Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour traiter la moelle osseuse fraîche (BM) isolée de la souris ou de l'homme pour la cytométrie de masse de haute dimension (Cytométrie par Time-Of-Flight, CyTOF) analyse des cellules de neutrophile-lignée.

Résumé

Dans cet article, nous présentons un protocole qui est optimisé pour préserver des cellules de neutrophile-ligne dans BM frais pour l'analyse entière de CyTOF de BM. Nous avons utilisé un panneau CyTOF de 39 anticorps myéloïde-biaisé pour évaluer le système hématopoïétique avec un foyer sur les cellules de neutrophile-ligne en utilisant ce protocole. Le résultat de CyTOF a été analysé avec un algorithme de réduction dimensionnelle à ressources ouvertes, viSNE, et les données ont été présentées pour démontrer les résultats de ce protocole. Nous avons découvert de nouvelles populations de cellules de neutrophile basées sur ce protocole. Ce protocole de préparation bM entière fraîche peut être employé pour 1), analyse de CyTOF pour découvrir des populations non identifiées de cellules de BM entière, 2), étudiant des défauts entiers de BM pour des patients présentant des désordres de sang tels que la leucémie, 3), aidant l'optimisation de protocoles de cytométrie de débit fluorescence activés qui utilisent BM entier frais.

Introduction

Au cours des dernières décennies, les méthodes de cytométrie ont été un outil puissant pour étudier le système hématopoïétique dans le BM. Ces méthodes comprennent la cytométrie d'écoulement activée par la fluorescence et la nouvelle méthode de CyTOF utilisant des anticorps étiquetés métal lourd. Ils ont mené à la découverte de nombreux types de cellules dans un spécimen biologique hétérogène en identérant leurs profils uniques d'expression de marqueurde de surface. L'augmentation des chevauchements de spectre associés à un plus grand nombre de canaux entraîne une inexactitude accrue des données dans les applications de cytométrie de débit activée par la fluorescence. Par conséquent, les cellules indésirables sont systématiquement enlevées afin d'enrichir les populations cellulaires d'intérêt pour l'analyse de cytométrie de débit activée par fluorescence. Par exemple, Les cellules Ly6G (ou Gr-1) et CD11b sont considérées comme des marqueurs de cellules myéloïdes matures et les cellules Ly6G^(ou Gr-1⁾et CD11b sont systématiquement retirées des échantillons de BM à l'aide de kits d'enrichissement magnétique avant l'analyse de la cytométrie du flux. cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPC) ou en combinant ces marqueurs dans un canal de cocktail à décharge^1,2,3. Un autre exemple est que les neutrophiles sont systématiquement retirés du spécimen de sang humain pour enrichir les cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMC) pour des études immunologiques. La moelle osseuse entière isolée de la souris ou de l'homme, cependant, est rarement étudiée intacte pour l'analyse de cytométrie.

Récemment, CyTOF est devenu un outil révolutionnaire pour étudier le système hématopoïétique^4,5,6. Avec CyTOF, les anticorps étiquetés fluorophore sont remplacés par des anticorps étiquetés par des journalistes à élément lourd. Cette méthode permet de mesurer plus de 40 marqueurs simultanément sans se soucier du chevauchement du spectre. Il a permis l'analyse d'un spécimen biologique intact sans étapes de pré-épuisement ou d'un canal de vidange. Par conséquent, nous pouvons voir le système hématopoïétique de manière complète avec la dimensionnalité à haute teneur à partir des parcelles conventionnelles de cytométrie de flux 2-D. Les populations cellulaires omises dans le passé lors de l'épuisement ou du processus de gating peuvent maintenant être mises en lumière avec les données de haute dimension générées par CyTOF^4,5. Nous avons conçu un panneau d'anticorps qui mesure simultanément 39 paramètres dans le système hématopoïétique avec un accent sur le linage myéloïde⁷. Par rapport aux données conventionnelles de cytométrie de flux, l'interprétation et la visualisation des données unicellulaires sans précédent à haute dimensionnalité générées par CyTOF est un défi. Les scientifiques computationnels ont développé des techniques de réduction de dimensionnalité pour la visualisation des ensembles de données de haute dimension. Dans cet article, nous avons utilisé l'algorithme, viSNE, qui utilise t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) technique pour analyser les données CyTOF et de présenter le résultat de haute dimension sur une carte en 2 dimensions tout en conservant la structure de haute dimension des données^8,9,10. Sur la parcelle tSNE, des cellules similaires sont regroupées en sous-ensembles et la couleur est utilisée pour mettre en évidence la caractéristique des cellules. Par exemple, à la figure 1, les cellules myéloïdes sont réparties dans plusieurs sous-ensembles cellulaires en fonction des similitudes de leurs modèles d'expression de 33 marqueurs de surface résultant de CyTOF (Figure 1)⁴. Ici nous avons étudié la moelle d'os de souris avec notre panneau précédemment rapporté de 39 marqueurs de CyTOF par l'analyse^deviSNE 7. l'analyse viSNE de nos données CyTOF a révélé une population cellulaire non identifiée qui a montré à la fois HSPC (CD117⁾et neutrophiles (Ly6G⁾(figure2)⁷.

En conclusion, nous présentons un protocole pour traiter la moelle osseuse entière fraîche pour l'analyse de CyTOF. Dans cet article, nous avons utilisé la moelle osseuse de souris comme exemple, tandis que ce protocole peut également être utilisé pour traiter des échantillons de moelle osseuse humaine. Les détails spécifiques aux échantillons de moelle osseuse humaine sont également notés dans le protocole. L'avantage de ce protocole est qu'il contient des détails tels que le temps d'incubation et la température qui ont été optimisés pour préserver les cellules de neutrophile dans toute la moelle osseuse pour permettre l'investigation sur la moelle osseuse entière intacte. Ce protocole peut également être facilement modifié pour les applications de cytométrie de débit activée par fluorescence.

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Protocole

Toutes les expériences ont suivi les directives approuvées du Comité d'allergie et d'immunologie des animaux de l'Institut La Jolla pour l'allergie et l'immunologie, et l'approbation de l'utilisation des rongeurs a été obtenue de l'Institut La Jolla pour l'allergie et l'immunologie selon les critères décrits dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health.

1. Récolte de la moelle osseuse de souris (BM)

1. Achetez des souris C57BL/6J auprès d'un fournisseur commercial. Nourrir le régime standard de chow de rongeur et la maison dans des cages de microisolateur dans une installation exempte d'agent pathogène.
2. Utilisez des souris mâles, âgées de 6 à 10 semaines, à des fins expérimentales. Euthanasier par inhalation de CO₂ suivie de la luxation cervicale.
3. Placez la souris sur un tampon chirurgical stérile avec le côté de l'abdomen vers le haut. Stérilisez la peau de l'abdomen et de la région des membres postérieurs en pulvérisant 70 % d'éthanol. Utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux de dissection pour couper la cavité abdominale ouverte.
4. Retirez la peau pour exposer les membres postérieurs. Utilisez une paire de forceps d'habillage à pointe émoussée pour tenir le tibia de la souris juste en dessous de la cheville. Utilisez une autre paire de forceps de pansement incurvés pour stabiliser le tibia sous les forceps d'habillage à pointe émoussée. Casser le tibia et exposer l'os en arrachant le muscle avec les forceps de pansement à pointe émoussée.
   NOTE: Le tibia est lâchement attaché à l'articulation du genou et peut être facilement choisi en utilisant les forceps de pansement à pointe émoussée.
5. Placer le tibia dans le froid 1x PBS.
6. Ensuite, déplacez les forceps de dressage incurvés stabilisants vers le bas vers le fémur. Faites glisser les forceps d'habillage à pointe émoussée sous l'articulation du genou et maintenez la rotule. Déloger la rotule en la tirant doucement vers le haut. Exposer le fémur en arrachant le muscle attaché à la rotule. Tenez le fémur exposé par les forceps de pansement courbés et coupez le fémur du fond de l'os à l'aide de ciseaux chirurgicaux disséquant.
7. Placer le fémur dans le froid 1x PBS.
8. Percer un trou dans un tube de microcentrifuge de 0,5 ml à l'aiguille de 18 G.
9. Placez le tibia et le fémur dans le même tube de microcentrifuge de 0,5 ml avec l'extrémité ouverte des os faisant face vers le bas au trou.
10. Placez le tube de 0,5 ml contenant à la fois le tibia et le fémur dans un tube de microcentrifuge de 1,7 ml.
11. Faites tourner les tubes à double couche contenant à la fois le tibia et le fémur à 5 510 x g pour 30 s dans la microcentrifuge.
12. Assurez-vous que le BM est extrait des os et granulé au fond du tube. Jere le tube de 0,5 ml contenant les os sacrés. La souris BM est prête pour les prochaines étapes.
    REMARQUE : La BM humaine est moissonnée aux ressources cliniques comme décrit précédemment¹¹.

2. Cellules De Tache BM pour CyTOF

1. Resuspendre le BM en 1 mL 1x Red Blood Cell (RBC) tampon de lyse. Pour la BM humaine, resuspendre l'ensemble bM dans un volume de 10x de 1x Red Blood Cell (RBC) tampon de lyse. Incuber pendant 10 min à température ambiante (RT).
2. Faire tourner le tube à 350 x g pendant 5 min à 4 oC. Pour le BM humain, répétez les étapes 2.1 et 2.2 avant de passer à l'étape 2.3.
3. Aspirez soigneusement le supernatant et laissez la pastille intacte. Suspendre le granule avec 1 mL de froid 1x PBS. Filtrer la pastille dans un tube conique de 15 ml à travers une passoire cellulaire de 70 m. Les cellules BM sont maintenant complètement isolées dans le tube à partir des débris musculaires et osseux. Laver les cellules en ajoutant 9 ml de froid 1x PBS dans le tube.
4. Faire tourner le tube de 15 ml à 350 x g pour 5min à 4 oC.
5. Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez les cellules BM avec 10 ml de PBS froid. Prenez un aliquot de cellules pour le comptage. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre.
6. Aliquot 5 x 10⁶ cellules BM dans un nouveau tube de 15 ml pour la coloration CyTOF.
7. Faire tourner l'aliquot à tube de 15 ml à 350 x g pendant 5 min à 4 oC.
8. Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez les cellules BM avec 125 nM Cisplatin dans 1 mL de CyTOF Staining Buffer comme indicateur de viabilité pour l'échantillon. Incuber pendant 5 min à RT.
9. Après l'incubation, ajouter 4 ml de tampon de coloration CyTOF au tube. Faire tourner le tube à 350 x g pendant 5 min à 4 oC. Pour la BM humaine, ajouter 10 % de sérum AB humain dans le tampon de coloration CyTOF.
10. Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez les cellules BM avec 50 L de solution de blocage du récepteur Fc. Incuber pendant 10 min à 4 oC. Passer cette étape pour l'homme BM.
11. Ajoutez 50 l du cocktail d'anticorps CyTOF maison⁵ à l'échantillon de sorte que le volume total de coloration est de 100 L. Mélanger délicatement la pipette. Incuber pendant 30 min à 4 oC. Le volume final du cocktail d'anticorps est de 100 l pour les échantillons de BM de souris et de BM humain.
12. Ajouter 2 ml de tampon de coloration CyTOF à chaque tube après l'incubation pour laver les cellules, faire tourner le tube à 350 x g pendant 5 min à 4 oC.
13. Répétez l'étape 2.12 pour un total de deux lavages.
14. Préparer une nouvelle solution de formaldéhyde de 1,6 % à partir de l'ampule de 16 % des actions. Diluer 1 partie du formaldéhyde de stock avec 9 parties de 1x PBS.
15. Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez le granule avec 1 ml de solution FA fraîche de 1,6%. Incuber pendant 15 min à RT.
16. Faire tourner le tube à 800 x g pendant 5 min à 4 oC.
17. Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez le granule de cellule avec la solution d'intercalation de 125 nM dans le tampon de correction/perm de 1 ml.
18. Incuber l'échantillon dans une solution d'intercalation pendant la nuit à 4 oC.

3. Préparer les cellules pour l'acquisition de CyTOF

1. Vortex et cellules de rotation doucement à 800 x g pendant 5 min à 4 oC.
2. Laver les cellules en ajoutant 2 ml de tampon de coloration CyTOF, faire tourner les cellules à 800 x g pendant 5 min à 4 oC et enlever le supernatant par aspiration.
3. Resuspendre les cellules en 1 mL de diH₂O. Réservez un petit volume (environ 10 L) de chaque tube pour compter les cellules.
4. Spin cellules à 800 x g pendant 5 min à 4 oC.
5. Répétez les étapes 3.3 et 3.4.
6. Aspirez soigneusement le supernatant et laissez les cellules dans la pastille. Les cellules BM sont maintenant prêtes à être suspendues à la concentration de 1 x 10⁶ cellules/mL pour l'acquisition de CyTOF.

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Résultats

La figure 1 est présentée comme un exemple résultant d'expériences CyTOF. Sur cette parcelle tSNE les cellules à travers plusieurs tissus de souris ont été regroupés en sous-ensembles basés sur la similitude de leurs profils d'expression de marqueur de surface mesurés par un panneau CyTOF de 33 paramètres. Les cellules avec des propriétés plus semblables ont été automatiquement regroupées comme les neutrophiles, les macrophages, ou les DC s'appuyant sur l'expression des 33 ma...

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Discussion

Au cours des dernières décennies, la cytométrie à base de fluorescence a été utilisée comme méthode principale pour étudier les lignées cellulaires et l'hétérogénéité^1,2,3. Bien que la cytométrie de flux ait fourni des données multidimensionnelles, cette méthode est limitée par des choix de paramètres et de chevauchement spectral. Pour surmonter la faiblesse de la cytométrie d'écoulement, nous avons profit?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF Antibodies (mouse)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y	Fluidigm	Cat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb	Fluidigm	Cat# 3176002B
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified	Biolegend	Cat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified	Biolegend	Cat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er	Fluidigm	Cat# 3166004B
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified	Biolegend	Cat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd	Fluidigm	Cat# 3148003B
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd	Fluidigm	Cat# 3142003B
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er	Fluidigm	Cat# 3167004B
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified	Biolegend	Cat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified	Biolegend	Cat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified	Biolegend	Cat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified	Biolegend	Cat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified	Biolegend	Cat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd	Fluidigm	Cat# 3146009B
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd	Fluidigm	Cat# 3156012B
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready	ThermoFisher	Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified	Biolegend	Cat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified	Biolegend	Cat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb	Fluidigm	Cat# 3159009B
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb	Fluidigm	Cat# 3174003B
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm	Fluidigm	Cat# 3169015B
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified	abcam	Cat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho	Fluidigm	Cat# 3165018B
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd	Fluidigm	(Clone H57-597)-143Nd
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
Antibody Stabilizer	CANDOR Bioscience	Cat# 130050
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	Cat# A4503
Cisplatin-194Pt	Fluidigm	Cat# 201194
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	ThermoFisher	Cat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	Cat# 00-4333-57
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	Cat# 201078
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	ThermoFisher	Cat# AM9260G
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	Cat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Saline solution	GE Lifesciences	Cat#SH30256.01
Intercalator-Ir	Fluidigm	Cat# 201192B
MAXPAR Antibody Labeling Kits	Fluidigm	http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	Cat# 158127
Sodium azide	Sigma-Aldrich	Cat# S2002
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Cat# X100
Trypsin EDTA 1x	Corning	Cat# 25-053-Cl
Experimental Model: Organism/Strains
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
Software Alogrithm
Bead-based Normalizer	Finck et al., 2013	https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
Cytobank	Cytobank	https://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0	Chen et al., 2016	https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNE	van der Maaten and Hinton, 2008	https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html