Heterolog Hücre Sisteminde Protein Toplama Yoluyla Hücrelerarası Etkileşimlerin Ölçülmesi

Özet

Burada, floresan mikroskopisi kullanarak heterolog bir hücre sisteminde transta ligand-reseptör etkileşimlerini hızlı ve yarı niteliksel olarak ölçmek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Özet

Hücresel arayüzlerdeki protein etkileşimleri, doku gelişimi ve kanserin ilerlemesinden sinaps oluşumu ve bakımına kadar çok sayıda biyolojik sonucu belirler. Bu temel etkileşimlerin çoğu transta gerçekleşir ve tipik olarak membran bağlantılı bağlama çiftlerini ifade eden hücreler arasındaki heterofilik veya homofilik etkileşimler tarafından indüklenir. Hastalıkla ilgili mutasyonların bu temel protein etkileşimlerini nasıl bozduğunun aydınlatıcı olması, sayısız hücre biyolojisi alanı hakkında fikir verebilir. Birçok protein-protein etkileşim tahlilleri tipik olarak cis ve trans etkileşimleri arasında ayrım yapmaz, bu da potansiyel olarak in vivo olarak meydana gelen ve protein ve / veya özel izleme ekipmanının emek yoğun saflaştırılmasını içeren bağlama kapsamının aşırı tahmin edilmesine yol açar. Burada, uzun protein saflaştırmalarına veya özel ekipmanlara ihtiyaç duymadan sadece trans etkileşimlerin gözlemlenmesine ve ölçülmesine izin veren optimize edilmiş basit bir protokol sunuyoruz. HEK hücre toplama tahlili, her biri membran bağlı konyak ligandlarını ifade eden iki bağımsız HEK hücresi popülasyonunun karıştırılmasıdır. Kısa bir kuluçka süresinden sonra, örnekler görüntülenir ve elde edilen agregalar ölçülür.

Giriş

Sinaptik yapışma molekülleri tarafından kolaylaştırılan sinaptik etkileşimler, sinapsların gelişimi, organizasyonu, spesifikasyonu, bakımı ve işlevi ve sinir ağlarının üretimi için temeldir. Bu transsynaptik hücre yapışma moleküllerinin tanımlanması hızla artmaktadır; bu nedenle, bağlayıcı ortakları tanımlamak ve bu yeni yapışma moleküllerinin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini anlamak temel olarak önemlidir. Ek olarak, genom dizilimi, yaygın olarak çok sayıda nörogelişimsel, nöropsikiyatrik ve bağımlılık bozukluğu ile bağlantılı olan bu yapışma moleküllerinin çoğunda mutasyonlar tanımlamıştır¹. Sinaptik hücre yapışma moleküllerini kodlayan genlerdeki mutasyonlar trans etkileşimlerini zararlı bir şekilde değiştirebilir ve sinaps oluşumunda ve bakımında patofizyolojik değişikliklere katkıda bulunabilir.

İzotermal kalorimetre, dairesel dikroizm, yüzey plazmon rezonansı² gibi protein-protein etkileşimlerini nicel olarak değerlendirmek için birden fazla tahlil mevcuttur ve doğada nicel olmasına rağmen, birkaç sınırlamaları vardır. İlk olarak, bazen uzun ve sıkıcı saflaştırma adımları gerektiren rekombinant protein gerektirirler. İkincisi, sofistike özel ekipman ve teknik uzmanlık gerektirirler. Üçüncüsü, doğal olarak bir membran in vivo'ya bağlı proteinler arasında hem cis hem de trans etkileşimlerine izin verdikleri için bağlamanın kapsamını abartabilirler. Burada sadece trans etkileşimlerini test eden basit ve nispeten hızlı bir test öneriyoruz.

Saflaştırılmış protein testleriyle ilişkili komplikasyonların çoğunu atlatmak için, azaltılmış heterolog hücre sisteminde trans etkileşimlerini yeniden sağlayan hücre bazlı bir protein etkileşimi testini optimize ettik. Bu test daha önce hücrelerarası etkileşimleri incelemek için çeşitli şekillerde kullanılmıştır. Bu yaklaşımda aday hücre yapışma molekülleri HEK293T hücrelerine aktarılır. Fizyolojik koşullarda, HEK293T hücreleri kendi kendine toplama sergilemez, bu da onları bu test için örnek modeller haline getirir. Bununla birlikte, reseptör ve ligand ifade eden HEK hücrelerinin bireysel popülasyonları birleştirildiğinde, reseptörün bağlanması ve ligand HEK hücrelerinin toplanmasına zorlar. Bu toplama sadece trans etkileşimleri tarafından aracılık edilir ve genellikle onlarca dakika içinde gözlemlenebilir. Bu yöntemde protein saflaştırma adımlarına gerek yoktur ve yöntemin verimliliği, kognate yapışma moleküllerini ifade eden HEK hücrelerinin popülasyonlarının birleştirildiği ve sadece on dakika sonra görüntülandığı paradigmasına dayanır. Ek olarak, bu yöntem nispeten ucuzdur, çünkü ne antikorlar ne de pahalı ekipmanlar gereklidir. Verilerin eldei için gerekli olan tek ekipman standart bir floresan mikroskoptur. Bu hücre bazlı testin ek bir avantajı, hastalıkla ilgili nokta mutasyonlarının trans etkileşimleri üzerindeki etkisini hızlı bir şekilde tarama yeteneğidir. Bu, ilgi çekici proteinin mutant varyantlarının cDNA'ları ile HEK hücrelerinin transfecting ile gerçekleştirilerek gerçekleştirilebilir.

Bu protokolde, derin zihinsel engellilik ve epilepsi tanısı alan bir hastada tanımlanan Neurexin3α'daki (Neurexin3α^A687T)bir yanlış beyin mutasyonu,lösin bakımından zengin tekrarlayan transmembran protein 2 (LRRTM2) ile trans etkileşimlerini değiştirip değiştirmediğini araştırdığımız bir örnek sunuyoruz. Neurexin3α, evrimsel olarak korunmuş presinaptik hücre yapışma molekülleri ailesinin bir üyesidir ve son çalışmalar sinaps³, 4^,5^,6,7'debirden fazla rol belirlemiş olsa da, bu molekül ve neüroksin ailesinin tüm üyelerine ilişkin sinaptik anlayışımız eksik kalır. LRRTM2, sinaps oluşumu ve bakımı 8^,9,10'akatılan uyarıcı bir postynaptik hücre yapıştırma proteinidir. Daha da önemlisi, LRRTM2 sadece splice bölgesi 4 alternatif eksondan (SS4-) yoksun neurexin izoformları ile etkileşime girer, ancak splice bölgesi 4 alternatif ekson (SS4 +) içeren neurexin izoformları ile etkileşime girmez. Neurexin3α'da tanımlanan insan missense mutasyonu (A687T), evrimsel olarak korunan ve tüm alfa neurexins⁷arasında korunan, unstudied hücre dışı bir bölgede bulunur. Bu iki molekül arasındaki etkileşim^{kurulduğundan 8,9,11}, şu soruyu ortaya attık: Neurexin3α SS4- to LRRTM2'nin bağlanma kabiliyeti bir A687T nokta mutasyonu ile mi değiştirildi? Bu tahlil, A687T nokta mutasyonunun beklenmedik bir şekilde Neurexin3α'nın toplanmasını LRRTM2'ye artırdığını ve nokta mutasyonunun bulunduğu hücre dışı bölgenin transsinaptik etkileşimlere aracılık etmede rol oynadığını ortaya koydu.

Protokol

1. Hücre kültürü ve transfeksiyon

1. DMEM, 1x (Dulbecco'nun Eagle's Medium Modifikasyonu) ile 4,5 g/L glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat ve %10 FBS ile desteklenmiş HEK hücre ortamı yapın. Steril filtre.
2. Toplama tahlilleri için predetermin uygun ligandlar ve reseptörler.
   NOT: Bu çalışmada Neurexin3α SS4+/- ve bilinen ligandlarından biri olan LRRTM2 kullanılmıştır. Ligandlar ve ilgi reseptörleri pcDNA3.1'deki cDNA'lardan ifade edildi. Neurexin3α'yı pcDNA3.1^12'yeyerleştirmek için bir Gibson montajı kullanıldı. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATCTGCAGAATTCTTACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. HEK293T hücrelerini hazırlayın.
   1. HEK293T hücrelerini tek bir T-75 şişesinde izdiah etmek için büyütün.
   2. Birleştiğinde, 2 mL tripsin kullanın ve 2 dakika boyunca 37 °C inkübatöre yerleştirin. Hücreleri yeniden çıkarmak için şişeye 6 mL HEK ortamı ekleyin ve 8 mL'nin tamamını 15 mL konik bir tüpe aktarın.
   3. 5 dakika boyunca 500 x g'da pelet ve toplam 8 mL için HEK hücre medyasında yeniden dirildi.
   4. Hücreleri sayın ve 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 735.000 hücre ekleyin. HEK hücre ortamı kullanarak her kuyu için son ses seviyesini 2 mL'ye ayarlayın.
   5. 37 °C inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin bir gecede veya% 50-60 izdiah edene kadar büyümesine izin verin.
4. Kalsiyum fosfat yöntemini kullanarak HEK293T hücrelerini transfect¹³.
   1. Well-1'i 3 μg faiz proteini ile transfect ve 1 μg floresan protein (3 μg pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- ve 1 μg mCherry) ile birlikte transfect.
   2. 1.4.1 adımında olduğu gibi well-2'ye transfect. ancak mutasyona uğramış ilgi proteini ile (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-).
   3. 3 μg faizli ligand ile well-3'ü transfect ve 1 μg başka bir floresan protein (3 μg pcDNA3.1 LRRTM2 ve 1 μg GFP).
   4. Negatif kontroller olarak hizmet etmek için kuyu-4 ve kuyu-5'i transfect: 1 μg GFP ile well-4 ve 1 μg mCherry ile well-5.
   5. Ek koşullar veya kontroller (Neurexin3α^WT/A687T SS4+) gerekiyorsa başka bir plaka hazırlayın (adım 1.4.1-1.4.4'te olduğu gibi).
      NOT: Transfeksiyon verimliliği, bir epifluoresans mikroskobu altında transeksiyondan 24 saat sonra analiz edilir ve transektife edildikleri floresan proteini ifade eden hücre sayısı olarak ölçülür. Daha aerodinamik bir yaklaşım, HEK hücrelerinin floresan bir protein ve ilgi alanı için bicistronic vektör kodlaması ile transfectionını içerecektir ve ko-transfection üzerinde şiddetle tavsiye edilir. Bu çalışmada alfa Neurexins ~4.3 kb'dir ve ko-transfeksiyon gerektiren bir bicistronik sistem kullanılarak düşük floresan yoğunluğu gözlenmiştir.
5. Transfection'dan 48 saat sonra, toplama için hücreleri toplar.
   1. PBS ile her kuyuya iki kez yıkayın.
   2. Hücreden hücreye etkileşimleri nazikçe ayırmak ve plakayı 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırmak için her kuyuya PBS'de 1 mL 10 mM EDTA ekleyin.
      NOT: Çalışmada yapışma moleküllerinin potansiyel proteolitik bölünmesi nedeniyle 1.5.2. adım için tripsin önerilmez. Ayrıca, EDTA eklendikten sonra, hücreler artık ortam koşullarına maruz kalacağından, protokol tamamlanana kadar durdurulmayabilir.
   3. Hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe dokunun ve her kuyuyu ayrı 15 mL konik tüpler halinde hasat edin.
   4. 500 x g'da santrifüj konik tüpler ve 5 dakika oda sıcaklığında.
6. Hücreler peletlenirken, her mikrosantrifüj tüpünün üstünü her koşulda etiketleyerek 6 kuluçka tüpü hazırlayın.
   NOT: GFP ve mCherry koşullarının her permütasyonu, tüm deneysel koşulları ve uygun kontrolleri kapsayacak şekilde kullanılmalıdır. Örneğin: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3α^WT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3α^WT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Daha fazla koşul ve kontrole uyum sağlamak için ek tüpler yapın.
7. 10 mM CaCl 2 ve 10 mM MgCl 2 ile 37 °C'ye_{ısıtılmış} 500_μL HEK ortamdaki süpernatant ve resuspend hücrelerini çıkarın.
   NOT: CaCl₂ ve MgCl_2'nin eklenmesi, yapışma moleküllerinin bağlamayı yeniden kurmasını sağlar ve yalnızca söz konusu hücrelerarası etkileşim ortakları yapışma için dalgıç katyonları gerektiriyorsa gereklidir.
8. Her 15 mL konik tüpteki hücreleri bir hemositometre ve aliquot 200.000 hücre kullanarak, toplam 500 μL hacimde 1:1 karışım için adım 1.6.1'den uygun tüpe sayın.
   NOT: Saymak ve aliquot miktarları için koşul başına sadece 5 dakika sürmelidir.
9. Tüpleri oda sıcaklığında yavaş bir tüp rotatorunda kuluçkaya yatırın.

2. Görüntü alımı

1. Belirli numuneler için mikroskop alma parametrelerini optimize edin. Bu örnekte, görüntüler geniş alan mikroskopunda alınmıştır. 5x hava hedefi kullanın (NA: 0.15; WD: 20000 μm) analiz için yeterince büyük bir alan elde etmek için.
2. 1.8. adımda HEK hücrelerinin iki koşulunun karıştırılmasından hemen sonra taban çizgisi toplamayı değerlendirin. Bunlar artık 'sıfır zamanı' görüntüleri.
   1. Pipet 40 μL her örnek karışımın yüklü bir mikroskop slayt ve görüntü floresan altında hem 488 hem de 561 kanallarda.
   2. Örnek bırakma başına bir odak düzleminden üç farklı görüş alanı elde edin.
3. 'Time 60' görüntüsü olarak 60 dakikada son görüntüleri elde edin.
   1. 60 dakikalık bir inkübasyondan sonra karışımın 'time 60' görüntüsünü elde etmek için, dönen tüplerden her durumun 40 μL'lik bir örneğini daha alın ve her numuneyi yüklü bir kaydırağa pipetleyin. Resim adım 2.2.2'deki gibi.
      NOT: Doygunluk gerçekleşene kadar hücre toplama her 15 dakikada bir kontrol edilmelidir. Toplamanın zamanlaması test edilen proteinlere bağlı olacaktır.

3. ImageJ/Fiji Analizi

1. Fiji/ImageJ kullanarak toplamanın kapsamını ölçmek için analiz dosyalarını kaydedin.
   1. Sağlanan Ek kodlama dosyalarını bilgisayardaki imageJ makrolar klasörüne kaydedin.
   2. Sağlanan toplama makrosunu yükleyin (Eklentiler, Makrolar, Yükle ve "AggregationAssay.txt" dosyasını seçin).
2. Eşikleri belirleyin.
   1. ImageJ'e 'sıfır zaman' .tif dosyası yükleyin ve kanalları bölün (Resim | Renk | Kanalları Böl).
      NOT: 'Sıfır süresi' görüntüsü, tüm deneme için eşik ve en küçük nokta boyutunu belirlemek için kullanılır.
   2. Her kanalı maskele (Eklentiler | Makrolar | AggregationAssay_MakeMask). Görüntüden Maske Yap penceresi görünecektir. Görüntü eşiğini belirle ve Histogram'dan Küme Paramlarını Belirle 'nin yanındaki onay kutuları tamam'ı tıklatın.
   3. Slayt çubuğunu kullanarak görüntünün eşiğini belirleyin, sayıyı slayt çubuğunun sağ kısmına kaydedin ve Tamam 'ıtıklatın.
   4. Küme Boyutu histogramı görünecektir. Histogramdan denemeye uygun bir küme boyutu seçin, bu sayıyı En Küçük Küme Boyutu: kutusuna yazın ve Tamam 'ıtıklatın. Bu boyutun altındaki kümeler çözümlenmez.
3. Analizi çalıştır.
   1. ImageJ'de koşul 1'in 'time 60' görüntüsünü açın ve kanalları adım 3.2.1'deki gibi bölün.
   2. Her kanalı maskeleyin (Eklentiler, Makrolar, AggregationAssay_MakeMask). 3.2.3 ve adım 3.2.4'te belirlenen eşik ve boyutu kullanın. Görüntü eşiğini belirleme ve Histogram'dan Küme Paramlarını Belirleme'nin yanındaki kutuların seçimini kaldırın ve boyutu ve eşikleri uygun alanlara el ile yazın ve Tamam'ı tıklatın.
   3. Toplama dizinini hesaplama (Eklentiler | Makrolar | AggregationAssay_CalculateOverlap). Karşılaştırılacak maskelenmiş kanalları ve elde edilen dosyaların kaydedileceği dizini seçin.
   4. Her koşulda her 'zaman 60' görüntüsü için 3.3.1–3.3.3 adımlarını yineleyin.
      NOT: Toplama dizini, iki kanal alanının toplamına bölünen toplam çakışma alanı eksi örtüşme alanının 100 ile çarpışması olarak tanımlanır (Toplama indeksi = çakışma alanı/[kanal 1 alanı + kanal 2 alanı – örtüşme alanı] x 100). Bu normalleştirme, her iki maskedeki toplam pikselleri temsil eden iki maskelenmiş kanal arasında bir 'OR' işlemidir.

Sonuçlar

A687T mutasyonu Neurexin3α SS4'ü artırır- LRRTM2 7'ye bağlanma
Bilinen iki sinaptik proteinin hücreler arası etkileşimlerinin, zihinsel engelli ve epilepsili bir hastada bulunan bir nokta mutasyonunun ortaya girmesinden nasıl etkilendiğini araştırmak için yukarıdaki HEK hücre toplama testini kullandık (Şekil 1). Hücreler bölüm 1'e göre trans enfekte olmuş ve protokolün 1. ve 2. bölümlerine göre görüntüleme için hazırlanmıştır. ...

Tartışmalar

Hücre yapışması sırasında transta meydana gelen protein-protein etkileşimlerinin parçalanması, olgunlaşma ve yeniden şekillendirme sırasında sinapsların oluşumu, işlevi ve bakımı da dahil olmak üzere temel hücresel süreçlerin altında bulunan moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına neden olabilir. Hücreden hücreye etkileşimlerin etkileri nörobiyolojinin ötesine genişler ve sinyal transdüksiyonunda, hücre göçünde ve doku gelişiminde daha geniş rollere sahiptir

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL disposable microtubes with snap caps	VWR	89000-028	Incubation of mixed population of HEK cells
1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane	Thermo Fisher	567-0020	Sterilization of HEK media
15 mL SpectraTube centrifuge tubes	Ward’s Science	470224-998	Harvesting HEK cells
6 well sterile tissue culture plates	VWR	100062-892	culturing HEK cells
Calcium Chloride	Sigma	223506-500G	Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension
Centrifuge- Sorvall Legend RT	Kendro Laboratory Products	75004377	Harvesting HEK cells
CO2 cell incubator	Thermo Scientific	HERACELL 150i	Incubation of HEK cells during growth
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV	HEK cell maintenance
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)	Gibco	14190-144	Passaging/harvesting HEK cell
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	ED-500G	Harvesting HEK cells
Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area	Corning	9381M26	Culturing HEK cells
Fetal Bovine Serum	Sigma	17L184	HEK cell maintenance
HEK293T cells	ATCC		Model system
ImageJ	NIH	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	Image analysis
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma	M9272-500G	HEK cell resuspension
Sodium phosphate dibasic anhydrous	Fisher BioReagents	BP332-500	Calcium phosphate transfection
Trypsin 0.25% (1X) Solution	GE Healthcare Life Sciences	SH30042.01	Passaging HEK cells
Tube rotator			Incubation of mixed population of HEK cells
UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged	Denville Scientific Inc.	M1021	Image acquisition
Wide-field microscope	Zeiss	Axio Vert 200M	Image acquisition