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요약

여기서, 우리는 호중구 계보 세포의 고차원 질량 세포측정 (비행 시간, CyTOF에 의한 세포 측정) 분석을 위해 마우스 또는 인간으로부터 분리 된 신선한 골수 (BM)를 처리하는 프로토콜을 제시한다.

초록

이 문서에서는, 우리는 전체 BM CyTOF 분석을 위한 신선한 BM에 있는 호중구 계보 세포를 보존하기 위하여 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 우리는 골수성 편향 된 39 항체 CyTOF 패널을 사용하여이 프로토콜을 사용하여 호중구 혈통 세포에 초점을 맞춘 조혈 시스템을 평가했습니다. CyTOF 결과는 오픈 리소스 차원 감소 알고리즘, viSNE로 분석되었고, 데이터는 이 프로토콜의 결과를 입증하기 위해 제시되었다. 우리는 이 프로토콜에 근거를 둔 새로운 호중구 혈통 세포 인구를 발견했습니다. 신선한 전체 BM 제제의 이 프로토콜은 1), 전체 BM에서 확인되지 않은 세포 집단을 발견하기 위해 CyTOF 분석을 위해 사용될 수 있습니다, 2), 백혈병과 같은 혈액 장애를 가진 환자를 위한 전체 BM 결점을 조사하는, 3), 의 최적화를 지원 신선한 전체 BM을 활용하는 형광 활성화 유동 세포 분석 프로토콜.

서문

지난 수십 년 동안, 세포 분석 방법은 BM의 조혈 시스템을 조사하는 강력한 도구되었습니다. 이러한 방법은 중금속 표지 항체를 사용하여 형광 활성화 유동 세포 분석 및 CyTOF의 새로운 방법을 포함한다. 그(것)들은 그들의 유일한 표면 마커 발현 단면도의 확인에 의하여 이기종 생물학 견본에 있는 많은 세포 모형의 발견으로 이끌어 냈습니다. 더 많은 채널과 관련된 스펙트럼 중복이 증가하면 형광 활성화 유동 세포 분석 애플리케이션에서 더 높은 데이터 부정확성이 발생합니다. 따라서, 불순한 세포는 형광 활성화 유동 세포 분석 분석을 위한 관심있는 세포 인구를 풍부하게 하기 위하여 일상적으로 제거됩니다. 예를 들어, Ly6G (또는 Gr-1) 및 CD11b는 성숙한 골수성 세포 마커로 간주되며 Ly6G+ (또는 Gr-1+) 및 CD11b+ 세포는 유세포 분석 전에 자기 농축 키트를 사용하여 BM 샘플에서 일상적으로 제거됩니다. 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC) 또는 하나의 덤프 칵테일 채널 1,2,3에이러한 마커를 결합하여. 또 다른 예는 호중구가 면역학 연구를 위한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 풍부하게 하기 위하여 인간적인 혈액 견본에서 일상적으로 제거된다는 것입니다. 마우스 또는 인간에서 격리된 전체 골수는, 그러나, 세포 측정 분석을 위해 손상되지 않는 조사되지 않습니다.

최근 CyTOF는 조혈 계 4,5,6을조사하는 혁신적인 도구가되었습니다. CyTOF를 사용하면 불소 표지 된 항체가 무거운 원소 리포터 표지 된 항체로 대체됩니다. 이 방법을 사용하면 스펙트럼 중복의 염려 없이 동시에 40개 이상의 마커를 측정할 수 있습니다. 사전 고갈 단계 또는 덤프 채널없이 그대로 생물학적 시편의 분석을 가능하게했다. 따라서, 우리는 기존의 2차원 유동 세포분석 플롯에서 고함량 치수성으로 조혈계를 종합적으로 볼 수 있습니다. 고갈 또는 게이팅 공정 동안 과거에 생략된 세포 집단은 이제 CyTOF4,5에의해 생성된 고차원 데이터로 빛을 가져올 수 있다. 우리는 동시에 골수성 보리 7에 초점을 맞춘 조혈 시스템에서 39 개의 매개 변수를측정하는 항체 패널을 설계했습니다. 기존의 유세포분석 데이터와 비교할 때 CyTOF에 의해 생성된 전례 없는 단세포 고차원 데이터의 해석과 시각화는 매우 까다롭습니다. 전산 과학자들은 고차원 데이터 세트의 시각화를 위한 차원 감소 기술을 개발했습니다. 이 문서에서는 T-분산 형 핵 종자 포함 (t-SNE) 기술을 사용하여 CyTOF 데이터를 분석하고 고차원 구조를 보존하면서 2 차원지도에 고차원 결과를 제시하는 알고리즘 viSNE을 사용했습니다. 데이터 8,9,10. tSNE 플롯에서 유사한 셀이 하위 집합으로 클러스터되고 색상이 셀의 특징을 강조 표시하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 도 1에 대해 골수성 세포는 CyTOF(도1)4로부터 유래된 33개의 표면 마커의발현 패턴의 유사성에 기초하여 여러 세포 서브세트로 분포된다. 여기에서 우리는 viSNE 분석 7에 의하여 우리의 이전에 보고된 39마커 CyTOF 패널을 가진 마우스 골수를 조사했습니다. 우리의 CyTOF 데이터의 viSNE 분석은 HSPC (CD117 ++) 및 호중구 (Ly6G+) 특성 을 모두 보여 준 미확인 세포 집단을 밝혀냈다 (도2)7.

결론적으로, 우리는 CyTOF 분석을 위한 신선한 전체 골수를 처리하는 프로토콜을 제시합니다. 이 문서에서는, 우리는 예를 들면 마우스 골수를 이용했습니다, 이 프로토콜은 또한 인간적인 골수 견본을 가공하기 위하여 이용될 수 있는 동안. 인간 골수 견본에 특정한 세부 사항은 또한 프로토콜에서 또한 주의됩니다. 이 프로토콜의 장점은 전체 골수에 대한 조사를 가능하게하기 위해 전체 골수에서 호중구 혈통 세포를 보존하도록 최적화 된 인큐베이션 시간 및 온도와 같은 세부 사항을 포함하고 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 또한 형광 활성화 유동 세포 분석 응용 프로그램에 대해 용이하게 수정될 수 있다.

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프로토콜

모든 실험은 라호야 알레르기 및 면역학 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 된 지침을 따랐으며, 설치류 사용에 대한 승인은 라 호야 알레르기 및 면역학 연구소에서 설명 된 기준에 따라 획득되었습니다. 건강의 국가 학회에서 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드.

1. 수확 마우스 골수 (BM)

  1. 상업 공급 업체에서 C57BL /6J 마우스를 구입. 병원균이 없는 시설에서 마이크로이솔레이터 케이지에 표준 설치류 차우 식단과 집을 먹이라.
  2. 실험 목적으로 생쥐 6-10주를 사용하십시오. CO2 흡입에 의해 안락사시키고 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다.
  3. 마우스를 복부 쪽을 위로 올려 놓고 멸균 수술 패드에 놓습니다. 70 % 에탄올을 분사하여 복부와 뒷다리 부위의 피부를 살균하십시오. 복강을 열어 절단해 해부 수술 가위 한 쌍을 사용합니다.
  4. 뒷다리를 노출하기 위해 피부를 제거합니다. 무딘 팁 드레싱 포셉을 사용하여 마우스 경골을 발목 바로 아래에 고정시됩니다. 또 다른 한 쌍의 커브드레싱 집게를 사용하여 무딘 팁 드레싱 집게 아래의 경골을 안정시보세요. 경골을 부수고 무딘 팁 드레싱 집게로 근육을 찢어 뼈를 노출하십시오.
    참고: 경골은 무릎 관절에 느슨하게 부착되어 무딘 팁 드레싱 집게를 사용하여 쉽게 선택할 수 있습니다.
  5. 차가운 1x PBS에 경골을 놓습니다.
  6. 다음으로, 안정화 된 곡선 드레싱 집게를 대퇴골으로 아래로 이동합니다. 무딘 팁 드레싱 집게를 무릎 관절 아래로 밀어 내고 슬개골을 잡습니다. 슬개골을 부드럽게 당겨 탈비합니다. 슬개골에 부착 된 근육을 찢어 서 대퇴골을 노출. 구부러진 드레싱 집게에 의해 노출 된 대퇴골을 잡고 해부 수술 가위를 사용하여 뼈바닥에서 대퇴골을 잘라냅니다.
  7. 대퇴골을 차가운 1x PBS에 놓습니다.
  8. 18G 바늘로 0.5 mL 미세 원심 분리튜브에 구멍을 뚫습니다.
  9. 경골과 대퇴골을 동일한 0.5 mL 미세 원심 분리튜브에 넣고 뼈의 열린 끝이 구멍에 아래쪽을 향하도록 합니다.
  10. 경골과 대퇴골을 모두 포함하는 0.5 mL 튜브를 1.7 mL 미세 원심 분리튜브에 넣습니다.
  11. 경골과 대퇴골을 모두 포함하는 이중 층 튜브를 마이크로 원심 분리기에서 30 초 동안 5,510 x g에서 돌십시오.
  12. BM이 뼈에서 추출되어 튜브 바닥에 펠릿되었는지 확인합니다. 신성한 뼈를 포함하는 0.5 mL 튜브를 버팅합니다. 마우스 BM이 다음 단계에 대한 준비가 되었습니다.
    참고: 인간 BM은 앞서 설명한바와같이 임상 자원에서 수확된다 11.

2. CyTOF를 위한 얼룩 BM 세포

  1. 1 mL 1x 적혈구 (RBC) 매착 완충액에서 BM을 다시 중단하십시오. 인간 BM의 경우, 10x 적혈구 (RBC) 용해 완충액의 10 배 부피로 전체 BM을 다시 중단하십시오. 실온(RT)에서 10분 동안 배양합니다.
  2. 4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 튜브를 회전시면 됩니다. 인간 BM의 경우, 2.3단계로 진행하기 전에 2.1 단계 및 2.2단계를 반복한다.
  3. 조심스럽게 상류를 흡인하고 펠렛을 중단없이 둡니다. 차가운 1x PBS 의 1 mL로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 펠릿을 70 μm 세포 스트레이너를 통해 15 mL 원엽 튜브로 필터링합니다. BM 세포는 지금 완전히 근육과 뼈 파편에서 관으로 격리됩니다. 튜브에 차가운 1x PBS 9 mL을 추가하여 세포를 씻습니다.
  4. 4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 15 mL 튜브를 회전시면됩니다.
  5. 상월체를 조심스럽게 흡인하고 10 mL 콜드 PBS로 BM 세포를 다시 중단하십시오. 계산을 위한 셀의 별표를 가져 가라. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다.
  6. Aliquot 5 x 106 BM 세포를 CyTOF 염색을 위한 새로운 15 mL 튜브로 넣습니다.
  7. 4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 15 mL 튜브 aliquot를 돌십시오.
  8. 시료에 대한 생존 성 지표로서 1 mL의 CyTOF 염색 버퍼에서 125 nM 시스플라틴으로 상류를 조심스럽게 흡인하고 BM 세포를 다시 중단합니다. RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
  9. 배양 후, 튜브에 CyTOF 염색 완충제 4 mL를 추가합니다. 4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 튜브를 회전시면 됩니다. 인간 BM의 경우, CyTOF 염색 완충액에 10% 인간 AB 세럼을 추가합니다.
  10. 상월체를 조심스럽게 흡인하고 FC 수용체 차단 용액의 50 μL로 BM 세포를 다시 중단합니다. 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. 인간 BM에 대한 이 단계를 건너뜁니다.
  11. 수제 CyTOF 항체 칵테일 50 μL을 샘플에 추가하여 총 염색 량이 100 μL이 되도록 합니다. 부드럽게 파이펫을 섞어 주세요. 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 항체 칵테일의 최종 부피는 마우스 BM 및 인간 BM 샘플 모두에 대해 100 μL이다.
  12. 세포를 세척하기 위해 인큐베이션 후 각 튜브에 CyTOF 염색 완충액 2 mL을 추가하고 4 °C에서 5 분 동안 350 x g에서 튜브를 돌십시오.
  13. 총 2회 2회 를 반복하여 2.12단계를 반복합니다.
  14. 16 % 스톡 앰벌에서 신선한 1.6 % 포름 알데히드 용액을 준비하십시오. 1x PBS의 9 부분으로 주식 포름알데히드의 1 부분을 희석.
  15. 조심스럽게 상류를 흡인하고 1 mL 신선한 1.6 % FA 용액으로 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. RT에서 15 분 동안 인큐베이션하십시오.
  16. 4 °C에서 5 분 동안 800 x g에서 튜브를 회전시면 됩니다.
  17. 상월체를 조심스럽게 흡인하고 1 mL 픽스 /파마 버퍼에서 125 nM 간 칼레이션 솔루션으로 셀 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
  18. 샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 인터칼레이션 용액으로 인큐베이션합니다.

3. CyTOF 수집을 위한 세포 준비

  1. 4 °C에서 5 분 동안 800 x g에서 부드럽게 소용돌이 및 스핀 셀.
  2. CyTOF 염색 완충액 2 mL을 첨가하여 세포를 세척하고, 4°C에서 5분 동안 800 x g에서 세포를 스핀하고 흡인에 의해 상수체를 제거한다.
  3. diH2O. 1 mL에서 세포를 다시 일시 중단하여 각 튜브에서 작은 부피(약 10 μL)를 예약하여 세포를 계산합니다.
  4. 4 °C에서 5 분 동안 800 x g에서 세포를 회전시다.
  5. 3.3 단계와 3.4단계를 반복합니다.
  6. 조심스럽게 상류를 흡인하고 펠릿에 세포를 둡니다. BM 세포는 이제 CyTOF 수집을 위해 1 x 106 셀/mL의 농도로 재서스펜션할 준비가 되었습니다.

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결과

도 1은 CyTOF 실험으로부터의 예로 제시된다. 이러한 tSNE 플롯상에서 여러 마우스 조직에 걸친 세포는 33-파라미터 CyTOF 패널에 의해 측정된 그들의 표면 마커 발현 프로파일의 유사성에 기초하여 서브세트로 군집되었다. 더 유사한 특성을 가진 세포는 각 세포상에 33개의 마커의 발현에 기초하여 호중구, 대식세포, 또는 DC와 같은 함께 자동으로 클러스터되었다.

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토론

지난 수십 년 동안, 형광 계류 세포측정은 세포 혈통 및 이질성을 연구하는 주요방법으로 사용되었다 1,2,3. 유세포측정법이 다차원 데이터를 제공했지만 이 방법은 매개 변수 와 스펙트럼 중복의 선택에 의해 제한됩니다. 유세포 분석의 약점을 극복하기 위해 우리는 형광단 대신 중금속 동위원소를 사용하여 검출기 채널 또는 ...

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공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

우리는 대량 세포 분석 절차에 도움을 LJI 흐름 세포 분석 코어에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01HL134236, P01HL136275 및 R01CA202987 (모두 C.C.H) 및 ADA7-12-MN-31 (04) (C.C.H. 및 Y.P.Z)에 의해 지원되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
CyTOF Antibodies (mouse)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89YFluidigmCat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176YbFluidigmCat# 3176002B
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-PurifiedBiolegendCat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-PurifiedBiolegendCat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166ErFluidigmCat# 3166004B
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-PurifiedBiolegendCat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148NdFluidigmCat# 3148003B
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142NdFluidigmCat# 3142003B
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167ErFluidigmCat# 3167004B
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-PurifiedBiolegendCat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-PurifiedBD BiosciencesCat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-PurifiedBiolegendCat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-PurifiedBiolegendCat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-PurifiedBiolegendCat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-PurifiedBiolegendCat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146NdFluidigmCat# 3146009B
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156GdFluidigmCat# 3156012B
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar ReadyThermoFisherCat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-PurifiedBiolegendCat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-PurifiedBiolegendCat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159TbFluidigmCat# 3159009B
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-PurifiedBD BiosciencesCat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174YbFluidigmCat# 3174003B
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-PurifiedBD BiosciencesCat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169TmFluidigmCat# 3169015B
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-PurifiedabcamCat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165HoFluidigmCat# 3165018B
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-PurifiedBD BiosciencesCat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143NdFluidigm(Clone H57-597)-143Nd
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
Antibody StabilizerCANDOR BioscienceCat# 130050
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichCat# A4503
Cisplatin-194PtFluidigmCat# 201194
eBioscience 1x RBC Lysis BufferThermoFisherCat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer SetThermoFisherCat# 00-4333-57
EQ Four Element Calibration BeadsFluidigmCat# 201078
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)ThermoFisherCat# AM9260G
Fetal Bovine SerumOmega ScientificCat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Saline solutionGE LifesciencesCat#SH30256.01
Intercalator-IrFluidigmCat# 201192B
MAXPAR Antibody Labeling KitsFluidigmhttp://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
ParaformaldehydeSigma-AldrichCat# 158127
Sodium azideSigma-AldrichCat# S2002
Triton X-100Sigma-AldrichCat# X100
Trypsin EDTA 1xCorningCat# 25-053-Cl
Experimental Model: Organism/Strains
Mouse: C57BL/6JThe Jackson LaboratoryStock No: 000664
Software Alogrithm
Bead-based NormalizerFinck et al., 2013https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
CytobankCytobankhttps://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0Chen et al., 2016https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNEvan der Maaten and Hinton, 2008https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html

참고문헌

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  2. Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
  3. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
  4. Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
  5. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  6. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
  7. Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
  8. Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
  9. Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
  10. van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).
  11. Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).
  12. Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).
  14. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nature Reviews in Immunology. , (2019).

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