Medición de interacciones transcelulares a través de la agregación de proteínas en un sistema celular heterologoso

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo optimizado para medir rápida y semicuantitativamente las interacciones ligando-receptor en trans en un sistema celular heterologoso utilizando microscopía de fluorescencia.

Resumen

Las interacciones proteicas en las interfaces celulares dictan una multitud de resultados biológicos que van desde el desarrollo de tejidos y la progresión del cáncer hasta la formación y mantenimiento de sinapsis. Muchas de estas interacciones fundamentales ocurren en trans y suelen ser inducidas por interacciones heterofílicas u homofílicas entre células que expresan pares de unión anclados por membrana. Dilucidar cómo las mutaciones relevantes para la enfermedad interrumpen estas interacciones proteicas fundamentales puede proporcionar una visión de una miríada de campos de biología celular. Muchos ensayos de interacción proteína-proteína no suelen desambiguar entre las interacciones cis y trans, lo que potencialmente conduce a una sobreestimación del grado de unión que se está produciendo in vivo e implican la purificación intensiva de proteínas y/o equipos de monitoreo especializados. Aquí, presentamos un protocolo simple optimizado que permite la observación y cuantificación de sólo interacciones trans sin necesidad de largas purificaciones de proteínas o equipos especializados. El ensayo de agregación celular HEK implica la mezcla de dos poblaciones independientes de células HEK, cada una expresando ligandos de cognato unidos a membrana. Después de un breve período de incubación, las muestras se muestran en imágenes y se cuantifican los agregados resultantes.

Introducción

Las interacciones sinápticas facilitadas por moléculas de adhesión sináptica son fundamentales para el desarrollo, la organización, la especificación, el mantenimiento y la función de las sinapsis y la generación de redes neuronales. La identificación de estas moléculas de adhesión celular transsináptica está aumentando rápidamente; por lo tanto, es fundamental identificar socios de unión y entender cómo estas nuevas moléculas de adhesión interactúan entre sí. Además, la secuenciación del genoma ha identificado mutaciones en muchas de estas moléculas de adhesión que comúnmente están relacionadas con una multitud de trastornos neurodesarrollo, neuropsiquiátrico y de adicción^1. Las mutaciones en genes que codifican para moléculas sinápticas de adhesión celular pueden alterar perjudicialmente las interacciones trans y pueden contribuir a alteraciones fisiológicas en la formación y el mantenimiento de sinapsis.

Existen múltiples ensayos para evaluar cuantitativamente las interacciones proteína-proteínas como calorimetría isotérmica, dichroismo circular, resonancia de plasmón superficial² y aunque de naturaleza cuantitativa, tienen varias limitaciones. En primer lugar, requieren proteínas recombinantes, a veces exigiendo pasos de purificación largos y tediosos. En segundo lugar, requieren sofisticados equipos especializados y conocimientos técnicos. En tercer lugar, pueden sobreestimar el grado de unión, ya que permiten interacciones cis y trans entre proteínas que están naturalmente atadas a una membrana in vivo. Aquí proponemos un ensayo simple y relativamente rápido que prueba exclusivamente las interacciones trans.

Para eludir muchas de las complicaciones asociadas con los ensayos de proteínas purificadas, hemos optimizado un ensayo de interacción proteica basado en células que recapitula las interacciones trans en un sistema celular heterologoso reducido. Este ensayo se ha utilizado previamente en varias formas para estudiar interacciones transcelulares. En este enfoque, las moléculas de adhesión celular candidatas se transfectan en células HEK293T. En condiciones fisiológicas, las células HEK293T no exhiben autoagregación, por lo que son modelos ejemplares para este ensayo. Sin embargo, cuando se combinan poblaciones individuales de células HEK que expresan receptor y ligando, la unión del receptor y el ligando obliga a que se produzca la agregación de células HEK. Esta agregación se media exclusivamente mediante interacciones trans y suele ser observable en decenas de minutos. No se requieren pasos de purificación de proteínas en este método, y la eficiencia del método se basa en el paradigma de que las poblaciones de células HEK que expresan moléculas de adherencia de cognato se están combinando y luego se tienen imágenes sólo decenas de minutos más tarde. Además, este método es relativamente barato, ya que no se requieren anticuerpos ni equipos costosos. El único equipo necesario para la adquisición de datos es un microscopio fluorescente estándar. Una ventaja adicional a este ensayo basado en células es la capacidad de examinar rápidamente el efecto de las mutaciones puntuales relevantes de la enfermedad en las interacciones trans. Esto se puede realizar mediante la transfectación de células HEK con CDNAs de las variantes mutantes de la proteína de interés.

En este protocolo, presentamos un ejemplo en el que investigamos si una mutación de missense en Neurexin3α (Neurexin3α^A687T),identificada en un paciente diagnosticado con profunda discapacidad intelectual y epilepsia, altera las interacciones en trans con la proteína transmembrana repetida rica en leucina 2 (LRRTM2). Neurexin3α es miembro de la familia evolutivamente conservada de moléculas presintáticas de adhesión celular y aunque el trabajo reciente ha identificado múltiples roles en la sinapsis^3,4,5,6,7,nuestra comprensión sináptica de esta molécula y todos los miembros de la familia de la neurexina sigue incompleta. LRRTM2 es una proteína de adherencia de células postsinápticas excitatorias que participa en la formación y mantenimiento de sinapsis^8,9,10. Es importante destacar que LRRTM2 interactúa exclusivamente con isoformes de neurexina que carecen del sitio de empalme 4 exones alternativos (SS4-) pero no con isoformes de neurexina que contienen el sitio de empalme 4 exones alternativos (SS4+). La mutación de missense humano (A687T) identificada en Neurexin3α se encuentra en una región extracelular no auditada que se conserva evolutivamente y se conserva entre todas las neurexinas alfa^7. Como la interacción entre estas dos moléculas se ha establecido^8,9,11, planteamos la pregunta: ¿la capacidad de unión de Neurexin3α SS4- a LRRTM2 alterada por una mutación de punto A687T? Este ensayo reveló que la mutación del punto A687T mejoró inesperadamente la agregación de Neurexin3α a LRRTM2, lo que sugiere que la región extracelular en la que se encuentra la mutación de puntos desempeña un papel en la mediación de las interacciones transsintápticas.

Protocolo

1. Cultivo celular y transfección

1. Hacer medios celulares HEK con DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) complementado con glucosa de 4,5 g/L, piruvato de L-glutamina y sodio y 10% FBS. Filtro estéril.
2. Predeterminar ligandos y receptores adecuados para el ensayo de agregación.
   NOTA: Neurexin3α SS4+/- y uno de sus ligandos conocidos, LRRTM2, fueron utilizados en este estudio. Ligandos y receptores de interés se expresaron a partir de CDNAs en pcDNA3.1. Se utilizó un conjunto Gibson para insertar Neurexin3α en pcDNA3.1¹². Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTCTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. Prepare las células HEK293T.
   1. Cultivar células HEK293T a la confluencia en un matraz T-75.
   2. Una vez confluente, utilice 2 ml de trypsin y colóquelo en una incubadora de 37 °C durante 2 min. Agregue 6 ml de soporte HEK al matraz para volver a usar las células y transferir los 8 ml a un tubo cónico de 15 ml.
   3. Pellet a 500 x g durante 5 min y resuspend en medios celulares HEK para un total de 8 mL.
   4. Contar células y añadir 735.000 células en cada pozo de una placa de 6 pozos. Ajuste el volumen final a 2 ml para cada pozo utilizando medios de celda HEK.
   5. Colocar en incubadora de 37 °C y permitir que las células crezcan durante la noche o hasta que alcancen el 50-60% de confluencia.
4. Transfectar células HEK293T utilizando el método de fosfato de calcio¹³.
   1. Transfectar bien-1 con 3 μg de la proteína de interés y co-transfecto con 1 μg de proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- y 1 μg de mCherry).
   2. Transfecto bien-2 como en el paso 1.4.1. pero con la proteína mutada de interés (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-).
   3. Transfectar bien-3 con 3 μg del ligando de interés y co-transfecto con 1 μg de otra proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1 LRRTM2 y 1 μg de GFP).
   4. Transfecto bien-4 y bien-5 para servir como controles negativos: bueno-4 con 1 μg de GFP y bien-5 con 1 μg de mCherry.
   5. Preparar otra placa (como en el paso 1.4.1-1.4.4) si requiere condiciones o controles adicionales (Neurexin3α^WT/A687T SS4+).
      NOTA: La eficiencia de transfección se analiza 24 h después de la transfección bajo un microscopio de epifluorescencia y cuantificada como el número de células que expresan la proteína fluorescente con la que fueron transfectadas. Un enfoque más simplificado incluiría la transfección de células HEK con una codificación vectorial bicistrónica para una proteína fluorescente y el ligando de interés y es muy recomendable por encima de la co-transfección. En el caso de este estudio, las neurexinas alfa son ~4.3 kb y se observó baja intensidad de fluorescencia utilizando un sistema bicistrónico que requiere co-transfección.
5. 48 horas después de la transfección, cosechar células para la agregación.
   1. Lave cada pozo dos veces con PBS.
   2. Agregue 1 ml de EDTA de 10 mM en PBS en cada pozo para disociar suavemente las interacciones de célula a célula e incubar la placa a 37 °C durante 5 minutos.
      NOTA: Trypsin no se recomienda para el paso 1.5.2 debido a un posible escote proteolítico de moléculas de adhesión en estudio. Además, después de la adición de EDTA, es posible que el protocolo no se detenga hasta su finalización, ya que las celdas ahora estarán expuestas a condiciones ambientales.
   3. Toque suavemente la placa para separar las células y cosechar cada pozo en tubos cónicos separados de 15 ml.
   4. Centrífuga tubos cónicos a 500 x g y temperatura ambiente durante 5 min.
6. Mientras las células están peletizando, prepare 6 tubos de incubación etiquetando la parte superior de cada tubo de microcentrífuga con cada condición.
   NOTA: Cada permutación de las condiciones GFP y mCherry debe utilizarse para abarcar todas las condiciones experimentales y controles adecuados. Por ejemplo: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3α^WT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3α^WT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Haga tubos adicionales para adaptarse a otras condiciones y controles.
7. Retire las células sobrenadantes y resuspend en 500 μL de medios HEK con 10 mM CaCl₂ y 10 mM MgCl₂ calentado a 37 °C.
   NOTA: La adición de CaCl₂ y MgCl₂ permite que las moléculas de adhesión restablezcan la unión y sólo es necesaria si los socios de interacción transcelular en cuestión requieren cationes divalentes para la adhesión.
8. Cuente las células de cada tubo cónico de 15 ml utilizando un hemociclo y aliquot 200.000 células de cada condición en el tubo apropiado desde el paso 1.6.1 para una mezcla de 1:1 en un volumen total de 500 μL.
   NOTA: Solo se debe tomar 5 minutos por condición para contar y alicuar cantidades.
9. Incubar tubos a temperatura ambiente en un rotador de tubo lento.

2. Adquisición de imágenes

1. Optimice los parámetros de adquisición de microscopios para muestras específicas. En este ejemplo, las imágenes se tomaron en un microscopio de campo ancho. Utilice un objetivo de aire 5x (NA: 0.15; WD: 20000 μm) para obtener un campo lo suficientemente grande para su análisis.
2. Evalúe la agregación basal inmediatamente después de mezclar las dos condiciones de las células HEK en el paso 1.8. Estas son ahora las imágenes de "tiempo cero".
   1. Pipeta 40 μL de cada mezcla de muestra en una diapositiva de microscopio cargada e imagen bajo fluorescencia en los canales 488 y 561.
   2. Adquiera tres campos de visión diferentes en un plano de enfoque por caída de muestra.
3. Adquiere imágenes finales a 60 min como la imagen de 'time 60'.
   1. Para obtener la imagen de "tiempo 60" de la mezcla después de una incubación de 60 minutos, tome otra muestra de 40 μL de cada condición de tubos giratorios y pipeta cada muestra en una diapositiva cargada. Imagen como en el paso 2.2.2.
      NOTA: La agregación celular debe comprobarse cada 15 minutos hasta que se produzca la saturación. El momento de la agregación dependerá de las proteínas que se prueben.

3. Análisis de ImageJ/Fiji

1. Para cuantificar el alcance de la agregación mediante Fiji/ImageJ, guarde los archivos de análisis.
   1. Guarde los archivos de codificación suplementarios proporcionados en la carpeta de macros imageJ del equipo.
   2. Instale la macro de agregación proporcionada (plugins, macros, install y seleccione el archivo "AggregationAssay.txt").
2. Determinar umbrales.
   1. Cargue un archivo de .tif 'time zero' en imageJ y divida los canales(Image | Color | Canales divididos).
      NOTA: La imagen 'time zero' se utiliza para determinar el umbral y el tamaño de puncta más pequeño para todo el experimento.
   2. Enmascarar cada canal(Plugins | Macros | AggregationAssay_MakeMask). Aparecerá la ventana Crear máscara desde imagen. Marque las casillas situadas junto a Determinar umbral para la imagen y determinar parámetros de clúster a partir de histograma y haga clic en Aceptar.
   3. Determine el umbral de la imagen mediante la barra de diapositivas, registre el número a la derecha de la barra de diapositivas y haga clic en Aceptar.
   4. Aparecerá un histograma de tamaño de clúster. Seleccione un tamaño de clúster en el histograma que se adapte al experimento, escriba este número en el cuadro Tamaño mínimo del clúster: y haga clic en Aceptar. Los clústeres por debajo de este tamaño no se analizarán.
3. Ejecute el análisis.
   1. Abra la imagen 'time 60' de la condición 1 en imageJ y divida los canales como en el paso 3.2.1.
   2. Enmascara cada canal (Plugins, Macros, AggregationAssay_MakeMask). Utilice el mismo umbral y tamaño determinados en los pasos 3.2.3 y 3.2.4. Anule la selección de los cuadros situados junto a Determinar umbral para imagen y Determinar parámetros de clúster a partir de Histograma y escriba manualmente el tamaño y los umbrales en los campos adecuados y, a continuación, haga clic en Aceptar.
   3. Calcular el índice de agregación (Plugins | Macros | AggregationAssay_CalculateOverlap). Seleccione los canales enmascarados que desea comparar y el directorio en el que se guardarán los archivos resultantes.
   4. Repita los pasos 3.3.1–3.3.3 por cada imagen de "tiempo 60" en cada condición.
      NOTA: El índice de agregación se define como el área de superposición total dividida por la suma de las dos áreas de canal menos el área de superposición multiplicada por 100 (Índice de agregación = área de superposición/[área del canal 1 + área del canal 2 – área de superposición] x 100). Esta normalización es una operación 'OR' entre los dos canales enmascarados que representan el total de píxeles de cualquiera de las máscaras.

Resultados

La mutación A687T aumenta la unión de Neurexin3α SS4 a LRRTM2⁷
Para investigar cómo las interacciones intercelulares de dos proteínas sinápticas conocidas se ven afectadas por la introducción de una mutación puntual encontrada en un paciente con discapacidad intelectual y epilepsia, utilizamos el ensayo de agregación celular HEK anterior (Figura 1). Las células fueron transfectadas de acuerdo con la sección 1 y preparadas para la toma de imágenes de...

Discusión

La disección de las interacciones proteína-proteínas que se producen en trans durante la adhesión celular puede conducir a una mejor comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a los procesos celulares básicos, incluyendo la formación, función y mantenimiento de sinapsis durante la maduración y remodelación. Las implicaciones de las interacciones de célula a célula se expanden más allá de la neurobiología y tienen un papel más amplio en la transducción de la señal, la migración celular y el d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL disposable microtubes with snap caps	VWR	89000-028	Incubation of mixed population of HEK cells
1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane	Thermo Fisher	567-0020	Sterilization of HEK media
15 mL SpectraTube centrifuge tubes	Ward’s Science	470224-998	Harvesting HEK cells
6 well sterile tissue culture plates	VWR	100062-892	culturing HEK cells
Calcium Chloride	Sigma	223506-500G	Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension
Centrifuge- Sorvall Legend RT	Kendro Laboratory Products	75004377	Harvesting HEK cells
CO2 cell incubator	Thermo Scientific	HERACELL 150i	Incubation of HEK cells during growth
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV	HEK cell maintenance
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)	Gibco	14190-144	Passaging/harvesting HEK cell
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	ED-500G	Harvesting HEK cells
Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area	Corning	9381M26	Culturing HEK cells
Fetal Bovine Serum	Sigma	17L184	HEK cell maintenance
HEK293T cells	ATCC		Model system
ImageJ	NIH	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	Image analysis
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma	M9272-500G	HEK cell resuspension
Sodium phosphate dibasic anhydrous	Fisher BioReagents	BP332-500	Calcium phosphate transfection
Trypsin 0.25% (1X) Solution	GE Healthcare Life Sciences	SH30042.01	Passaging HEK cells
Tube rotator			Incubation of mixed population of HEK cells
UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged	Denville Scientific Inc.	M1021	Image acquisition
Wide-field microscope	Zeiss	Axio Vert 200M	Image acquisition