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요약

여기서, 우리는 형광 현미경을 사용하여 이종 세포 시스템에서 트랜스에서 리간드 수용체 상호 작용을 신속하고 반정적으로 측정하는 최적화된 프로토콜을 제시한다.

초록

세포 인터페이스에서 단백질 상호 작용은 조직 발달과 암 진행에서 시냅스 형성 및 유지 보수에 이르기까지 다양한 생물학적 결과를 지시합니다. 이러한 근본적인 상호 작용의 대부분은 트랜스에서 발생하고 일반적으로 막 고정 결합 쌍을 표현하는 세포 사이의 이기성 또는 동종 작용에 의해 유도된다. 질병 관련 돌연변이가 어떻게 이러한 근본적인 단백질 상호 작용을 방해하는지 설명하면 무수한 세포 생물학 분야에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 많은 단백질 단백질 상호 작용 소법은 전형적으로 시스와 트랜스 상호 작용 사이에 비약적이지 않으며, 이는 잠재적으로 생체 내에서 발생하는 결합의 정도의 과대 평가로 이어지고 단백질 및 /또는 전문 모니터링 장비의 노동 집약적 정제를 포함합니다. 여기서, 우리는 긴 단백질 정제 또는 특수 장비없이 트랜스 상호 작용의 관찰 및 정량화를 허용하는 최적화 된 간단한 프로토콜을 제시한다. HEK 세포 집계 분석법은 HEK 세포의 2개의 독립적인 인구의 혼합을 관련시킵니다, 각각 막 결합 된 cognate 리간드를 표현합니다. 짧은 잠복기 후에 는 샘플이 이미지화되고 결과 골재가 정량화됩니다.

서문

시냅스 접착 분자에 의해 촉진되는 시냅스 상호 작용은 시냅스의 개발, 조직, 사양, 유지 보수 및 기능 및 신경망 의 생성을 위한 기초입니다. 이러한 신혈 세포 접착 분자의 식별은 급속히 증가하고 있습니다. 따라서, 결합 파트너를 식별하고 이러한 새로운 접착 분자가 서로 상호 작용하는 방법을 이해하는 것이 근본적으로 중요합니다. 추가적으로, 게놈 순서는 일반적으로 신경 발달, 신경 정신병및 중독무질서1의 다수에 연결되는 이 접착 분자의 많은에서 돌연변이를 확인했습니다. 시냅스 세포 접착 분자에 대 한 코드 유전자에 돌연변이 는 해로운 트랜스 상호 작용을 변경 하 고 시 냅 스 형성 및 유지 보수에 병 리 학적 변경에 기여할 수 있습니다.

여러 분석법은 이소성 열량, 원형 이윤술, 표면 플라스몬 공명2와 같은 단백질 단백질 상호 작용을 정량적으로 평가하기 위해 존재하며 자연에서 정량적이지만 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 그들은 재조합 단백질을 필요로, 때로는 길고 지루한 정제 단계를 요구. 둘째, 정교한 특수 장비와 기술 전문 지식이 필요합니다. 셋째, 생체 내 막에 자연적으로 테더드되는 단백질 간의 시스 및 트랜스 상호 작용을 모두 허용하므로 결합의 정도를 과대 평가할 수 있습니다. 여기에서 우리는 트랜스 상호 작용을 독점적으로 테스트하는 간단하고 비교적 빠른 분석서를 제안합니다.

정제된 단백질 분석과 관련된 많은 합병증을 우회하기 위해, 우리는 감소된 이종 세포 시스템에서 트랜스 상호 작용을 재구성하는 세포 기지를 둔 단백질 상호 작용 분석서를 최적화했습니다. 이 분석은 이전에 세포 간 상호 작용을 연구하기 위해 다양한 형태로 사용되었습니다. 이 접근법에서, 후보 세포 접착 분자는 HEK293T 세포로 전형된다. 생리학적 조건에서 HEK293T 세포는 자가 응집을 나타내지 않아 이 분석에 대한 모범적인 모델을 만듭니다. 그러나, 수용체와 리간드를 발현하는 HEK 세포의 개별 집단이 결합될 때, 수용체의 결합과 HEK 세포의 리간드 힘 응집이 발생한다. 이 집계는 트랜스 상호 작용에 의해 독점적으로 중재되며 일반적으로 수십 분 안에 관찰 할 수 있습니다. 이 방법에서는 단백질 정화 단계가 필요하지 않으며, 이 방법의 효율은 cognate 접착 분자를 발현하는 HEK 세포의 인구가 결합되고 수십 분 후에 만 이미지되는 패러다임에 의존한다. 또한, 이 방법은 항체나 비용이 많이 드는 장비가 필요하지 않습니다. 데이터 수집에 필요한 유일한 장비는 표준 형광 현미경입니다. 이 세포 기지를 둔 분석기의 추가 이점은 트랜스 상호 작용에 질병 관련 점 돌연변이의 효력을 빨리 검열하는 기능입니다. 이는 관심 있는 단백질의 돌연변이 변이체의 cDNA를 가진 HEK 세포를 배분하여 수행될 수 있다.

이 프로토콜에서, 우리는 우리가 심각한 지적 장애 및 간질로 진단된 환자에서 확인된 Neurexin3α (Neurexin3αA687T)에있는 잘못된 감각 돌연변이가, 류신이 풍부한 반복 막 단백질 2 (LRRTM2)와 트랜스에서 상호 작용을 변경하는지 여부를 조사하는 예를 제시합니다. Neurexin3α는 사전 시냅스 세포 접착 분자의 진화적으로 보존된 가족의 일원이며, 최근 연구는 시냅스3,4,5,6,7,이 분자및 뉴렉신 가족의 모든 구성원에 대한 당사의 시냅스 이해에서 여러 역할을 확인했지만 불완전하다. LRRTM2는 시냅스 형성 및 유지 보수8,9,10에참여하는 흥분포스트 냅틱 세포 접착 단백질이다. 중요 한 것은, LRRTM2 독점적으로 스플라이스 사이트 4 대체 엑슨 (SS4-) 부족 하지만 스플라이스 사이트 4 대체 엑슨을 포함 하는 뉴렉신 등소와 상호 작용 4 대체 엑슨 (SS4+). Neurexin3α에서 확인된 인간 잘못된 감각 돌연변이(A687T)는 진화적으로 보존되고 모든 알파 뉴렉신7사이에 보존되는 연구되지 않은 세포외 지역에 위치한다. 이 두 분자 간의 상호 작용이 확립됨에 따라8,9,11,우리는 질문을 제기 : Neurexin3α SS4- LRRTM2의 결합 능력은 A687T 포인트 돌연변이에 의해 변경? 이 분석서에 따르면 A687T 점 돌연변이는 예기치 않게 Neurexin3α에서 LRRTM2로의 응집을 강화하여 점 돌연변이가 있는 세포외 영역이 신내 상호 작용을 중재하는 역할을 한다는 것을 시사합니다.

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프로토콜

1. 세포 배양 및 형질

  1. DMEM, 1x (덜벡코의 독수리 매체 수정)로 HEK 세포 미디어를 4.5 g/L 포도당, L 글루타민 및 나트륨 피루바테 및 10% FBS로 보충합니다. 멸균 필터.
  2. 집계 분석에 적합한 리간드 및 수용체를 미리 결정합니다.
    참고: Neurexin3α SS4+/-와 알려진 리간드 중 하나인 LRRTM2가 이 연구에서 사용되었습니다. 리간드 및 관심 수용체는 pcDNA3.1에서 cDNA로부터 발현되었다. 깁슨 어셈블리는 neurexin3α를 pcDNA3.112에삽입하는 데 사용되었다. 노이렉신3α F/R: TTTAAACTTAAGTAGTACCTACCGAGCTCGGATCCCACCATGAGCTCTACCCTCCACTCACTC/
    GAGCGGCCGCCACTGTGTGTTGATATCTGCAATTCTTACAATAATAATAATAATACTCCTTGTTTCCTTTT.
  3. HEK293T 셀을 준비합니다.
    1. HEK293T 세포를 하나의 T-75 플라스크에 합류하게 성장시다.
    2. 일단 컨서블, 트립신의 2 mL을 사용하고 2 분 동안 37 ° C 인큐베이터에 배치합니다. 6mL의 HEK 미디어를 플라스크에 추가하여 세포를 재일시 중단하고 8mL를 모두 15mL 원추형 튜브로 옮기습니다.
    3. 500 x g에서 펠릿5 분 및 총 8 mLHEK 세포 매체에서 재중단.
    4. 세포를 계산하고 6 웰 플레이트의 각 우물에 735,000 세포를 추가합니다. HEK 셀 미디어를 사용하여 각 웰에 대해 최종 볼륨을 2mL로 조정합니다.
    5. 37°C 인큐베이터에 배치하고 세포가 하룻밤 사이에 또는 50-60 % 합류에 도달 할 때까지 성장 할 수 있습니다.
  4. 칼슘인산법(13)을이용한 트랜스펙트 HEK293T 세포.
    1. 형광 단백질 1 μg (pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- 및 mCherry 1 μg의 3 μg)를 가진 관심 및 공동 트랜스펙트의 단백질 3 μg를 가진 Transfect well-1.
    2. 1.4.1 단계에서와 같이 Transfect 잘 -2. 그러나 관심의 돌연변이 단백질 (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
    3. 다른 형광 단백질의 1 μg (pcDNA3.1 LRRTM2 및 GFP의 1 μg)의 1 μg와 관심 및 공동 트랜스 펙트의 3 μg와 트랜스펙트 웰 -3.
    4. 트랜스펙트 웰-4와 잘-5 부정적인 컨트롤 역할을: 잘-4 GFP의 1 μg와 잘-5 mCherry의 1 μg.
    5. 추가 조건 이나 컨트롤을 필요로 하는 경우 다른 플레이트를 준비 (단계 1.4.1-1.4.4) 추가 조건 또는 컨트롤을 필요로하는 경우 (Neurexin3αWT / A687T SS4+).
      참고: 형광 효율은 상형광 현미경으로 형광 현미경으로 24시간 경과한 후 분석되고, 형광 단백질을 발현하는 세포의 수로 정량화된다. 보다 유선형적인 접근법은 형광 단백질과 관심의 리간드에 대한 비거스트로닉 벡터 코딩을 가진 HEK 세포의 전환을 포함하고 공동 형질 보다 높게 권장됩니다. 이 연구의 경우, 알파 뉴렉신은 ~4.3 kb이며 형광 강도가 낮으며, 동회용을 필요로 하는 이두근시스템을 사용하여 관찰되었다.
  5. 이식 후 48시간, 집합을 위해 세포를 수확합니다.
    1. PBS로 두 번 잘 씻으시면 됩니다.
    2. PBS에 1mM EDTA1mL을 각 웰에 추가하여 세포 간 상호 작용을 부드럽게 분리하고 37°C에서 5분 동안 배양판을 배양합니다.
      참고: 트립신은 연구에서 접착 분자의 잠재적인 단백질 분석 분열로 인해 1.5.2 단계에 권장되지 않습니다. 또한 EDTA 추가 후 세포가 주변 조건에 노출되기 때문에 완료될 때까지 프로토콜이 중지되지 않을 수 있습니다.
    3. 부드럽게 세포를 분리하기 위해 접시를 누르고, 별도의 15 mL 원추형 튜브로 각각을 잘 수확.
    4. 원심분리기 원심분리관은 500 x g, 실온은 5분 동안 드실 수 있습니다.
  6. 세포가 펠릿화하는 동안 각 상태의 각 미세 원심 분리기 튜브의 상단을 표시하여 6 개의 배양 튜브를 준비하십시오.
    참고: GFP 및 mCherry 조건의 각 순열은 모든 실험 조건과 적절한 제어를 포괄하는 데 사용되어야합니다. 예: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/노이렉신3αWT SS4--mCherry, 4. GFP/뉴렉신3αA687T SS4- -mCherry, 5. 뉴렉신3αWT SS4--mCherry/LRRTM2-GFP, 6. 뉴렉신3αA687T SS4- -mCherry/LRRTM2-GFP. 추가 조건 및 제어를 수용할 수 있도록 튜브를 추가로 만듭니다.
  7. 10mM CaCl2 및 10mM MgCl2로 37°C로 따뜻해진 HEK 매체의 500 μL에서 상체 및 재중단 세포를 제거합니다.
    참고: CaCl2 및 MgCl2를 추가하면 접착 분자가 결합을 재확립할 수 있으며 문제의 세포간 상호 작용 파트너가 접착을 위해 이원양이온을 필요로 하는 경우에만 필요합니다.
  8. 각 15mL 원문관의 세포를 혈류계와 알리쿼트 200,000개의 세포를 1.6.1 단계부터 적절한 튜브로 사용하여 500 μL의 총 부피에서 1:1 혼합을 계산한다.
    참고: 조건당 5분만 계산하고 알리쿼트 금액이 소요됩니다.
  9. 느린 튜브 회전기에서 실온에서 튜브를 배양합니다.

2. 이미지 수집

  1. 특정 샘플에 대한 현미경 획득 매개 변수를 최적화합니다. 이 예에서는, 심상은 넓은 필드 현미경에서 촬영되었습니다. 5배 공기 목표 사용(NA: 0.15; WD: 20000 μm) 분석을 위한 충분한 필드를 얻을 수 있습니다.
  2. 1.8 단계에서 HEK 세포의 두 조건을 혼합한 직후 기준집계를 평가한다. 이제 '시간 제로' 이미지입니다.
    1. 488 및 561 채널 모두에서 형광 하에서 충전 된 현미경 슬라이드 및 이미지에 각 샘플 혼합물의 Pipette 40 μL.
    2. 샘플 드롭당 하나의 포커스 평면에서 세 가지 보기 필드를 획득합니다.
  3. '시간 60' 이미지로 60분 만에 최종 이미지를 획득합니다.
    1. 60분 배양 후 혼합물의 '시간 60' 이미지를 얻으려면 각 샘플을 회전 튜브및 파이펫에서 각 피펫에서 각 조건의 40 μL 샘플을 충전된 슬라이드로 가져 가십시오. 2.2.2 단계와 같은 이미지.
      참고: 포화가 발생할 때까지 세포 집계는 15분마다 검사해야 합니다. 집계의 타이밍은 테스트되는 단백질에 따라 달라집니다.

3. 이미지 J/피지 분석

  1. 피지/ImageJ를 사용하여 집계 범위를 정량화하려면 분석 파일을 저장합니다.
    1. 제공된 보충 코딩 파일을 컴퓨터의 imageJ 매크로 폴더에 저장합니다.
    2. 제공된 집계 매크로를 설치합니다(플러그인, 매크로, 설치 및 "집계분석.txt" 파일을 선택합니다.
  2. 임계값을 결정합니다.
    1. '시간 제로' .tif 파일을 이미지J로 로드하고 채널을분할(이미지 | 색상 | 분할 채널).
      참고: '시간 제로' 이미지는 전체 실험에 대한 임계값과 가장 작은 말장난 크기를 결정하는 데 사용됩니다.
    2. 각채널(플러그인 | 매크로 | AggregationAssay_MakeMask). 이미지 창에서 마스크를 만들면 표시됩니다. 이미지에 대한 임계값 결정 옆에 있는 확인란을 확인하고 히스토그램에서 클러스터 Params를 결정하고 확인을 클릭합니다.
    3. 슬라이드 막대를 사용하여 이미지의 임계값을 결정하고 슬라이드 막대오른쪽에 숫자를 기록하고 확인을 클릭합니다.
    4. 클러스터 크기의 히스토그램이 나타납니다. 실험에 맞는 히스토그램에서 클러스터 크기를 선택하고, 이 숫자를 최소 클러스터 크기: 상자에 입력하고 확인을 클릭합니다. 이 크기 이하의 클러스터는 분석되지 않습니다.
  3. 분석을 실행합니다.
    1. 이미지J에서 조건 1의 '시간 60' 이미지를 열고 3.2.1 단계와 같이 채널을 분할합니다.
    2. 각 채널(플러그인, 매크로, AggregationAssay_MakeMask)을 마스크합니다. 3.2.3 단계 및 3.2.4 단계에서 결정된 동일한 임계값 및 크기를 사용합니다. 이미지에 대한 임계값 결정 옆에 있는 상자를 선택 취소하고 히스토그램에서 클러스터 Params를 결정하고 크기와 임계값을 해당 필드에 수동으로 입력한 다음 확인을 클릭합니다.
    3. 집계 지수(플러그인 | 계산 매크로 | AggregationAssay_CalculateOverlap). 비교할 마스크채널과 결과 파일이 저장되는 디렉토리를 선택합니다.
    4. 모든 조건에서 '시간 60' 이미지당 3.3.1-3.3단계를 반복합니다.
      참고: 집계 인덱스는 100을 곱한 중첩 영역을 뺀 두 채널 영역의 합으로 나눈 총 중첩 영역으로 정의됩니다(집계 인덱스 = 중첩 영역/[채널 1 + 채널 2의 영역 ] 중첩 영역] x 100). 이 정규화는 두 마스크 채널 간의 'OR' 동작으로 두 마스크의 총 픽셀을 나타냅니다.

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결과

A687T 돌연변이는 LRRTM2 7에 결합하는 Neurexin3α SS4-결합을 증가시킵니다.
두 개의 알려진 시냅스 단백질의 세포 간 상호 작용이 지적 장애 및 간질을 가진 환자에서 발견되는 포인트 돌연변이의 도입에 의해 어떻게 영향을 받는지 조사하기 위해 위의 HEK 세포 집계분석(도 1)을사용했습니다. 세포는 섹션 1에 따라 전과되었고 프로토콜의 섹션 1 과 2에 따라 ...

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토론

세포 접착 중에 트랜스에서 발생하는 단백질 단백질 상호 작용을 해부하면 성숙 및 리모델링 중에 시냅스의 형성, 기능 및 유지 관리를 포함한 기본 세포 과정의 근본적인 분자 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 세포 대 세포 상호 작용의 의미는 신경 생물학을 넘어 확장하고 신호 전달, 세포 이동 및 조직 발달에 있는 더 넓은 역할을14. 세포 유착의 수차는 적절한 세포 기능...

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공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 작품은 국립 정신 건강 연구소 (R00MH103531 및 R01MH1116901 에서 J.A.), 국립 일반 의학 연구소 (T32GM0007635에서 S.R.R.)의 박사 전 교육 보조금, 고급 연구를위한 리다 힐리엄 펠로우십 (GT1101.R.1)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 현미경에 도움을 케빈 울프리 박사, 그의 전형 현미경의 사용에 대한 박사 K 울리히 바이엘, 그리고 토마스 수호프 (스탠포드 대학) LRRTM2 플라스미드에 대한 도움을 감사드립니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL disposable microtubes with snap capsVWR89000-028Incubation of mixed population of HEK cells
1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membraneThermo Fisher567-0020Sterilization of HEK media
15 mL SpectraTube centrifuge tubesWard’s Science470224-998Harvesting HEK cells
6 well sterile tissue culture platesVWR100062-892culturing HEK cells
Calcium ChlorideSigma223506-500GCalcium phosphate transfection, HEK cell resuspension
Centrifuge- Sorvall Legend RTKendro Laboratory Products75004377Harvesting HEK cells
CO2 cell incubatorThermo ScientificHERACELL 150iIncubation of HEK cells during growth
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvateCorning10-013-CVHEK cell maintenance
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)Gibco14190-144Passaging/harvesting HEK cell
Ethylenediaminetetraacetic acidSigmaED-500GHarvesting HEK cells
Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth areaCorning9381M26Culturing HEK cells
Fetal Bovine SerumSigma17L184HEK cell maintenance
HEK293T cellsATCCModel system
ImageJNIHV: 2.0.0-rc-69/1.52pImage analysis
Magnesium Chloride hexahydrateSigmaM9272-500GHEK cell resuspension
Sodium phosphate dibasic anhydrousFisher BioReagentsBP332-500Calcium phosphate transfection
Trypsin 0.25% (1X) SolutionGE Healthcare Life SciencesSH30042.01Passaging HEK cells
Tube rotatorIncubation of mixed population of HEK cells
UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive ChargedDenville Scientific Inc.M1021Image acquisition
Wide-field microscopeZeissAxio Vert 200MImage acquisition

참고문헌

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159HEK293TLRRTM

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