTOF como indicador de viabilidad para la muestra. Incubar durante 5 min a RT.
9. Después de la incubación, añadir 4 ml de tampón de tinción CyTOF al tubo. Gire el tubo a 350 x g durante 5 min a 4 oC. Para BM humano, agregue un 10% de suero AB humano en el tampón de tinción CyTOF.
10. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender las células BM con 50 sl de solución de bloqueo del receptor Fc. Incubar durante 10 min a 4oC. Omita este paso para BM humano.
11. Añadir 50 l del cóctel de anticuerpos CyTOF casero⁵ a la muestra para que el volumen total de tinción sea de 100 l. Pipeta suave mente para mezclar. Incubar durante 30 min a 4oC. El volumen final del cóctel de anticuerpos es de 100 l tanto para muestras de BM de ratón como para BM humanas.
12. Añadir 2 ml de tampón de tinción CyTOF a cada tubo después de la incubación para lavar las células, girar el tubo a 350 x g durante 5 min a 4 oC.
13. Repita el paso 2.12 para un total de dos lavados.
14. Prepare una solución de formaldehído fresco del 1,6% a partir de la ampolla de stock del 16%. Diluir 1 parte del formaldehído de stock con 9 partes de 1x PBS.
15. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el pellet con 1 ml de solución fresca 1.6% FA. Incubar durante 15 min a RT.
16. Gire el tubo a 800 x g durante 5 min a 4 oC.
17. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el pellet celular con una solución de intercalación de 125 nM en búfer de 1 ml de corrección/perm.
18. Incubar la muestra en solución de intercalación durante la noche a 4oC.

3. Preparar células para la adquisición de CyTOF

1. Presione suavemente las células de vórtice y espín a 800 x g durante 5 min a 4 oC.
2. Lave las células añadiendo 2 ml de tampón de tinción CyTOF, espíe las células a 800 x g durante 5 min a 4 oC y retire el sobrenadante por aspiración.
3. Resuspender las células en 1 ml de diH₂O. Reserve un pequeño volumen (aproximadamente 10 l) de cada tubo para contar las células.
4. Espíe las células a 800 x g durante 5 min a 4 oC.
5. Repita los pasos 3.3 y 3.4.
6. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y dejar las células en el pellet. Las células BM ya están listas para la resuspensión a la concentración de 1 x 10⁶ celdas/ml para la adquisición de CyTOF.

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Resultados

La Figura 1 se presenta como un resultado de ejemplo de los experimentos CyTOF. En esta gráfica tSNE, las celdas a través de varios tejidos de ratón se agruparon en subconjuntos en función de la similitud de sus perfiles de expresión de marcador de superficie medidos por un panel CyTOF de 33 parámetros. Las celdas con propiedades más similares se agrupaban automáticamente, como los neutrófilos, los macrófagos o los datos de dominio, basándose en la expresión de los 33 marcadores ...

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Discusión

En las últimas décadas, la citometría de flujo basada en fluorescencia se utilizó como método principal para estudiar linajes celulares y heterogeneidad^1,2,3. Aunque la citometría de flujo ha proporcionado datos multidimensionales, este método está limitado por las opciones de parámetros y la superposición espectral. Para superar la debilidad de la citometría de flujo aprovechamos CyTOF, que utiliza isótopos de metal...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF Antibodies (mouse)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y	Fluidigm	Cat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb	Fluidigm	Cat# 3176002B
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified	Biolegend	Cat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified	Biolegend	Cat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er	Fluidigm	Cat# 3166004B
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified	Biolegend	Cat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd	Fluidigm	Cat# 3148003B
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd	Fluidigm	Cat# 3142003B
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er	Fluidigm	Cat# 3167004B
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified	Biolegend	Cat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified	Biolegend	Cat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified	Biolegend	Cat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified	Biolegend	Cat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified	Biolegend	Cat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd	Fluidigm	Cat# 3146009B
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd	Fluidigm	Cat# 3156012B
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready	ThermoFisher	Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified	Biolegend	Cat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified	Biolegend	Cat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb	Fluidigm	Cat# 3159009B
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb	Fluidigm	Cat# 3174003B
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm	Fluidigm	Cat# 3169015B
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified	abcam	Cat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho	Fluidigm	Cat# 3165018B
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd	Fluidigm	(Clone H57-597)-143Nd
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
Antibody Stabilizer	CANDOR Bioscience	Cat# 130050
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	Cat# A4503
Cisplatin-194Pt	Fluidigm	Cat# 201194
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	ThermoFisher	Cat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	Cat# 00-4333-57
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	Cat# 201078
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	ThermoFisher	Cat# AM9260G
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	Cat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Saline solution	GE Lifesciences	Cat#SH30256.01
Intercalator-Ir	Fluidigm	Cat# 201192B
MAXPAR Antibody Labeling Kits	Fluidigm	http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	Cat# 158127
Sodium azide	Sigma-Aldrich	Cat# S2002
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Cat# X100
Trypsin EDTA 1x	Corning	Cat# 25-053-Cl
Experimental Model: Organism/Strains
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
Software Alogrithm
Bead-based Normalizer	Finck et al., 2013	https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
Cytobank	Cytobank	https://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0	Chen et al., 2016	https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNE	van der Maaten and Hinton, 2008	https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html