Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Verarbeitung von frischem Knochenmark (BM) vor, das von der Maus oder dem Menschen isoliert ist, um die analyse von Neutrophilenzellen durch die hochdimensionale Massenzytometrie (Cytometrie durch Time-Of-Flight, CyTOF) zu verarbeiten.

Zusammenfassung

In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll vor, das optimiert ist, um Neutrophilen-Linienzellen in frischem BM für die gesamte BM CyTOF-Analyse zu erhalten. Wir nutzten ein myeloisch-voreingenommenes 39-Antikörper-CyTOF-Panel, um das hämatopoetische System mit einem Fokus auf die Neutrophilen-Linienzellen mit diesem Protokoll zu bewerten. Das CyTOF-Ergebnis wurde mit einem Open-Resource-Dimensionsreduktionsalgorithmus viSNE analysiert, und die Daten wurden vorgestellt, um das Ergebnis dieses Protokolls zu demonstrieren. Wir haben neue neutrophil-lineage Zellpopulationen auf der Grundlage dieses Protokolls entdeckt. Dieses Protokoll der frischen gesamten BM-Präparation kann für 1), CyTOF-Analyse verwendet werden, um nicht identifizierte Zellpopulationen aus ganz BM zu entdecken, 2), die Untersuchung ganzer BM-Defekte bei Patienten mit Bluterkrankungen wie Leukämie, 3), fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrieprotokolle, die frische sermierte bm verwenden.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten waren Zytometrie-Methoden ein leistungsfähiges Werkzeug, um das hämatopoetische System im BM zu untersuchen. Zu diesen Methoden gehören fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie und die neue Methode der CyTOF mit schwermetallbeschriftten Antikörpern. Sie haben durch die Identifizierung ihrer einzigartigen Oberflächenmarker-Expressionsprofile zu Entdeckungen vieler Zelltypen in einer heterogenen biologischen Probe geführt. Erhöhte Spektrumüberlappungen, die mit mehr Kanälen verbunden sind, führen zu einer höheren Datenungenauigkeit in fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrieanwendungen. Daher werden unerwünschte Zellen routinemäßig entfernt, um Zellpopulationen von Interesse für die Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrieanalyse zu bereichern. Beispielsweise gelten Ly6G (oder Gr-1) und CD11b als reife myeloische Zellmarker und Ly6G⁺ (oder Gr-1⁺) und CD11b⁺ Zellen werden routinemäßig aus BM-Proben entfernt, indem magnetische Anreicherungskits verwendet werden, bevor die Durchflusszytometrieanalyse hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) oder durch Kombination dieser Marker in einem Dump-Cocktail-Kanal^1,2,3. Ein weiteres Beispiel ist, dass Neutrophile routinemäßig aus menschlichen Blutproben entfernt werden, um periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) für immunologische Studien anzureichern. Ganzes Knochenmark, das von der Maus oder dem Menschen isoliert ist, wird jedoch selten intakt für die Zytometrieanalyse untersucht.

In letzter Zeit ist CyTOF zu einem revolutionären Werkzeug geworden, um das hämatopoetische System^4,5,^6zuuntersuchen. Mit CyTOF werden die fluorophor-markierten Antikörper durch schwere, von Reportern gekennzeichnete Antikörper ersetzt. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Messung von über 40 Markern ohne die Sorge um die Überlappung des Spektrums. Es hat die Analyse intakter biologischer Proben ohne Vorabbauschritte oder einen Deponiekanal ermöglicht. Daher können wir das hämatopoetische System umfassend mit hoher Content-Dimensionalität aus herkömmlichen 2D-Flow-Zytometrie-Plots betrachten. Zellpopulationen, die in der Vergangenheit während des Erschöpfungs- oder Gatingprozesses weggelassen wurden, können nun mit den von CyTOF^4,5erzeugten hochdimensionalen Daten ans Licht gebracht werden. Wir haben ein Antikörper-Panel entwickelt, das gleichzeitig 39 Parameter im hämatopoetischen System misst, mit einem Fokus auf die myeloische Linage⁷. Im Vergleich zu den herkömmlichen Flow-Zytometrie-Daten ist die Interpretation und Visualisierung der beispiellosen einzelzelligen hochdimensionalen Daten, die von CyTOF generiert werden, eine Herausforderung. Computerwissenschaftler haben Maßalitätsreduktionstechniken zur Visualisierung hochdimensionaler Datensätze entwickelt. In diesem Artikel verwendeten wir den Algorithmus viSNE, der t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) Technik verwendet, um die CyTOF-Daten zu analysieren und das hochdimensionale Ergebnis auf einer 2-dimensionalen Karte zu präsentieren, während die hochdimensionale Struktur konserviert wird. der Daten^8,9,10. Im tSNE-Diagramm werden ähnliche Zellen in Teilmengen gruppiert, und die Farbe wird verwendet, um das Feature der Zellen hervorzuheben. In Abbildung 1 werden die myeloischen Zellen z. B. in mehrere Zellteilmengen verteilt, basierend auf den Ähnlichkeiten ihrer Expressionsmuster von 33 Oberflächenmarkern, die aus CyTOF resultieren (Abbildung 1)⁴. Hier untersuchten wir Mausknochenmark mit unserem zuvor berichteten 39-Marker CyTOF Panel durch viSNE-Analyse⁷. viSNE-Analyse unserer CyTOF-Daten ergab eine nicht identifizierte Zellpopulation, die sowohl HSPC -(CD117⁺) als auch Neutrophilen (Ly6G⁺) Merkmale zeigte (Abbildung 2)⁷.

Abschließend stellen wir ein Protokoll zur Verarbeitung eines frischen ganzen Knochenmarks für die CyTOF-Analyse vor. In diesem Artikel haben wir als Beispiel Mausknochenmark verwendet, während dieses Protokoll auch zur Verarbeitung menschlicher Knochenmarkproben verwendet werden kann. Die spezifischen Details für menschliche Knochenmarkproben sind auch im Protokoll vermerkt. Der Vorteil dieses Protokolls ist, dass es Details wie Inkubationszeit und Temperatur enthält, die optimiert wurden, um Neutrophilen-Linienzellen im gesamten Knochenmark zu erhalten, um eine Untersuchung des intakten gesamten Knochenmarks zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann auch leicht für Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrieanwendungen geändert werden.

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Protokoll

Alle Experimente folgten den anerkannten Richtlinien des La Jolla Institute for Allergy and Immunology Animal Care and Use Committee, und die Zulassung für die Verwendung von Nagetieren wurde vom La Jolla Institute for Allergy and Immunology nach Kriterien gemäß den der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health.

1. Ernte Maus Knochenmark (BM)

1. Kaufen Sie C57BL/6J Mäuse von einem kommerziellen Anbieter. Füttern Sie die Standard-Nagetier-Chow-Diät und beherbergen Sie sie in Mikroisolatorkäfigen in einer pathogenenfreien Anlage.
2. Verwenden Sie männliche Mäuse, 6-10 Wochen alt, für experimentelle Zwecke. Euthanisieren durch CO2-Inhalation gefolgt von der Zervixdislokation.
3. Legen Sie die Maus auf ein steriles chirurgisches Pad mit der Bauchseite nach oben. Sterilisieren Sie die Haut des Bauch- und Hinterbeinebereichs, indem Sie 70% Ethanol sprühen. Verwenden Sie ein Paar sezierende chirurgische Schere, um die Bauchhöhle zu schneiden.
4. Entfernen Sie die Haut, um Hinterbeine freizulegen. Verwenden Sie ein Paar stumpfe Spitze Dressing Zange, um die Maus Tibia direkt unter dem Knöchel zu halten. Verwenden Sie ein weiteres Paar gekrümmte Ankleidezangen, um die Tibia unter den stumpfen, spitzen Ankleidezangen zu stabilisieren. Brechen Sie die Tibia und setzen Sie den Knochen durch Abreißen des Muskels mit der stumpfen Spitze Dressing Zange.
   HINWEIS: Die Tibia ist lose am Kniegelenk befestigt und kann mit den stumpfen Klappenzangen leicht herausgepickt werden.
5. Die Tibia in kalte 1x PBS geben.
6. Als nächstes bewegen Sie die stabilisierenden gekrümmten Verbandszangen nach unten zum Oberschenkelknochen. Schieben Sie die stumpfe Spitze Dressing Zange unter dem Kniegelenk und halten Sie die Kniescheibe. Dislozieren Sie die Kniescheibe, indem Sie sie sanft nach oben ziehen. Setzen Sie den Oberschenkelknochen aus, indem Sie den an der Kniescheibe befestigten Muskel abreißen. Halten Sie den freiliegenden Oberschenkelknochen durch die gekrümmten Verbandszangen und schneiden Sie den Oberschenkelknochen von der Unterseite des Knochens mit einer sezierenden chirurgischen Schere ab.
7. Den Oberschenkelknochen in kalte 1x PBS geben.
8. Lochen Sie ein Loch in 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit einer 18 G Nadel.
9. Legen Sie sowohl Tibia als auch Oberschenkelknochen in das gleiche 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit dem offenen Ende der Knochen nach unten zum Loch.
10. Legen Sie das 0,5 ml-Rohr mit Tibia und Oberschenkelknochen in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr.
11. Drehen Sie die doppelschichtigen Rohre, die sowohl Tibia als auch Oberschenkelknochen bei 5.510 x g für 30 s in der Mikrozentrifuge enthalten.
12. Stellen Sie sicher, dass der BM aus den Knochen extrahiert und an der Unterseite des Rohres gepelt wird. Den 0,5 ml-Schlauch mit den heiligen Knochen. Die Maus BM ist bereit für die nächsten Schritte.
    HINWEIS: Human BM wird zu klinischen Ressourcen geerntet, wie zuvor beschrieben¹¹.

2. Flecken BM-Zellen für CyTOF

1. Setzen Sie den BM in 1 mL 1x Red Blood Cell (RBC) Lysepuffer aus. Für humane BM, resuspendieren Sie die gesamte BM in einem 10x Volumen von 1x Red Blood Cell (RBC) LysePuffer. 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
2. Drehen Sie das Rohr bei 350 x g für 5 min bei 4 °C. Wiederholen Sie für humanes BM Schritt 2.1 und 2.2, bevor Sie mit Schritt 2.3 fortfahren.
3. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Pellet ungestört lassen. Das Pellet mit 1 ml kalt1x PBS aussetzen. Filtern Sie das Pellet in ein 15 ml konisches Rohr durch ein 70 m Zellsieb. Die BM-Zellen sind nun vollständig in die Röhre aus dem Muskel- und Knochenrest isoliert. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 9 ml kalte 1x PBS in das Rohr geben.
4. Drehen Sie das 15 ml-Rohr bei 350 x g für 5min bei 4 °C.
5. Den Überstand vorsichtig ansaugen und die BM-Zellen mit 10 ml kaltem PBS wieder aufsetzen. Nehmen Sie ein Aliquot von Zellen zum Zählen. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.
6. Aliquot 5 x 10⁶ BM Zellen in ein neues 15 ml Rohr für CyTOF Färbung.
7. Drehen Sie das 15 ml Rohr aliquot bei 350 x g für 5 min bei 4 °C.
8. Sorgsam den Überstand ansaugen und die BM-Zellen mit 125 nM Cisplatin in 1 ml CyTOF Staining Buffer als Lebensfähigkeitsindikator für die Probe wieder aussetzen. 5 min bei RT inkubieren.
9. Nach der Inkubation 4 ml CyTOF-Färbepuffer in das Rohr geben. Drehen Sie das Rohr bei 350 x g für 5 min bei 4 °C. Für menschlicheBM, fügen Sie 10% menschliches AB-Serum in den CyTOF-Färbungspuffer.
10. Sorgsam den Überstand ansaugen und die BM-Zellen mit einer 50-L-Fc-Rezeptor-Blockierlösung wieder aussetzen. 10 min bei 4 °C inkubieren. Überspringen Sie diesen Schritt für human BM.
11. Fügen Sie der Probe 50 L des hausgemachten CyTOF-Antikörpercocktails⁵ hinzu, so dass das Gesamtfärbevolumen 100 l beträgt. Sanft Pipette zu mischen. 30 min bei 4 °C inkubieren. Das Endvolumen des Antikörpercocktails beträgt 100 l für Maus-BM- und Human-BM-Proben.
12. Fügen Sie 2 ml CyTOF-Färbepuffer in jedes Rohr nach der Inkubation, um die Zellen zu waschen, drehen Sie das Rohr bei 350 x g für 5 min bei 4 °C.
13. Wiederholen Sie Schritt 2.12 für insgesamt zwei Wähbe.
14. Bereiten Sie eine frische 1,6% Formaldehydlösung aus dem 16% Stock ampule vor. 1 Teil des Vorrats formaldehyd mit 9 Teilen von 1x PBS verdünnen.
15. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Pellet mit 1 ml frischer 1,6% FA-Lösung wieder aufhängen. 15 min bei RT inkubieren.
16. Drehen Sie das Rohr bei 800 x g für 5 min bei 4 °C.
17. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet mit 125 nM Interkalationslösung in 1 ml Fix/Perm-Puffer wieder aufhängen.
18. Inkubieren Sie die Probe in Interkalationslösung über Nacht bei 4 °C.

3. Bereiten Sie Zellen für die CyTOF-Akquisition vor

1. Sanft Wirbel und Spin-Zellen bei 800 x g für 5 min bei 4 °C.
2. Waschen Sie Zellen durch Zugabe von 2 ml CyTOF-Färbepuffer, Spinzellen bei 800 x g für 5 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand durch Aspiration.
3. Resuspend Zellen in 1 ml diH₂O. Reservieren Sie ein kleines Volumen (ca. 10 l) von jedem Rohr, um Zellen zu zählen.
4. Spinzellen bei 800 x g für 5 min bei 4 °C.
5. Wiederholen Sie Schritt 3.3 und 3.4.
6. Den Überstand vorsichtig ansaugen und die Zellen im Pellet lassen. Die BM-Zellen sind nun bereit für die Resuspension auf die Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml für die CyTOF-Erfassung.

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Ergebnisse

Abbildung 1 wird als Beispiel aus CyTOF-Experimenten dargestellt. Auf diesem tSNE-Diagramm wurden die Zellen über mehrere Mausgewebe basierend auf der Ähnlichkeit ihrer Oberflächenmarker-Expressionsprofile, die von einem CyTOF-Panel mit 33 Parametern gemessen wurden, in Teilmengen gruppiert. Zellen mit ähnlichen Eigenschaften wurden automatisch gruppiert, z. B. Die Neutrophile, Makrophagen oder die DCs basierend auf der Expression der 33 Marker auf jeder Zelle.

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Diskussion

In den vergangenen Jahrzehnten wurde die fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie als Hauptmethode zur Untersuchung zellulärer Abstammungundlzeichen und Heterogenität^1,2,3verwendet. Obwohl die Durchflusszytometrie mehrdimensionale Daten lieferte, ist diese Methode durch die Auswahl von Parametern und spektralen Überlappungen eingeschränkt. Um die Schwäche der Durchflusszytometrie zu überwinden, nutzten wir CyTOF, das schwe...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF Antibodies (mouse)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y	Fluidigm	Cat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb	Fluidigm	Cat# 3176002B
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified	Biolegend	Cat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified	Biolegend	Cat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er	Fluidigm	Cat# 3166004B
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified	Biolegend	Cat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd	Fluidigm	Cat# 3148003B
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd	Fluidigm	Cat# 3142003B
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er	Fluidigm	Cat# 3167004B
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified	Biolegend	Cat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified	Biolegend	Cat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified	Biolegend	Cat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified	Biolegend	Cat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified	Biolegend	Cat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd	Fluidigm	Cat# 3146009B
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd	Fluidigm	Cat# 3156012B
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready	ThermoFisher	Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified	Biolegend	Cat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified	Biolegend	Cat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb	Fluidigm	Cat# 3159009B
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb	Fluidigm	Cat# 3174003B
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm	Fluidigm	Cat# 3169015B
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified	abcam	Cat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho	Fluidigm	Cat# 3165018B
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd	Fluidigm	(Clone H57-597)-143Nd
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
Antibody Stabilizer	CANDOR Bioscience	Cat# 130050
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	Cat# A4503
Cisplatin-194Pt	Fluidigm	Cat# 201194
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	ThermoFisher	Cat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	Cat# 00-4333-57
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	Cat# 201078
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	ThermoFisher	Cat# AM9260G
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	Cat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Saline solution	GE Lifesciences	Cat#SH30256.01
Intercalator-Ir	Fluidigm	Cat# 201192B
MAXPAR Antibody Labeling Kits	Fluidigm	http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	Cat# 158127
Sodium azide	Sigma-Aldrich	Cat# S2002
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Cat# X100
Trypsin EDTA 1x	Corning	Cat# 25-053-Cl
Experimental Model: Organism/Strains
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
Software Alogrithm
Bead-based Normalizer	Finck et al., 2013	https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
Cytobank	Cytobank	https://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0	Chen et al., 2016	https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNE	van der Maaten and Hinton, 2008	https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html