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この記事について

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要約

ここでは、好中球系統細胞の高次元質量細胞法(Time-Of-Flight、CyTOFによるサイトメトリー)分析のために、マウスまたはヒトから単離された新鮮な骨髄(BM)を処理するプロトコルを提示する。

要約

本稿では、BM CyTOF分析全体のために新しいBMで好中球系統細胞を保存するように最適化されたプロトコルを紹介する。このプロトコルを用いて、好中球系統細胞に焦点を当てた血統系を評価するために、骨髄バイアス39抗体CyTOFパネルを用いた。CyTOFの結果は、オープンリソースの次元低減アルゴリズムviSNEで分析され、データがこのプロトコルの結果を実証するために提示された。我々は、このプロトコルに基づいて新しい好中球系統細胞集団を発見した。新鮮な全BM調製のこのプロトコルは、1)、CyTOF分析を用いて、BM全体から未確認の細胞集団を発見し、2、白血病などの血液疾患を有する患者に対する全BM欠陥を調査し、3)の最適化を支援する。新鮮な全体BMを利用する蛍光活性化フローサイトメトリープロトコル。

概要

過去数十年の間に、サイトメトリー法はBMの人工システムを調査するための強力なツールとなっています。これらの方法には、蛍光活性化フローサイトメトリーおよび重金属標識抗体を用いたCyTOFの新しい方法が含まれる。彼らは、独自の表面マーカー発現プロファイルを同定することにより、異種生物標本における多くの細胞型の発見につながった。より多くのチャネルに関連するスペクトルの重複が増加すると、蛍光活性化フローサイトメトリーアプリケーションのデータ不正確性が高くなります。したがって、蛍光活性化フローサイトメトリー分析のために目的の細胞集団を濃縮するために、不要な細胞を日常的に除去する。例えば、Ly6G(またはGr-1)およびCD11bは成熟した骨髄細胞マーカーと見なされ、Ly6G+(またはGr-1+)およびCD11b+細胞は、フローサイトメトリー分析の前に磁気濃縮キットを使用してBMサンプルから定期的に除去される。造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)または1つのダンプカクテルチャネル1、2、3でこれらのマーカーを組み合わせることによって。もう一つの例は、好中球がヒト血液試料から日常的に除去され、免疫学的研究のために末梢血単核細胞(PBMC)を濃縮することである。しかし、マウスまたはヒトから分離された全骨髄は、サイトメトリー分析のために無傷で調査されることはめったにない。

最近、CyTOFは、ヘマトポエティックシステム4、5、6を調査するための画期的なツールとなっています。CyTOFでは、フルオロフォ標識抗体は、重元素レポーター標識抗体に置き換えられます。この方法は、スペクトルの重なりを気にすることなく、同時に40以上のマーカーの測定を可能にします。それは前の枯渇のステップかダンプチャネルなしで無傷の生物標本の分析を可能にした。そのため、従来の2次元フローサイトメトリープロットから高含有量の次元性を持つヘマトポエティックシステムを総合的に見ることができます。枯渇またはゲーティングプロセス中に過去に省略された細胞集団は、CyTOF4,5によって生成された高次元データを用いて明らかになるようになりました。我々は、骨髄リネージ7に焦点を当てた血統系の39のパラメータを同時に測定する抗体パネルを設計した。従来のフローサイトメトリーデータと比較して、CyTOFによって生成された前例のない単一細胞高次元データの解釈と可視化は困難です。計算科学者は、高次元データセットの可視化のための次元低減技術を開発しました。本稿では、T分散確率的近傍埋め込み(t-SNE)技術を用いてCyTOFデータを解析し、高次元構造を保存しながら2次元地図上で高次元結果を提示するアルゴリズムviSNEを用いた。データの8,9,10.tSNE プロットでは、同様のセルがサブセットにクラスタ化され、色を使用してセルのフィーチャが強調表示されます。例えば、図1では、ミエロイド細胞は、CyTOF(図1)4に起因する33の表面マーカーの発現パターンの類似性に基づいて、複数の細胞サブセットに分布している。ここでは、viSNE分析7により、以前に報告された39マーカーCyTOFパネルを用いてマウス骨髄を調べた。CyTOFデータのviSNE分析は、HSPC(CD117+)と好中球(Ly6G+)特性(図2)7の両方を示した未確認細胞集団を明らかにした。

結論として、我々はCyTOF分析のための新鮮な全骨髄を処理するためのプロトコルを提示する。この記事では、マウスの骨髄を例に、このプロトコルはヒト骨髄サンプルの処理にも使用できます。ヒト骨髄サンプルに特異的な詳細は、プロトコルにも記載されています。このプロトコルの利点は、インキュベーション時間や温度などの詳細が含まれており、骨髄全体の好中球系統細胞を維持し、無傷の骨髄全体の調査を可能にする。このプロトコルは、蛍光活性化フローサイトメトリーアプリケーションに対しても容易に改変されてもよい。

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プロトコル

すべての実験は、アレルギーと免疫学動物のケアと使用委員会のためのラホヤ研究所の承認されたガイドラインに従って、げっ歯類の使用のための承認は、アレルギーと免疫学のためのラホヤ研究所から記載された基準に従って得られました国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイド。

1. 収穫マウス骨髄(BM)

  1. 商用ベンダーから C57BL/6J マウスを購入します。病原体のない施設で、標準的なげっ歯類のチョウダイエットと家をミクロイソレーターケージで養います。
  2. 実験目的で、生後6~10週の雄マウスを使用する。CO2吸入によって安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を起ます。
  3. マウスを腹部側を上にして無菌手術パッドの上に置きます。70%エタノールを噴霧することにより、腹部および後肢領域の皮膚を殺菌する。解剖外科はさみを使用して腹腔を開きます。
  4. 後肢を露出させるために皮膚を取り除きます。鈍い先端のドレッシング鉗子のペアを使用して、足首のすぐ下にマウス脛痛を保持します。別の湾曲したドレッシング鉗子を使用して、鈍い先端のドレッシング鉗子の下の脛間を安定させます。脛骨を壊し、鈍い先端のドレッシング鉗子で筋肉を引き裂くことによって骨を露出させる。
    注:脛科は膝関節にゆるやかに取り付けられ、鈍い先端のドレッシング鉗子を使用して容易に選ぶことができる。
  5. 脛間を冷たい1x PBSに置く。
  6. 次に、安定した湾曲したドレッシング鉗子を大腿骨に下方に動かす。鈍い先端のドレッシング鉗子を膝関節の下にスライドさせ、膝蓋骨を保持します。膝蓋骨をそっと引き上げて脱臼します。膝蓋骨に取り付けられた筋肉を引き裂いて大腿骨を露出させる。湾曲したドレッシング鉗子によって露出した大腿骨を保持し、解剖外科はさみを使用して骨の底から大腿骨を切り取ります。
  7. 大腿骨を冷たい1x PBSに置く。
  8. 18 G 針で 0.5 mL マイクロ遠心管に穴を開けます。
  9. 脛骨と大腿骨の両方を同じ0.5 mLマイクロ遠心管に入れ、骨の開いた端を穴に向けます。
  10. 脛骨と大腿骨の両方を含む0.5 mLチューブを1.7mLマイクロ遠心管に入れます。
  11. 脛骨と大腿骨の両方を含む二重層チューブをマイクロ遠心分離機で30秒の5,510 x gで回転させます。
  12. BMが骨から抽出され、チューブの下部にペレットが付いていることを確認します。神聖な骨を含む0.5 mLチューブを50.5 mLを与えます。マウス BM は次のステップの準備ができています。
    注:ヒトBMは、前述の11として臨床資源で収穫される。

2. CyTOF用染色BM細胞

  1. 1 mL 1x 赤血球(RBC)リシスバッファーでBMを再中断します。ヒトBMの場合、BM全体を1x赤血球(RBC)の10倍の体積で再中断する。室温(RT)で10分間インキュベートします。
  2. チューブを350 x gで5分間4°Cで回転させます。人間の BM の場合は、ステップ 2.3 に進む前にステップ 2.1 と 2.2 を繰り返します。
  3. 慎重に上清を吸引し、ペレットを中断しないままにします。1 mLの冷たい1x PBSでペレットを再中断します。70 μm セル ストレーナーを通して 15 mL 円錐管にペレットをろ過します。BM細胞は現在、筋肉や骨の破片からチューブに完全に分離されています。チューブに9 mLの冷たい1x PBSを加えて細胞を洗浄します。
  4. 15 mL チューブを 350 x gで 5 分間 4 °C で回転させます。
  5. 上清を注意深く吸引し、10 mLの冷たいPBSでBM細胞を再中断する。カウントするセルのアリコートを取ります。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。
  6. CyTOF染色のための新しい15 mL管にアリコート5 x 106 BM細胞。
  7. 15 mL チューブ アリコートを 350 x gで 5 分間 4 °C で回転させます。
  8. 上清を注意深く吸引し、サンプルの生存率指標としてCyTOF染色バッファーの1mLで125 nMシスプラチンでBM細胞を再中断します。RTで5分間インキュベートします。
  9. インキュベーション後、チューブに4mLのCyTOF染色バッファーを添加する。チューブを350 x gで5分間4°Cで回転させます。ヒトBMの場合、CyTOF染色バッファーに10%のヒトAB血清を添加する。
  10. 上清を注意深く吸引し、50 μLのFc受容体遮断液でBM細胞を再中断する。4°Cで10分間インキュベートします。人間の BM の場合は、この手順をスキップします。
  11. 自家製CyTOF抗体カクテル5の50μLをサンプルに加え、総染色量が100μLに達するようにする。ミックスする穏やかなピペット。4°Cで30分間インキュベートします。抗体カクテルの最終容積は、マウスBMおよびヒトBMサンプルの両方に対して100μLである。
  12. 細胞を洗浄するためにインキュベーション後の各チューブにCyTOF染色バッファーの2 mLを追加し、4°Cで5分間350 x gでチューブを回転させます。
  13. 合計 2 回の洗い流しについて、手順 2.12 を繰り返します。
  14. 16%のストックアンプルから新鮮な1.6%ホルムアルデヒド溶液を準備します。ストックホルムアルデヒドの1部を1x PBSの9部で希釈します。
  15. 慎重に上清を吸引し、1 mL新鮮な1.6%FA溶液でペレットを再中断します。RTで15分間インキュベートします。
  16. チューブを800 x gで5分間4°Cで回転させます。
  17. 上清を注意深く吸引し、1mL固定/パーマバッファ内の125 nMインターカレーション溶液でセルペレットを再中断します。
  18. 4°Cで一晩インターカレーション溶液でサンプルをインキュベートします。

3. CyTOF取得のための細胞の準備

  1. 4°Cで5分間800 x gで穏やかに渦および紡錘細胞。
  2. CyTOF染色バッファーの2mLを添加して細胞を洗浄し、4°Cで5分間800xgで細胞をスピンし、吸引により上清を除去する。
  3. diH2O の 1 mL で細胞を再中断し、各チューブから少量 (約 10 μL) を予約して細胞を数えます。
  4. 4°Cで5分間800 x gで細胞を回転させます。
  5. 手順 3.3 と 3.4 を繰り返します。
  6. 慎重に上清を吸引し、ペレットに細胞を残します。BM細胞は、CyTOF取得のための1 x 106細胞/mLの濃度に再懸濁する準備が整いました。

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結果

図1は、CyTOF実験の結果として示す。このtSNEプロットでは、複数のマウス組織にまたがる細胞を、33パラメータCyTOFパネルによって測定された表面マーカー発現プロファイルの類似性に基づいてサブセットにクラスタ化した。より類似した特性を有する細胞は、各細胞の33マーカーの発現に基づいて、好中球、マクロファージ、またはDCなどの細胞を自動的に集積させた。<...

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ディスカッション

過去数十年にわたり、蛍光ベースのフローサイトメトリーは、細胞系統および不均一性1、2、3を研究する主な方法として使用された。フローサイトメトリーは多次元データを提供していますが、この方法はパラメータとスペクトルの重なりの選択によって制限されます。フローサイトメトリーの弱点を克服するために、蛍...

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開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

LJIフローサイトメトリーコアに対して、質量サイトメトリー手順の支援を賜りますようお礼申し上げます。この作業は、NIH助成金R01HL134236、P01HL136275、およびR01CA202987(すべてC.C.H)およびADA7-12-MN-31(04)(C.C.H.およびY.P.Z)によってサポートされました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
CyTOF Antibodies (mouse)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89YFluidigmCat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176YbFluidigmCat# 3176002B
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-PurifiedBiolegendCat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-PurifiedBiolegendCat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166ErFluidigmCat# 3166004B
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-PurifiedBiolegendCat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148NdFluidigmCat# 3148003B
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142NdFluidigmCat# 3142003B
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167ErFluidigmCat# 3167004B
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-PurifiedBiolegendCat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-PurifiedBD BiosciencesCat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-PurifiedBiolegendCat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-PurifiedBiolegendCat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-PurifiedBiolegendCat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-PurifiedBiolegendCat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146NdFluidigmCat# 3146009B
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156GdFluidigmCat# 3156012B
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar ReadyThermoFisherCat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-PurifiedBiolegendCat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-PurifiedBiolegendCat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159TbFluidigmCat# 3159009B
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-PurifiedBD BiosciencesCat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174YbFluidigmCat# 3174003B
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-PurifiedBD BiosciencesCat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169TmFluidigmCat# 3169015B
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-PurifiedabcamCat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165HoFluidigmCat# 3165018B
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-PurifiedBD BiosciencesCat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143NdFluidigm(Clone H57-597)-143Nd
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar ReadyBiolegendCat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
Antibody StabilizerCANDOR BioscienceCat# 130050
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichCat# A4503
Cisplatin-194PtFluidigmCat# 201194
eBioscience 1x RBC Lysis BufferThermoFisherCat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer SetThermoFisherCat# 00-4333-57
EQ Four Element Calibration BeadsFluidigmCat# 201078
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)ThermoFisherCat# AM9260G
Fetal Bovine SerumOmega ScientificCat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Saline solutionGE LifesciencesCat#SH30256.01
Intercalator-IrFluidigmCat# 201192B
MAXPAR Antibody Labeling KitsFluidigmhttp://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
ParaformaldehydeSigma-AldrichCat# 158127
Sodium azideSigma-AldrichCat# S2002
Triton X-100Sigma-AldrichCat# X100
Trypsin EDTA 1xCorningCat# 25-053-Cl
Experimental Model: Organism/Strains
Mouse: C57BL/6JThe Jackson LaboratoryStock No: 000664
Software Alogrithm
Bead-based NormalizerFinck et al., 2013https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
CytobankCytobankhttps://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0Chen et al., 2016https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNEvan der Maaten and Hinton, 2008https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html

参考文献

  1. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  2. Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
  3. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
  4. Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
  5. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  6. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
  7. Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
  8. Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
  9. Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
  10. van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).
  11. Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).
  12. Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).
  14. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nature Reviews in Immunology. , (2019).

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