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要約

ここでは、蛍光顕微鏡を用いた異種細胞系におけるトランスにおけるリガンド-受容体相互作用を迅速かつ半定量的に測定するための最適化されたプロトコルを提示する。

要約

細胞インターフェースでのタンパク質相互作用は、組織の発達やがんの進行からシナプスの形成と維持に至るまで、多くの生物学的結果を決定します。これらの基本的相互作用の多くは、トランスで起こり、典型的には、膜アンカー結合対を発現する細胞間の異種または同種の相互作用によって誘発される。疾患関連の突然変異がこれらの基本的なタンパク質相互作用をどのように混乱させるかを解明することで、無数の細胞生物学分野への洞察を得ることができます。多くのタンパク質とタンパク質の相互作用アッセイは、通常、シスとトランス相互作用の間のあいまいさを解消せず、生体内で発生している結合の程度を過大評価し、タンパク質および/または特殊なモニタリング装置の労働集約的な精製を伴う可能性があります。ここでは、長いタンパク質精製や特殊な装置を必要とせずにトランス相互作用のみを観察し定量化できる、最適化されたシンプルなプロトコルを提示します。HEK細胞凝集アッセイは、HEK細胞の2つの独立集団の混合を含み、それぞれが膜結合同系リガンドを発現する。短いインキュベーション期間の後、サンプルを画像化し、結果の凝集体を定量化します。

概要

シナプス接着分子によって促進されるシナプス相互作用は、シナプスの開発、組織、仕様、維持および機能およびニューラルネットワークの生成の基礎となる。これらのシナプス細胞接着分子の同定は急速に増加しています。したがって、結合パートナーを同定し、これらの新しい接着分子が互いにどのように相互作用するかを理解することが根本的に重要です。さらに、ゲノムシーケンシングは、多くの神経発達、神経精神、および中毒障害に一般的にリンクされているこれらの接着分子の多くの突然変異を同定した1。シナプス細胞接着分子をコードする遺伝子の突然変異は、トランス相互作用を有害に変化させ、シナプス形成および維持における病態生理学的変化に寄与する可能性がある。

等温熱熱量測定、円形二色、表面プラズモン共鳴2 などのタンパク質とタンパク質の相互作用を定量的に評価するために複数のアッセイが存在し、本質的には定量的には、いくつかの制限があります。第一に、それらは組換えタンパク質を必要とし、時には長く、退屈な精製ステップを要求する。第二に、彼らは洗練された専門機器と技術的な専門知識を必要とします。第三に、生体内の膜に自然につながれているタンパク質間のシスとトランスの相互作用の両方を可能にするので、結合の程度を過大評価することができます。ここでは、トランス相互作用を排他的にテストする、単純で比較的迅速なアッセイを提案する。

精製タンパク質アッセイに関連する合併症の多くを回避するために、我々は還元異種細胞系におけるトランス相互作用を再現する細胞ベースのタンパク質相互作用アッセイを最適化した。このアッセイは、細胞間相互作用を研究するために、これまで様々な形で使用されてきました。このアプローチでは、候補細胞接着分子がHEK293T細胞にトランスフェクションされる。生理的条件では、HEK293T細胞は自己凝集を示さないため、このアッセイの模範的なモデルとなっています。しかし、受容体とリガンドを発現するHEK細胞の個体集団が結合されると、受容体とリガンドの結合が生じるようにHEK細胞の凝集が生じる。この凝集はトランス相互作用によって排他的に媒介され、通常は数十分で観察可能である。この方法ではタンパク質精製のステップは必要なく、この方法の効率は、同結合性分子を発現するHEK細胞の集団が結合され、その後数十分後に画像化されるというパラダイムに依存している。さらに、抗体も高価な機器も必要とされないので、この方法は比較的安価です。データの取得に必要な装置は、標準蛍光顕微鏡のみです。この細胞ベースのアッセイに対するさらなる利点は、疾患関連点突然変異がトランス相互作用に及ぼす影響を迅速にスクリーニングする能力である。これは、目的とするタンパク質の変異変異体変異体のcDNAsを有するHEK細胞をトランスフェクトすることによって行うことができる。

本プロトコルでは、深い知的障害とてんかんと診断された患者において同定されたNeurexin3α(Neurexin3αA687T)におけるミスセンス突然変異が、ロイシンリッチリピート膜貫通タンパク質2(LRRTM2)との相互作用を変化させるかどうかを調べる例を提示する。Neurexin3αは、シナプス前細胞接着分子の進化的に保存されたファミリーの一員であり、最近の研究ではシナプス3、4、5、6、7で複数の役割を同定していますが、この分子とノイレクシンファミリーのすべてのメンバーのシナプス理解は不完全なままです。LRRTM2は、シナプス形成および維持8、9、10に関与する興奮性ポストナプティック細胞接着タンパク質である。重要なことに、LRRTM2はスプライスサイト4代替エキソン(SS4-)を欠いているが、スプライスサイト4代替エキソン(SS4+)を含むノイレクシンアイソフォームとは異なっているノイレクシンアイソフォームと排他的に相互作用する。Neurexin3αで同定されたヒトミスセンス変異(A687T)は、進化的に保存され、全てのαニューレクシン7の間で保存されている未研究の細胞外領域に位置する。これら2つの分子間の相互作用が確立されたので、私たちは、Neurexin3α SS4-LRRTM2への結合能力がA687T点突然変異によって変化しているのかという疑問を提起しました。このアッセイは、A687T点突然変異がNeurexin3αのLRRTM2への凝集を予期せず増強したことを明らかにし、その点突然変異が位置する細胞外領域が、シナプス間相互作用を媒介する役割を果たしていることを示唆した。

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プロトコル

1. 細胞培養とトランスフェクション

  1. DMEM、1x(ダルベッコのイーグル培地の修飾)4.5 g /Lグルコース、L-グルタミン&ピルビン酸ナトリウムおよび10%FBSでHEK細胞培地を作ります。滅菌フィルター。
  2. 凝集アッセイに適したリガンドおよび受容体を事前に決定する。
    注:Neurexin3α SS4+-および既知のリガンドの1つであるLRRTM2がこの研究で使用されました。目的のリガンドおよび受容体は、pcDNA3.1においてcDNAから発現した。ギブソンアセンブリを使用して、ノイレクシン3αをpcDNA3.112に挿入しました。ノイレクシン3α F/R: TTTAAACTTAAGクトラッヒガクククチャクトクコッチョッチョッチョクGCカッカガクタットッタクテクトカックトクチュククチュク/
    ガッCGGCCGGCTGGATCTGCAGAATTTタカタアタクトクトクト
  3. HEK293T細胞を準備します。
    1. HEK293T細胞を1つのT-75フラスコで合流させます。
    2. コンフルエントになったら、2 mLのトリプシンを使用し、37°Cインキュベーターに2分間置きます。フラスコに6mLのHEK培地を加え、細胞を再懸濁し、8 mLすべてを15 mLの円錐管に移します。
    3. 500 x g で 5 分間ペレットを 5 分間、HEK 細胞培地で合計 8 mL の再懸濁液を使用します。
    4. 細胞を数え、6ウェルプレートの各ウェルに735,000個の細胞を追加します。HEKセルメディアを使用して、各ウェルの最終体積を2mLに調整します。
    5. 37°Cインキュベーターに入れ、細胞が一晩、または50〜60%の合流に達するまで増殖させます。
  4. リン酸カルシウム法13を用いたHEK293T細胞のトランスフェクト
    1. 3 μgの目的タンパク質を有するトランスフェクトウェル1、1 μgの蛍光タンパク質(3 μgのpcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4-および1 μgのmCherry)を共トランスフェクトします。
    2. ステップ1.4.1のようにトランスフェクトウェル2。しかし、目的の変異タンパク質(pcDNA3.1-ノイレクシン3αA687T SS4-)を有する。
    3. 3 μgのリガンドを対象とし、別の蛍光タンパク質の1 μg(3 μgのpcDNA3.1 LRRTM2およびGFP 1 μg)を用いてトランスフェクトウェル3。
    4. 負のコントロールとして機能するトランスフェクトウェル4とウェル5:GFPの1 μgでウェル4、mCherryの1 μgで井戸5。
    5. 追加の条件またはコントロール(Neurexin3αWT/A687T SS4+)を必要とする場合は、別のプレート(ステップ1.4.1-1.4.4)を準備します。
      注:トランスフェクション効率は、蛍光顕微鏡下でトランスフェクション後24時間分析し、トランスフェクションした蛍光タンパク質を発現する細胞数として定量します。より合理化されたアプローチには、蛍光タンパク質と目的のリガンドをコードする二重体性ベクターを持つHEK細胞のトランスフェクションが含まれ、上記の共同トランスフェクションが推奨されます。本研究の場合、αノイレクシンは約4.3kb、低蛍光強度は、共トランスフェクションを必要とする二酸化システムを用いて観察された。
  5. トランスフェクションの48時間後、細胞を集積させる。
    1. PBSで2回よく洗います。
    2. PBSに10 mM EDTAの1mLを各ウェルに加え、細胞間相互作用を穏やかに解約し、37°Cでプレートを5分間インキュベートします。
      注:トリプシンは、研究における接着分子の潜在的なタンパク質分解切断のためにステップ1.5.2のために推奨されていません。さらに、EDTA の追加後、セルが環境条件にさらされるため、プロトコルは完了するまで停止されない場合があります。
    3. プレートを軽くタップして細胞を取り外し、各ウェルを別々の15 mL円錐形チューブに収穫します。
    4. 500 x g の遠心円錐管と 5 分間室温。
  6. 細胞がペレット化されている間、各条件で各マイクロ遠心管の上部にラベルを付けて6インキュベーションチューブを調製する。
    注: GFP と mCherry 条件の各順列は、すべての実験条件と適切な制御を包含するために使用されるべきです。例えば:1.GFP/mCherry、2.mCherry/LRRTM2-GFP 3。GFP/ノイレクシン3αWT SS4-mCherry, 4.GFP/ノイレクシン3αA687T SS4- –mCherry, 5.ノイレクシン3αWT SS4-mCherry/LRRTM2—GFP, 6.ノイレクシン3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP.さらなる条件やコントロールに対応するために、追加のチューブを作ります。
  7. 上清を取り除き、10 mM CaCl2 と10 mMMgCl2 を37°Cに温めたHEK培地500μLの細胞を再懸濁します。
    注:CaCl 2とMgCl2を追加すると、接着分子が結合を再確立することができ、問題の細胞間相互作用パートナーが接着のために二価カチオンを必要とする場合にのみ必要です。
  8. ヘモサイトメーターとアリコート200,000細胞を使用して各15 mLの円錐管の細胞を、ステップ1.6.1から適切なチューブに数え、合計体積500μLで1:1ミックスします。
    注:それは数とアリコートの量に条件ごとに5分かかります。
  9. 低速チューブ回転器で室温でチューブをインキュベートします。

2. 画像の取得

  1. 特定のサンプルの顕微鏡取得パラメータを最適化します。この例では、広視野顕微鏡で画像を撮影した。5x 空気の目的を使用します (NA: 0.15;WD:20000 μm)、分析に十分な大きさのフィールドを取得します。
  2. ステップ1.8でHEK細胞の2つの条件を混合した直後にベースライン凝集を評価する。これらは現在、「タイムゼロ」画像です。
    1. 各サンプル混合物のピペット40 μLは、488および561チャネルの両方の蛍光下で荷電顕微鏡スライドおよび画像上に置いた。
    2. サンプルドロップごとに1つのフォーカス面で3つの異なる視野を取得します。
  3. 「時間60」画像として60分で最終画像を取得します。
    1. 60分インキュベーション後の混合物の「時間60」画像を得るために、各条件の別の40 μLサンプルを回転管およびピペットから各サンプルを荷電スライドに取り出します。ステップ 2.2.2 のイメージ。
      メモ:飽和が発生するまで、セルの集計は 15 分ごとにチェックする必要があります。凝集のタイミングは、試験されるタンパク質に依存します。

3. 画像J/フィジー分析

  1. フィジー/ImageJ を使用して集計の範囲を定量化するには、解析ファイルを保存します。
    1. 提供された補足コーディングファイルをコンピュータの imageJ マクロフォルダに保存します。
    2. 提供された集計マクロをインストールします (プラグイン、マクロ、インストール、および「AggregationAssay.txt」ファイルを選択します)。
  2. しきい値を決定します。
    1. 'time 0' .tifファイルを imageJ にロードし、チャンネルを分割します (イメージ|カラー|チャンネルの分割
      注: 「時間ゼロ」画像は、実験全体のしきい値と最小のパンクタサイズを決定するために使用されます。
    2. 各チャネルをマスクする (プラグイン|マクロ|AggregationAssay_MakeMask)。[イメージからマスクを作成]ウィンドウが表示されます。[イメージのしきい値を決定する] および [ヒストグラムからクラスタ パラメータを決定する] の横にあるチェック ボックスをオンにし、[OK]をクリックします。
    3. スライド バーを使用してイメージのしきい値を決定し、スライド バーの右側の数値を記録して [OK]をクリックします。
    4. クラスター サイズのヒストグラムが表示されます。実験に適したクラスター サイズをヒストグラムから選択し、[最小クラスタ サイズ]ボックスにこの数値を入力して、[OK]をクリックします。このサイズより低いクラスタは解析されません。
  3. 解析を実行します。
    1. imageJ で条件 1 の 'time 60' イメージを開き、ステップ 3.2.1 のようにチャンネルを分割します。
    2. 各チャンネル(プラグイン、マクロ、AggregationAssay_MakeMask)をマスクします。ステップ 3.2.3 およびステップ 3.2.4 で決定したのと同じしきい値とサイズを使用します。[ イメージのしきい値を決定する ] ボックスと [ ヒストグラムからクラスタ パラメータを決定する] の横にあるチェック ボックスをオフにし、サイズとしきい値を適切なフィールドに手動で入力して [OK]をクリックします。
    3. 集計インデックスを計算する (プラグイン|マクロ|AggregationAssay_CalculateOverlap)。比較するマスクされたチャンネルと、結果のファイルが保存されるディレクトリを選択します。
    4. すべての条件で「時間60」画像ごとにステップ3.3.1~3.3.3を繰り返します。
      注: 集約インデックスは、2 つのチャネル領域からオーバーラップ領域に 100 を掛けた合計で割ったオーバーラップ領域の合計として定義されます (集約インデックス = チャネル 1 の領域 + チャネル 2 の領域 - オーバーラップ領域] x 100)。この正規化は、いずれかのマスクの合計ピクセルを表す 2 つのマスクチャネル間の「OR」操作です。

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結果

A687T突然変異は、ノイレクシン3α SS4-LRRTM2 7に結合する増加
知的障害とてんかん患者に見られる点変異の導入によって、2つの既知のシナプスタンパク質の細胞間相互作用がどのように影響を受けるかを調べるため、上記のHEK細胞凝集アッセイを用いた(図1)。細胞はセクション1に従ってトランスフェクトされ、プロトコルのセクション1および2に従?...

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ディスカッション

細胞接着中にトランスで起こるタンパク質とタンパク質の相互作用を解剖することは、成熟およびリモデリング中のシナプスの形成、機能および維持を含む基本的な細胞プロセスの基礎となる分子メカニズムをよりよく理解することにつながる可能性がある。細胞間相互作用の意味は神経生物学を超えて広がり、シグナル伝達、細胞遊び、組織発達における広範な役割を有する1...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、国立精神衛生研究所(R00MH103531およびR01MH116901からJ.A.への)、国立一般医学研究所(T32GM007635からS.R.への)の博士後期研修グラント、およびリダヒルギリアム高等研究フェローシップ(GT11021からS.R.)によって支えられました。ケビン・ウールフリー博士の顕微鏡の助け、Kウルリッヒ・バイエル博士の蛍光顕微鏡の使用、LRRTM2プラスミドのトーマス・スードホフ(スタンフォード大学)に感謝します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL disposable microtubes with snap capsVWR89000-028Incubation of mixed population of HEK cells
1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membraneThermo Fisher567-0020Sterilization of HEK media
15 mL SpectraTube centrifuge tubesWard’s Science470224-998Harvesting HEK cells
6 well sterile tissue culture platesVWR100062-892culturing HEK cells
Calcium ChlorideSigma223506-500GCalcium phosphate transfection, HEK cell resuspension
Centrifuge- Sorvall Legend RTKendro Laboratory Products75004377Harvesting HEK cells
CO2 cell incubatorThermo ScientificHERACELL 150iIncubation of HEK cells during growth
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvateCorning10-013-CVHEK cell maintenance
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)Gibco14190-144Passaging/harvesting HEK cell
Ethylenediaminetetraacetic acidSigmaED-500GHarvesting HEK cells
Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth areaCorning9381M26Culturing HEK cells
Fetal Bovine SerumSigma17L184HEK cell maintenance
HEK293T cellsATCCModel system
ImageJNIHV: 2.0.0-rc-69/1.52pImage analysis
Magnesium Chloride hexahydrateSigmaM9272-500GHEK cell resuspension
Sodium phosphate dibasic anhydrousFisher BioReagentsBP332-500Calcium phosphate transfection
Trypsin 0.25% (1X) SolutionGE Healthcare Life SciencesSH30042.01Passaging HEK cells
Tube rotatorIncubation of mixed population of HEK cells
UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive ChargedDenville Scientific Inc.M1021Image acquisition
Wide-field microscopeZeissAxio Vert 200MImage acquisition

参考文献

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