Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per elaborare il midollo osseo fresco (BM) isolato dal topo o dall'uomo per l'analisi di citometria di massa ad alta dimensione (Cytometria da Time-Of-Flight, CyTOF) delle cellule di filo neutrofilo.

Abstract

In questo articolo, presentiamo un protocollo che è ottimizzato per preservare le cellule di lignaggio neutrofilo in BM fresco per l'intera analisi BM CyTOF. Abbiamo utilizzato un pannello CyTOF a 39 anticorpi di 39 anticorpi mieloidi per valutare il sistema ematopoietico con particolare attenzione alle cellule di linea di neutrofili usando questo protocollo. Il risultato CyTOF è stato analizzato con un algoritmo di riduzione dimensionale delle risorse aperte, viSNE, e i dati sono stati presentati per dimostrare l'esito di questo protocollo. Abbiamo scoperto nuove popolazioni di cellule di lignaggio neutrofia basate su questo protocollo. Questo protocollo di preparazione di BM intero fresco può essere utilizzato per 1), analisi CyTOF per scoprire popolazioni di cellule non identificate da tutta BM, 2), studiando interi difetti BM per i pazienti con disturbi del sangue come la leucemia, 3), assistendo l'ottimizzazione di cicli di citometria di flusso attivati a fluorescenza che utilizzano BM intero fresco.

Introduzione

Negli ultimi decenni, i metodi di citometria sono stati un potente strumento per studiare il sistema ematopoietico nel BM. Questi metodi includono la citometria di flusso attivata dalla fluorescenza e il nuovo metodo di CyTOF che utilizza anticorpi con etichettatura di metalli pesanti. Hanno portato a scoperte di molti tipi di cellule in un campione biologico eterogeneo identificando i loro profili unici di espressione dei marcatori di superficie. L'aumento delle sovrapposizioni di spettro associate a più canali porta a una maggiore imprecisione dei dati nelle applicazioni di citometria di flusso attivate dalla fluorescenza. Pertanto, le cellule indesiderate vengono regolarmente rimosse al fine di arricchire le popolazioni cellulari di interesse per l'analisi della citometria del flusso attivata dalla fluorescenza. Ad esempio, I marcatori di cellule mieloidi mature, ad esempio Ly6G (o Gr-1) e CD11b, vengono regolarmente rimossi dai campioni BM utilizzando kit di arricchimento magnetico prima dell'analisi della citometria di flusso cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HPG) o combinando questi marcatori in un unico canale cocktail di scarica^1,2,3. Un altro esempio è che i neutrofili vengono regolarmente rimossi dai campioni di sangue umano per arricchire le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) per gli studi immunologici. Il midollo osseo intero isolato dal topo o dall'uomo, tuttavia, è raramente studiato intatto per l'analisi della citometria.

Recentemente, CyTOF è diventato uno strumento rivoluzionario per studiare il sistema ematopoietico^4,5,6. Con CyTOF, gli anticorpi con etichettatura fluoroforo sono sostituiti da anticorpi etichettati come reporter ad elemento pesante. Questo metodo consente la misurazione simultanea di oltre 40 marcatori senza la preoccupazione di sovrapposizione dello spettro. Ha permesso l'analisi di campioni biologici intatti senza passaggi di pre-esaurimento o un canale di scarico. Pertanto, possiamo visualizzare il sistema ematopoietico in modo completo con dimensionalità ad alto contenuto da tradizionali grafici di citometria di flusso 2D. Le popolazioni cellulari omesse in passato durante il processo di deplezione o gating possono ora essere portate alla luce con i dati ad alta dimensione generati da CyTOF^4,5. Abbiamo progettato un pannello anticorpale che misura contemporaneamente 39 parametri nel sistema ematopoietico con un focus sul linaggio mieloide⁷. Rispetto ai dati convenzionali sulla citometria del flusso, l'interpretazione e la visualizzazione dei dati unidimensionali senza precedenti generati da CyTOF è difficile. Scienziati computazionali hanno sviluppato tecniche di riduzione della dimensionalità per la visualizzazione di set di dati ad alta dimensione. In questo articolo è stato utilizzato l'algoritmo viSNE, che utilizza la tecnica t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) per analizzare i dati CyTOF e per presentare il risultato di alta dimensione su una mappa bidimensionale conservando la struttura ad alta dimensione dei dati^8,9,10. Nel grafico tSNE, celle simili sono raggruppate in sottoinsiemi e il colore viene utilizzato per evidenziare la caratteristica delle celle. Ad esempio, nella Figura 1 le celle mieloidi vengono distribuite in diversi sottoinsiemi di celle in base alle somiglianze dei relativi modelli di espressione di 33 marcatori di superficie risultanti da CyTOF (Figura 1)⁴. Qui abbiamo studiato il midollo osseo del topo con il nostro pannello CyTOF di 39 marcatori segnalato in precedenza dall'analisi viSNE⁷. L'analisi viSNE dei nostri dati CyTOF ha rivelato una popolazionecellulare non identificata che hamostrato caratteristiche sia HSPC (CD117 ) che neutrofili (Ly6G ) (Figura 2)⁷.

In conclusione, presentiamo un protocollo per elaborare il midollo osseo intero fresco per l'analisi CyTOF. In questo articolo, abbiamo usato il midollo osseo del topo come esempio, mentre questo protocollo può essere utilizzato anche per elaborare campioni di midollo osseo umano. I dettagli specifici per i campioni di midollo osseo umano sono notati anche nel protocollo. Il vantaggio di questo protocollo è che contiene dettagli come il tempo di incubazione e la temperatura che sono stati ottimizzati per preservare le cellule di lignaggio di neutrofili in tutto il midollo osseo per consentire l'indagine sul midollo osseo intero intatto. Questo protocollo può anche essere facilmente modificato per le applicazioni di citometria di flusso attivate dalla fluorescenza.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti seguiti hanno approvato le linee guida del La Jolla Institute for Allergy and Immunology Animal Care and Use Committee, e l'approvazione per l'uso dei roditori è stata ottenuta dal La Jolla Institute for Allergy and Immunology secondo i criteri delineati in la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Sanità.

1. Raccoglitore del midollo osseo del mouse (BM)

1. Acquista topi C57BL/6J da un fornitore commerciale. Nutrire la dieta standard del chow del roditore e la casa in gabbie di microisolatore in una struttura priva di agenti patogeni.
2. Utilizzare topi maschi, 6-10 settimane di età, per scopi sperimentali. Eutanasia per inalazione di CO₂ seguita dalla lussazione cervicale.
3. Posizionare il mouse su un cuscinetto chirurgico sterile con il lato dell'addome verso l'alto. Sterilizzare la pelle dell'area dell'addome e degli arti posteriori spruzzando 70% etanolo. Utilizzare un paio di forbici chirurgiche dissecille per tagliare la cavità addominale aperta.
4. Rimuovere la pelle per esporre gli arti posteriori. Utilizzare un paio di pinze di vestire smussato-punta per tenere la tibia del mouse proprio sotto la caviglia. Utilizzare un altro paio di pinze di medicazione curve per stabilizzare la tibia sotto le pinze di medicazione con punta smussata. Rompere la tibia ed esporre l'osso strappando il muscolo con le pinze spogliatoio smussato-.
   NOT: La tibia è vagamente attaccata all'articolazione del ginocchio e può essere facilmente individuata utilizzando le pinze per la medicazione con punta smussata.
5. Mettere la tibia a freddo 1x PBS.
6. Successivamente, spostare le pinze curve stabilizzanti verso il basso verso il femore. Far scorrere le pinze contundenti sotto l'articolazione del ginocchio e tenere la rotula. Spogliare la rotula tirandola delicatamente verso l'alto. Esporre il femore strappando il muscolo attaccato alla rotula. Tenere il femore esposto dalle pinze di medicazione curva e tagliare il femore dal fondo dell'osso utilizzando forbici chirurgiche di sezionamento.
7. Mettere il femore a freddo 1x PBS.
8. Forare un foro nel tubo di microcentrifuga da 0,5 mL con un ago da 18 G.
9. Collocare sia la tibia che il femore nello stesso tubo di microcentrifuga da 0,5 mL con l'estremità aperta delle ossa rivolte verso il basso verso il foro.
10. Posizionare il tubo da 0,5 mL contenente sia tibia che femore in un tubo di microcentrifuga da 1,7 mL.
11. Girare i tubi a doppio strato contenenti sia tibia che femore a 5.510 x g per 30 s nella microcentrifuga.
12. Assicurarsi che il BM venga estratto dalle ossa e pelleta sul fondo del tubo. Sganciare il tubo da 0,5 mL contenente le ossa saldi. Il mouse BM è pronto per i passaggi successivi.
    NOTA: Il BM umano viene raccolto presso le risorse cliniche come descritto in precedenza¹¹.

2. Stain BM cellule per CyTOF

1. Risospendere il BM in 1 mL 1x macchia di lisi di cellsi rossa (RBC). Per la BM umana, risospendere l'intero BM in un volume 10x di 1x red Blood Cell (RBC) buffer di lisi. Incubare per 10 min a temperatura ambiente (RT).
2. Girare il tubo a 350 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Per BM umano, ripetere i passaggi 2.1 e 2.2 prima di procedere al passaggio 2.3.
3. Aspirare con attenzione il supernatore e lasciare il pellet senza interruzioni. Risospendere il pellet con 1 mL di PBS freddo 1x. Filtrare il pellet in un tubo conico da 15 mL attraverso un colino cellulare da 70 m. Le cellule BM sono ora completamente isolate nel tubo dal muscolo e dai detriti ossei. Lavare le cellule aggiungendo 9 mL di 1x PBS freddo nel tubo.
4. Girare il tubo da 15 mL a 350 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
5. Aspirare con attenzione il supernatante e risospendere le cellule BM con PBS freddo da 10 mL. Prendete un'aliquota di celle per il conteggio. Contare le cellule usando un emocitometro.
6. Aliquota 5 x 10^{6 cellule} BM in un nuovo tubo da 15 mL per la colorazione CyTOF.
7. Girare l'aliquota del tubo da 15 mL a 350 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
8. Aspirare con attenzione il supernatore e risospendere le cellule BM con 125 nM Cisplatin in 1 mL di CyTOF Staining Buffer come indicatore di vitalità per il campione. Incubare per 5 min a RT.
9. Dopo l'incubazione, aggiungere 4 mL di tampone di colorazione CyTOF al tubo. Girare il tubo a 350 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Per il BM umano, aggiungere il 10% del siero UMANO AB nel buffer di colorazione CyTOF.
10. Aspirare con attenzione il supernatante e risospendere le cellule BM con 50 .L di Fc Receptor soluzione di blocco. Incubare per 10 min a 4 gradi centigradi. Salta questo passaggio per il BM umano.
11. Aggiungere al campione 50 l del cocktail anticorpale CyTOF 5 fatto in casa in modo che il volume di colorazione totale sia 100 l. Delicatamente pipetta da mescolare. Incubare per 30 min a 4 gradi centigradi. Il volume finale del cocktail anticorpale è di 100-L sia per i campioni di BM del topo che per quelli umani.
12. Aggiungere 2 mL di cuscinetto di colorazione CyTOF ad ogni tubo dopo l'incubazione per lavare le cellule, ruotare il tubo a 350 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
13. Ripetere il passaggio 2.12 per un totale di due orme.
14. Preparare una soluzione di formaldeide fresca dell'1,6% dall'ampule di riserva del 16%. Diluire 1 parte della formaldeide stock con 9 parti di 1x PBS.
15. Aspirare con attenzione il supernatante e risospendere il pellet con 1 mL di soluzione FA fresca 1,6%. Incubare per 15 min a RT.
16. Girare il tubo a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
17. Aspirare con attenzione il supernatante e risospendere il pellet cellulare con soluzione di intercalazione 125 nM in 1 mL fix/perm buffer.
18. Incubare il campione in soluzione di intercalazione durante la notte a 4 gradi centigradi.

3. Preparare le celle per l'acquisizione CyTOF

1. Delicatamente vortice e spin cellule a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
2. Lavare le cellule aggiungendo 2 mL di buffer di colorazione CyTOF, ruotare le cellule a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e rimuovere il supernatante per aspirazione.
3. Risospendere le cellule in 1 mL di diH₂O. Riservare un piccolo volume (circa 10 o L) da ogni tubo per contare le cellule.
4. Ruotare le celle a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
5. Ripetere i passaggi 3.3 e 3.4.
6. Aspirare con attenzione il supernatante e lasciare le cellule nel pellet. Le cellule BM sono ora pronte per la sospensione alla concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/mL per l'acquisizione di CyTOF.

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Risultati

La figura 1 è presentata come risultato di esempio dagli esperimenti CyTOF. Su questa trama tSNE le cellule su più tessuti del topo sono state raggruppate in sottoinsiemi in base alla somiglianza dei loro profili di espressione dei marcatori di superficie misurati da un pannello CyTOF a 33 parametri. Le cellule con proprietà più simili sono state raggruppate automaticamente, come i neutrofili, i macrofagi o i controller di dominio in base all'espressione dei 33 marcatori su ogni cellula....

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Discussione

Negli ultimi decenni, la citometria di flusso basata sulla fluorescenza è stata utilizzata come metodo principale per studiare le linee cellulari e l'eterogeneità^1,2,3. Sebbene la citometria di flusso abbia fornito dati multidimensionali, questo metodo è limitato da scelte di parametri e sovrapposizione spettrale. Per superare la debolezza della citometria di flusso abbiamo approfittato di CyTOF, che utilizza isotopi di metal...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyTOF Antibodies (mouse)
Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y	Fluidigm	Cat# 3089005B
Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb	Fluidigm	Cat# 3176002B
Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified	Biolegend	Cat# 120402; RRID:AB_961070
Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified	Biolegend	Cat# 135502; RRID:AB_1937293
Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er	Fluidigm	Cat# 3166004B
Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified	Biolegend	Cat# 101101; RRID:AB_312774
Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd	Fluidigm	Cat# 3148003B
Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd	Fluidigm	Cat# 3142003B
Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er	Fluidigm	Cat# 3167004B
Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified	Biolegend	Cat# 149502; RRID:AB_2565302
Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 557787; RRID:AB_647340
Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified	Biolegend	Cat# 142402; RRID:AB_10916523
Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified	Biolegend	Cat# 149302; RRID:AB_2565277
Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified	Biolegend	Cat# 126502; RRID:AB_1027635
Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 137625; RRID:AB_2563744
Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified	Biolegend	Cat# 119302; RRID:AB_345280
Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 133919; RRID:AB_2565433
Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd	Fluidigm	Cat# 3146009B
Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd	Fluidigm	Cat# 3156012B
Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready	ThermoFisher	Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481
Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified	Biolegend	Cat# 113802; RRID:AB_313563
Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified	Biolegend	Cat# 105202; RRID:AB_313169
Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb	Fluidigm	Cat# 3159009B
Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 134321; RRID:AB_2563768
Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 554404; RRID:AB_395370
Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb	Fluidigm	Cat# 3174003B
Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 556003; RRID:AB_396287
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm	Fluidigm	Cat# 3169015B
Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified	abcam	Cat# ab53457; RRID:AB_881409
Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 127637; RRID:AB_2563784
Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho	Fluidigm	Cat# 3165018B
Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified	BD Biosciences	Cat# 552125; RRID:AB_394340
Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd	Fluidigm	(Clone H57-597)-143Nd
Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready	Biolegend	Cat# 116241; RRID:AB_2563789
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
Antibody Stabilizer	CANDOR Bioscience	Cat# 130050
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	Cat# A4503
Cisplatin-194Pt	Fluidigm	Cat# 201194
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer	ThermoFisher	Cat# 00-4333-57
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	Cat# 00-4333-57
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	Cat# 201078
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	ThermoFisher	Cat# AM9260G
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	Cat# FB-02
HyClone Phosphate Buffered Saline solution	GE Lifesciences	Cat#SH30256.01
Intercalator-Ir	Fluidigm	Cat# 201192B
MAXPAR Antibody Labeling Kits	Fluidigm	http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	Cat# 158127
Sodium azide	Sigma-Aldrich	Cat# S2002
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Cat# X100
Trypsin EDTA 1x	Corning	Cat# 25-053-Cl
Experimental Model: Organism/Strains
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
Software Alogrithm
Bead-based Normalizer	Finck et al., 2013	https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf
Cytobank	Cytobank	https://www.cytobank.org/
Cytofkit v1.r.0	Chen et al., 2016	https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html
t-SNE	van der Maaten and Hinton, 2008	https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html