Подготовка цельного костного мозга для анализа массовой цитометрии нейтрофил-линейных клеток

Резюме

Здесь мы представляем протокол для обработки свежего костного мозга (БМ), изолированного от мыши или человека для высокомерной массовой цитометрии (Цитометрия Time-Of-Flight, CyTOF) анализ нейтрофил-линии клеток.

Аннотация

В этой статье мы представляем протокол, который оптимизирован для сохранения нейтрофил-линии клеток в свежем БМ для всего анализа BM CyTOF. Мы использовали миелоидно-предвзятый 39-антитела CyTOF панели для оценки гематопоитической системы с акцентом на нейтрофил-линии клеток с помощью этого протокола. Результат CyTOF был проанализирован с помощью алгоритма уменьшения измерения с открытым ресурсом, viSNE, и данные были представлены, чтобы продемонстрировать результаты этого протокола. Мы обнаружили новые популяции нейтрофилов линий клеток на основе этого протокола. Этот протокол свежего целого препарата БМ может быть использован для 1), анализ CyTOF, чтобы обнаружить неопознанные популяции клеток из всего БМ, 2), исследуя целые дефекты БМ для пациентов с заболеваниями крови, такими как лейкемия, 3), помогая оптимизации Флуоресценция активированный поток цитометрии протоколы, которые используют свежий весь БМ.

Введение

В последние несколько десятилетий, методы цитометрии были мощным инструментом для исследования гематопоетической системы в БМ. Эти методы включают флуоресценцию активированный поток цитометрии и новый метод CyTOF с использованием тяжелых металлов помечены антителами. Они привели к открытиям многих типов клеток в неоднородном биологическом образце, идентифицируя их уникальные профили выражения поверхностных маркеров. Увеличенное перекрытие спектра, связанное с большим количеством каналов, приводит к более высокой неточности данных в приложениях цитометрии с активацией флуоресценции. Таким образом, нежелательные клетки регулярно удаляются для того, чтобы обогатить группы клеток, представляющих интерес для флуоресценции активированный анализ цитометрии потока. Например, Ly6G (или Gr-1) и CD11b считаются зрелыми маркерами миелоидных клеток, а Ly6G (или Gr-1) и CD11b - клетки обычно удаляются из образцов БМ с помощью комплектов магнитного обогащения до анализа цитометрии гематопоитических стволовых и прародителей клеток (HSPCs) или путем объединения этих маркеров в одном канале свалки коктейль^1,2,3. Другим примером является то, что нейтрофилы обычно удаляются из образца крови человека, чтобы обогатить периферические моноядерные клетки крови (PBMC) для иммунологических исследований. Весь костный мозг, изолированный от мыши или человека, однако, редко исследуются нетронутыми для анализа цитометрии.

В последнее время CyTOF стал революционным инструментом дляисследования гематопойтической системы 4,^5,6. С CyTOF, флюорофор-маркированные антитела заменены тяжелыми антителами репортер-маркированного элемента. Этот метод позволяет замерить более 40 маркеров одновременно без беспокойства перекрытия спектра. Это позволило провести анализ нетронутых биологических образцов без предистоистой меры или канала свалки. Таким образом, мы можем просматривать гематопоиетическую систему комплексно с высокой объемностью содержания из обычных 2-D потока цитометрии участков. Популяции клеток, опущенные в прошлом во время процесса истощения или gating, теперь могутбыть выведены на свет с помощью высокомерных данных, генерируемых CyTOF 4,⁵. Мы разработали антителой панели, которая одновременно измеряет 39 параметров в гематопоетической системе с акцентом на миелоидный linage⁷. По сравнению с обычными данными цитометрии потока, интерпретация и визуализация беспрецедентных одноклеточных высокомерных данных, генерируемых CyTOF, является сложной задачей. Вычислительные ученые разработали методы уменьшения размерности для визуализации высокомерных наборов данных. В этой статье мы использовали алгоритм viSNE, который использует t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) для анализа данных CyTOF и представления высокомерного результата на 2-мерной карте, сохраняя при этом высокомерную структуру данных^8,9,10. На участке tSNE похожие ячейки группируются в подмножества, и цвет используется для выделения особенностей ячеек. Например, на рисунке 1 миелоидные клетки распределены по нескольким подмножествам клеток на основе сходства их моделей выражения 33 поверхностных маркеров в результате CyTOF (Рисунок 1)⁴. Здесь мы исследовали мыши костного мозга с нашими ранее сообщалось 39-маркер CyTOF панели viSNE анализа⁷. ViSNE анализ наших данных CyTOF показал неопознанную популяцию клеток, которые показали, как HSPC (CD117⁾и нейтрофил (Ly6G⁾характеристики (Рисунок 2)⁷.

В заключение, мы представляем протокол для обработки свежего костного мозга для анализа CyTOF. В этой статье мы использовали костный мозг мыши в качестве примера, в то время как этот протокол также может быть использован для обработки образцов костного мозга человека. Детали, характерные для образцов костного мозга человека, также отмечены в протоколе. Преимущество этого протокола в том, что он содержит такие детали, как время инкубации и температура, которые были оптимизированы для сохранения нейтрофил-линии клеток в целом костного мозга, чтобы исследование на нетронутыми весь костный мозг. Этот протокол также может быть легко изменен для флуоресценции активированный поток цитометрии приложений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты следовали утвержденным руководящим принципам Института аллергии и иммунологии Ла Хойя по уходу за животными и использованию комитета, и разрешение на использование грызунов было получено от Института аллергии и иммунологии Ла Хойя в соответствии с критериями, изложенными в Руководство по уходу и использованию лабораторных животных от Национальных институтов здравоохранения.

1. Урожай мышь костного мозга (BM)

1. Покупка c57BL/6J мышей от коммерческого поставщика. Кормите стандартный грызун чау диеты и дома в микроизолатор клетки в патоген-бесплатно объекта.
2. Используйте мышей мужского пола, возраст 6-10 недель, для экспериментальных целей. Эвтаназия путем вдыхания CO₂ с последующим вывихом шейки матки.
3. Поместите мышь на стерильную хирургическую площадку с стороной живота вверх. Стерилизовать кожу живота и задних конечностей области путем распыления 70% этанола. Используйте пару вскрытия хирургических ножниц, чтобы сократить брюшной полости открытым.
4. Удалите кожу, чтобы разоблачить задние конечности. Используйте пару тупых наконечников одевания щипцы держать мышь голени прямо под лодыжкой. Используйте еще одну пару изогнутых щипцы для стабилизации голени ниже тупой кончик одевания щипцы. Перерыв голени и разоблачить кости, срывая мышцы с тупым наконечником одевания щипцы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Голени свободно прилагается к коленному суставу и может быть легко выбрал с помощью тупой кончик одевания щипцы.
5. Поместите голени в холодный 1x PBS.
6. Затем переместите стабилизирующие изогнутые декораты вниз к бедренной кости. Слайд тупой кончик одевания щипцы ниже коленного сустава и удерживайте коленную чашу. Вывихните коленную чашечку, осторожно потянув его вверх. Разоблачить бедренную киша, срывая мышцы, прикрепленные к коленной чашечке. Держите подвергаются бедренной кости на изогнутые щипцы и отрезать бедренную кость от нижней части кости с помощью вскрытия хирургических ножниц.
7. Поместите бедренную княженку в холодный 1x PBS.
8. Пробить отверстие в 0,5 мл микроцентрифуговой трубки с 18 G иглы.
9. Поместите обе голени и бедренной кости в тот же 0,5 мл микроцентрифуговой трубки с открытым концом костей, обращенных вниз к отверстию.
10. Поместите трубку 0,5 мл, содержащую как голени и бедренной кости, в микроцентрифугную трубку 1,7 мл.
11. Вращайте двухслойные трубки, содержащие как голени, так и бедренную кишну при 5510 х г на 30 с в микроцентрифуге.
12. Убедитесь, что БМ извлекается из костей и гранулирует в нижней части трубки. Подготовьте трубку 0,5 мл, содержащую священные кости. Мышь BM готова к следующим шагам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Человек БМ собирают на клинических ресурсах, как ранее описано¹¹.

2. Пятно БМ клетки для CyTOF

1. Resuspend БМ в 1 мл 1x Красная кровяная клетка (РБК) лиза буфера. Для человека БМ, resuspend весь БМ в 10-х объем1x Красная кровяная клетка (РБК) лиза буфера. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре (RT).
2. Спин трубки на 350 х г в течение 5 мин при 4 c. Для человека БМ, повторить шаг 2.1 и 2.2, прежде чем приступить к шагу 2.3.
3. Тщательно аспирируйте супернатант и оставьте гранулы ненарушенными. Отрежь гранулы с 1 мл холодного 1x PBS. Фильтр гранулы в 15 мл конической трубки через 70 мкм ячейки ситечко. Клетки BM теперь вполне изолированы в пробку от твердых частиц мышцы и косточки. Вымойте клетки, добавив 9 мл холодного 1x PBS в трубку.
4. Спин 15 мл трубки на 350 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
5. Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend клетки BM с 10 мл холодной PBS. Возьмите аликвот клеток для подсчета. Подсчитайте клетки с помощью гемоситометра.
6. Aliquot 5 x 10⁶ БМ-клеток в новую трубку 15 мл для окрашивания CyTOF.
7. Спин 15 мл трубки aliquot на 350 х г в течение 5 мин при 4 c.
8. Тщательно аспирируйте супернатант и повторно езмите бМ-клетки с 125 нм цисплатин в 1 мл CyTOF окрашивания буфера в качестве индикатора жизнеспособности для образца. Инкубировать в течение 5 мин на RT.
9. После инкубации добавьте 4 мл буфера окрашивания CyTOF в трубку. Спин трубки на 350 х г в течение 5 мин при 4 c. Для человека БМ, добавить 10% человека AB сыворотки в CyTOF окрашивая буфер.
10. Тщательно аспирируйте супернатант и повторно ездовые клетки БМ с 50 ЗЛ Fc Receptor блокируя решение. Инкубировать в течение 10 мин при 4 градусах По Цельсию. Пропустить этот шаг для человека БМ.
11. Добавьте 50 зл домашних антител CyTOF⁵ к образцу, так что общий объем окрашивания составляет 100 л. Аккуратно пипетка для смешивания. Инкубировать в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия. Окончательный объем коктейля антитела составляет 100 л как для мыши БМ, так и для образцов БМ человека.
12. Добавьте 2 мл буфера окрашивания CyTOF к каждой трубке после инкубации, чтобы вымыть клетки, вращайте трубку при 350 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
13. Повторите шаг 2.12 для в общей сложности двух стир.
14. Приготовьте свежий раствор формальдегида 1,6% из 16% бульонного ампулы. Разбавить 1 часть бульона формальдегидом с 9 частями 1x PBS.
15. Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend гранулы с 1 мл свежий 1,6% FA раствор. Инкубировать в течение 15 минут на RT.
16. Спин трубки на 800 х г в течение 5 мин при 4 c.
17. Тщательно аспирируйте супернатант и resuspend клеточной гранулы с 125 нм интеркалации раствора в 1 мл исправить / пермский буфер.
18. Инкубировать образец в растворе интеркалации на ночь при 4 градусах Цельсия.

3. Подготовка ячеек для приобретения CyTOF

1. Аккуратно вихревые и спиновые клетки при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
2. Вымойте клетки, добавив 2 мл буфера окрашивания CyTOF, спиновые клетки на 800 х г в течение 5 минут при 4 кв с и удалить супернатант с помощью аспирации.
3. Resuspend клетки в 1 мл diH₂O. Зарезервируйте небольшой объем (примерно 10 л) из каждой трубки для подсчета клеток.
4. Спиновые клетки при 800 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
5. Повторите шаг 3.3 и 3.4.
6. Тщательно аспирируйте супернатант и оставьте клетки в гранулах. Клетки БМ теперь готовы к повторной приостановке до концентрации 1 х 10⁶ ячеек/мл для приобретения CyTOF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Рисунок 1 представлен в качестве примера экспериментов CyTOF. На этом участке tSNE клетки через несколько тканей мыши были сгруппированы в подмножества на основе сходства их профилей выражения поверхности маркера, измеренных 33-параметрной панелью CyTOF. Клетки с более похожи?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В последние десятилетия цитометрия на основе флуоресценции была использована вкачестве основного метода изучения клеточных линий и неоднородности 1,^2,3. Хотя цитометрия потока предоставила многомерные данные, этот метод ограничен выб...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF Antibodies (mouse)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y	Fluidigm	Cat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb	Fluidigm	Cat# 3176002B
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified	Biolegend	Cat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified	Biolegend	Cat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er	Fluidigm	Cat# 3166004B
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified	Biolegend	Cat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd	Fluidigm	Cat# 3148003B
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd	Fluidigm	Cat# 3142003B
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er	Fluidigm	Cat# 3167004B
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified	Biolegend	Cat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified	Biolegend	Cat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified	Biolegend	Cat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified	Biolegend	Cat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified	Biolegend	Cat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd	Fluidigm	Cat# 3146009B
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd	Fluidigm	Cat# 3156012B
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready	ThermoFisher	Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified	Biolegend	Cat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified	Biolegend	Cat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb	Fluidigm	Cat# 3159009B
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb	Fluidigm	Cat# 3174003B
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm	Fluidigm	Cat# 3169015B
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified	abcam	Cat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho	Fluidigm	Cat# 3165018B
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd	Fluidigm	(Clone H57-597)-143Nd
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
Antibody Stabilizer	CANDOR Bioscience	Cat# 130050
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	Cat# A4503
Cisplatin-194Pt	Fluidigm	Cat# 201194
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	ThermoFisher	Cat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	Cat# 00-4333-57
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	Cat# 201078
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	ThermoFisher	Cat# AM9260G
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	Cat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Saline solution	GE Lifesciences	Cat#SH30256.01
Intercalator-Ir	Fluidigm	Cat# 201192B
MAXPAR Antibody Labeling Kits	Fluidigm	http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	Cat# 158127
Sodium azide	Sigma-Aldrich	Cat# S2002
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Cat# X100
Trypsin EDTA 1x	Corning	Cat# 25-053-Cl
Experimental Model: Organism/Strains
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
Software Alogrithm
Bead-based Normalizer	Finck et al., 2013	https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
Cytobank	Cytobank	https://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0	Chen et al., 2016	https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNE	van der Maaten and Hinton, 2008	https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html