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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll zur schnellen und semiquantitativen Messung von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen in Trans in einem heterologen Zellsystem mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Zusammenfassung

Protein-Wechselwirkungen an zellulären Schnittstellen diktieren eine Vielzahl von biologischen Ergebnissen, die von der Gewebeentwicklung und Krebsprogression bis hin zur Synapsenbildung und -erhaltung reichen. Viele dieser grundlegenden Wechselwirkungen treten bei Trans auf und werden typischerweise durch heterophile oder homophile Wechselwirkungen zwischen Zellen induziert, die membranverankerte Bindungspaare exdrücken. Die Aufklärung, wie krankheitsrelevante Mutationen diese grundlegenden Proteinwechselwirkungen stören, kann Einen Einblick in eine Vielzahl von Zellbiologiefeldern geben. Viele Protein-Protein-Interaktions-Assays sind in der Regel nicht uneindeutig zwischen cis und Trans-Wechselwirkungen, was potenziell zu einer Überschätzung des In-vivo-Bindungsumfangs führt und eine arbeitsintensive Reinigung von Protein- und/oder spezialisierten Überwachungsgeräten beinhaltet. Hier präsentieren wir ein optimiertes einfaches Protokoll, das die Beobachtung und Quantifizierung von nur Trans-Wechselwirkungen ohne langwierige Proteinreinigungen oder spezielle Geräte ermöglicht. Der HEK-Zellaggregationstest beinhaltet das Mischen von zwei unabhängigen Populationen von HEK-Zellen, die jeweils membrangebundene Cognateligaden exdrücken. Nach einer kurzen Inkubationszeit werden Proben abgebildet und die resultierenden Aggregate quantifiziert.

Einleitung

Synaptische Wechselwirkungen, die durch synaptische Adhäsionsmoleküle erleichtert werden, sind die Grundlage für die Entwicklung, Organisation, Spezifikation, Wartung und Funktion von Synapsen und die Erzeugung von neuronalen Netzwerken. Die Identifizierung dieser transsynaptischen Zelladhäsionsmoleküle nimmt rapide zu; Daher ist es von grundlegender Bedeutung, verbindliche Partner zu identifizieren und zu verstehen, wie diese neuen Adhäsionsmoleküle miteinander interagieren. Zusätzlich hat die Genomsequenzierung Mutationen in vielen dieser Adhäsionsmoleküle identifiziert, die häufig mit einer Vielzahl von neuroentwicklungsbedingten, neuropsychiatrischen und Suchterkrankungen verbunden sind1. Mutationen in Genen, die für synaptische Zelladhäsionsmoleküle kodieren, können Trans-Wechselwirkungen nachteilig verändern und zu pathophysiologischen Veränderungen bei der Synapsenbildung und-Erhaltung beitragen.

Es gibt mehrere Assays zur quantitativen Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen wie isotherme Kalorimetrie, kreisförmiger Dichroismus, Oberflächen-Plasmonresonanz2 und obwohl quantitativ, haben sie mehrere Einschränkungen. Erstens benötigen sie rekombinantes Protein, das manchmal langwierige und mühsame Reinigungsschritte erfordert. Zweitens erfordern sie eine ausgeklügelte Spezialausrüstung und technisches Know-how. Drittens können sie das Bindungsgrad überschätzen, da sie sowohl cis- als auch Trans-Wechselwirkungen zwischen Proteinen ermöglichen, die natürlicherweise in vivo an eine Membran gebunden sind. Hier schlagen wir einen einfachen und relativ schnellen Assay vor, der ausschließlich Trans-Interaktionen testet.

Um viele der Komplikationen im Zusammenhang mit gereinigten Protein-Assays zu umgehen, haben wir einen zellbasierten Protein-Interaktionstest optimiert, der Trans-Interaktionen in einem reduzierten heterologen Zellsystem rekapituliert. Dieser Assay wurde zuvor in verschiedenen Formen verwendet, um transzelluläre Wechselwirkungen zu untersuchen. Bei diesem Ansatz werden Kandidatenzelladhäsionsmoleküle in HEK293T-Zellen transfiziert. Unter physiologischen Bedingungen weisen HEK293T-Zellen keine Selbstaggregation auf, so dass sie beispielhafte Modelle für diesen Test aufweisen. Wenn jedoch einzelne Populationen von HEK-Zellen, die Rezeptor und Liganden exexegieren, kombiniert werden, erzwingt die Bindung des Rezeptors und des Liganden die Aggregation von HEK-Zellen. Diese Aggregation wird ausschließlich durch Transinteraktionen vermittelt und ist in der Regel in Dutzenden von Minuten beobachtbar. Bei dieser Methode sind keine Proteinreinigungsschritte erforderlich, und die Effizienz der Methode beruht auf dem Paradigma, dass Populationen von HEK-Zellen, die Cognate-Adhäsionsmoleküle exdrücken, kombiniert und dann nur zig Minuten später abgebildet werden. Darüber hinaus ist diese Methode relativ kostengünstig, da weder Antikörper noch kostspielige Ausrüstung erforderlich sind. Die einzige Ausrüstung, die für die Erfassung von Daten benötigt wird, ist ein Standard-Fluoreszenzmikroskop. Ein weiterer Vorteil dieses zellbasierten Assays ist die Fähigkeit, die Wirkung krankheitsrelevanter Punktmutationen auf Trans-Wechselwirkungen schnell zu untersuchen. Dies kann durch Transfizieren von HEK-Zellen mit cDNAs der mutierten Varianten des Proteins von Interesse durchgeführt werden.

In diesem Protokoll stellen wir ein Beispiel vor, in dem wir untersuchen, ob sich eine Missense-Mutation in Neurexin3 "(Neurexin3"A687T), die bei einem Patienten mit einer tiefen geistigen Behinderung und Epilepsie identifiziert wurde, wechselwirkungen im Trans mit Leucin-reichem Repeat-Transmembranprotein 2 (LRRTM2) verändert. Neurexin3 ist ein Mitglied der evolutionär konservierten Familie von präsynaptischen Zelladhäsionsmolekülen und während neuere Arbeiten mehrere Rollen an der Synapseidentifizierthaben 3,4,5,6,7, bleibt unser synaptisches Verständnis dieses Moleküls und aller Mitglieder der Neurexin-Familie unvollständig. LRRTM2 ist ein exzitatorisches postsynaptisches Zelladhäsionsprotein, das an der Synapsenbildung und-erhaltung8,9,10teilnimmt. Wichtig ist, dass LRRTM2 ausschließlich mit Neurexin-Isoformen interagiert, denen die Spleißstelle 4 alternatives Exon (SS4-) fehlt, aber nicht mit Neurexin-Isoformen, die die Spleißstelle 4 alternatives Exon (SS4+) enthalten. Die menschliche Missense-Mutation (A687T), die in Neurexin3 identifiziert wurde, befindet sich in einer nicht untersuchten extrazellulären Region, die evolutionär konserviert ist und zwischen allen Alpha-Neurexinenkonserviertwird 7 . Da die Wechselwirkung zwischen diesen beiden Molekülen8,9,11festgestellt wurde, stellten wir die Frage: Wird die Bindungsfähigkeit von Neurexin3' SS4- zu LRRTM2 durch eine A687T-Punktmutation verändert? Dieser Test ergab, dass die A687T-Punktmutation unerwartet die Aggregation von Neurexin3zu LRRTM2 verbesserte, was darauf hindeutet, dass die extrazelluläre Region, in der sich die Punktmutation befindet, eine Rolle bei der Vermittlung transsynaptischer Wechselwirkungen spielt.

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Protokoll

1. Zellkultur und Transfektion

  1. Herstellung von HEK-Zellmedien mit DMEM, 1x (Dulbecco es Modification of Eagle es Medium) ergänzt mit 4,5 g/L Glukose, L-Glutamin & Natriumpyruvat und 10% FBS. Steriler Filter.
  2. Präbestimmen Sie geeignete Liganden und Rezeptoren für den Aggregationstest.
    HINWEIS: In dieser Studie wurden Neurexin3-SS4+/- und einer seiner bekannten Liganden, LRRTM2, verwendet. Liganden und Rezeptoren von Interesse wurden aus cDNAs in pcDNA3.1 ausgedrückt. Eine Gibson-Baugruppe wurde verwendet, um Neurexin3" in pcDNA3.112einzufügen. Neurexin3- F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTGAGCTCGGATCCGCCACCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCT
    GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
  3. Bereiten Sie HEK293T-Zellen vor.
    1. Wachsen Sie HEK293T-Zellen, um in einem T-75-Kolben zu konfluenz.
    2. Einmal konfluent, 2 ml Trypsin verwenden und 2 min in 37 °C Inkubator geben. Fügen Sie dem Kolben 6 ml HEK-Medien hinzu, um Zellen wieder auszusetzen, und übertragen Sie alle 8 ml in ein 15 ml konisches Rohr.
    3. Pellet bei 500 x g für 5 min und resuspendieren in HEK-Zellmedien für insgesamt 8 ml.
    4. Zählen Sie Zellen und fügen Sie 735.000 Zellen in jeden Brunnen einer 6-Well-Platte hinzu. Passen Sie die Endlautstärke mit HEK-Zellmedien auf 2 ml für jeden Brunnen an.
    5. In 37 °C-Inkubator geben und Zellen über Nacht oder bis zu 50-60% Konfluenz wachsen lassen.
  4. Transfekte HEK293T-Zellen mit der Calciumphosphatmethode13.
    1. Transfekte gut-1 mit 3 g des von Interesse und Co-Transfekte mit 1 g fluoreszierendem Protein (3 g pcDNA3.1-Neurexin3-WT SS4- und 1 g mCherry).
    2. Transfekte gut-2 wie in Schritt 1.4.1. aber mit dem mutierten Protein von Interesse (pcDNA3.1-Neurexin3-A687T SS4-).
    3. Transfekte gut-3 mit 3 g des Liganden von Interesse und ko-transfekect mit 1 g eines anderen fluoreszierenden Proteins (3 g pcDNA3.1 LRRTM2 und 1 g GFP).
    4. Transfezieren Sie gut-4 und well-5 als Negativkontrollen: gut-4 mit 1 g GFP und gut-5 mit 1 g mCherry.
    5. Bereiten Sie eine weitere Platte (wie in Schritt 1.4.1-1.4.4) vor, wenn zusätzliche Bedingungen oder Kontrollen erforderlich sind (Neurexin3-WT/A687T SS4+).
      HINWEIS: Die Transfektionseffizienz wird 24 h nach der Transfektion unter einem Epifluoreszenzmikroskop analysiert und als Anzahl der Zellen quantifiziert, die das fluoreszierende Protein exzieren, mit dem sie transfiziert wurden. Ein schlankerer Ansatz würde die Transfektion von HEK-Zellen mit einem bikannronischen Vektor, der für ein fluoreszierendes Protein kodiert, und den Liganden von Interesse umfassen und wird oberhalb der Kotransfektion dringend empfohlen. Im Falle dieser Studie sind Alpha-Neurexine 4,3 kb und eine niedrige Fluoreszenzintensität wurde mit einem bicistronischen System beobachtet, das eine Kotransfektion erforderlich macht.
  5. 48 Stunden nach der Transfektion Ernten Sie Zellen zur Aggregation.
    1. Waschen Sie jeden Brunnen zweimal mit PBS.
    2. Fügen Sie 1 ml 10 mM EDTA in PBS in jeden Brunnen ein, um Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen sanft zu dissoziieren und die Platte bei 37 °C für 5 min zu inkubieren.
      HINWEIS: Trypsin wird für Schritt 1.5.2 aufgrund einer möglichen proteolytischen Spaltung von Adhäsionsmolekülen in der Studie nicht empfohlen. Darüber hinaus kann das Protokoll nach der EDTA-Zugabe möglicherweise erst nach Abschluss angehalten werden, da Zellen nun Umgebungsbedingungen ausgesetzt sind.
    3. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Zellen zu lösen, und ernten Sie jede gut in separaten 15 ml konischen Rohren.
    4. Zentrifugenkonrohre bei 500 x g und Raumtemperatur für 5 min.
  6. Während zellenpelletieren, bereiten Sie 6 Inkubationsröhrchen vor, indem Sie die Oberseite jedes Mikrozentrifugenrohres mit jeder Bedingung beschriften.
    HINWEIS: Jede Permutation der GFP- und mCherry-Bedingungen sollte verwendet werden, um alle experimentellen Bedingungen und ordnungsgemäßen Kontrollen zu umfassen. Zum Beispiel: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3-WT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3-A687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3"WT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3-A687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Stellen Sie zusätzliche Rohre vor, um weitere Bedingungen und Kontrollen zu erfüllen.
  7. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 500 l HEK-Medien mit 10 mM CaCl2 und 10 mM MgCl2 auf 37 °C erwärmt.
    HINWEIS: Die Zugabe von CaCl2 und MgCl2 ermöglicht die Wiederherstellung der Bindung von Haftmolekülen und ist nur erforderlich, wenn die betreffenden transzellulären Interaktionspartner divalente Kationen zur Adhäsion benötigen.
  8. Zählen Sie die Zellen in jedem 15 ml konischen Rohr mit einem Hämozytometer und aliquot 200.000 Zellen jeder Bedingung in ein geeignetes Rohr von Schritt 1.6.1 für eine 1:1-Mischung in einem Gesamtvolumen von 500 l.
    HINWEIS: Es sollte nur 5 min pro Bedingung zu zählen und aliquot Beträge.
  9. Röhren bei Raumtemperatur in einem langsamen Rohrrotator inkubieren.

2. Bildaufnahme

  1. Optimieren Sie die Aufnahmeparameter für mikroskopische Erfassungsparameter für bestimmte Proben. In diesem Beispiel wurden Bilder auf einem Weitfeldmikroskop aufgenommen. Verwenden Sie ein 5-faches Luftobjektiv (NA: 0,15; WD: 20000 m), um ein ausreichend großes Feld für die Analyse zu erhalten.
  2. Bewerten Sie die Basisaggregation unmittelbar nach dem Mischen der beiden Bedingungen von HEK-Zellen in Schritt 1.8. Dies sind jetzt die "Time Zero"-Bilder.
    1. Pipette 40 l jedes Probengemisches auf ein geladenes Mikroskopschlitten und Bild unter Fluoreszenz in den Kanälen 488 und 561.
    2. Erwerben Sie drei verschiedene Sichtfelder auf einer Fokusebene pro Stichprobenablage.
  3. Erfassen Sie die endgültigen Bilder in 60 min als 'zeit 60' Bild.
    1. Um das "Zeit 60"-Bild des Gemischs nach einer 60 min Inkubation zu erhalten, nehmen Sie eine weitere 40-L-Probe jeder Bedingung aus rotierenden Rohren und Pipette jeder Probe auf einem geladenen Schlitten. Bild wie in Schritt 2.2.2.
      HINWEIS: Die Zellaggregation sollte alle 15 Min. überprüft werden, bis die Sättigung eintritt. Der Zeitpunkt der Aggregation hängt von den getesteten Proteinen ab.

3. ImageJ/Fidschi-Analyse

  1. Um das Ausmaß der Aggregation mit Fiji/ImageJ zu quantifizieren, speichern Sie Analysedateien.
    1. Speichern Sie die bereitgestellten ergänzungskodierungsdateien Dateien im Ordner imageJ-Makros auf dem Computer.
    2. Installieren Sie das bereitgestellte Aggregationsmakro (Plugins, Makros, Installieren und wählen Sie die Datei "AggregationAssay.txt".
  2. Bestimmen Sie Schwellenwerte.
    1. Laden Sie eine 'Time Zero' .tif Datei in imageJ und teilen Sie die Kanäle auf (Bild | Farbe | Split-Kanäle).
      HINWEIS: Das Bild "Zeit Null" wird verwendet, um die Schwellenwerte und die kleinste Punktzeichengröße für das gesamte Experiment zu bestimmen.
    2. Maskieren Sie jeden Kanal(Plugins | Makros | AggregationAssay_MakeMask). Das Fenster "Maske aus Bild erstellen" wird angezeigt. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen neben Schwellenwert für Bild bestimmen und Clusterparams aus Histogramm bestimmen, und klicken Sie auf OK.
    3. Bestimmen Sie den Schwellenwert des Bildes mithilfe der Folienleiste, notieren Sie die Zahl rechts neben der Folienleiste, und klicken Sie auf OK.
    4. Es wird ein Histogramm der Clustergröße angezeigt. Wählen Sie eine Clustergröße aus dem Histogramm aus, das zum Experiment passt, geben Sie diese Zahl in das Feld Min ClusterGröße: ein, und klicken Sie auf OK. Cluster unterhalb dieser Größe werden nicht analysiert.
  3. Führen Sie die Analyse aus.
    1. Öffnen Sie das 'time 60'-Bild von Bedingung 1 in imageJ und teilen Sie die Kanäle wie in Schritt 3.2.1 auf.
    2. Maskieren Sie jeden Kanal (Plugins, Makros, AggregationAssay_MakeMask). Verwenden Sie den gleichen Schwellenwert und dieselbe Größe, die in Schritt 3.2.3 und Schritt 3.2.4 festgelegt wurden. Deaktivieren Sie die Felder neben Schwellenwert für Bild bestimmen und Clusterparams aus Histogramm bestimmen, und geben Sie die Größe und die Schwellenwerte manuell in die entsprechenden Felder ein, und klicken Sie dann auf OK.
    3. Berechnen sie denAggregationsindex (Plugins | Makros | AggregationAssay_CalculateOverlap). Wählen Sie die maskierten Kanäle aus, in die verglichen werden soll, und das Verzeichnis, in das die resultierenden Dateien gespeichert werden sollen.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.1–3.3.3 für jedes 'time 60'-Bild in jeder Bedingung.
      ANMERKUNG: Der Aggregationsindex ist definiert als die Gesamteoüberlappungsfläche geteilt durch die Summe der beiden Kanalbereiche abzüglich des Überlappungsbereichs multipliziert mit 100 (Aggregationsindex = Überlappungsfläche/[Fläche von Kanal 1 + Fläche von Kanal 2 – Überlappungsfläche] x 100). Diese Normalisierung ist ein "OR"-Vorgang zwischen den beiden maskierten Kanälen, die die Gesamtpixel in beiden Masken darstellen.

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Ergebnisse

Die A687T-Mutation erhöht die Neurexin3-SS4-Bindung an LRRTM27
Um zu untersuchen, wie interzelluläre Wechselwirkungen zweier bekannter synaptischer Proteine durch die Einführung einer Punktmutation bei einem Patienten mit geistiger Behinderung und Epilepsie beeinflusst werden, verwendeten wir den oben genannten HEK-Zellaggregationstest (Abbildung 1). Die Zellen wurden gemäß Abschnitt 1 transfiziert und für die Bildgebung gemäß den Abschnitten 1 und 2 de...

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Diskussion

Die Sezieren der Protein-Protein-Wechselwirkungen, die während der Zelladhäsion im Trans auftreten, kann zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen führen, die grundlegenden zellulären Prozessen zugrunde liegen, einschließlich der Bildung, Funktion und Wartung von Synapsen während der Reifung und des Umbaus. Die Implikationen von Zell-zu-Zell-Interaktionen gehen über die Neurobiologie hinaus und spielen eine breitere Rolle bei der Signaltransduktion, Zellmigration und Gewebeentwicklung

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Institute of Mental Health (R00MH103531 und R01MH116901 to J.A.), ein Predoctoral Training Grant vom National Institute of General Medicine (T32GM007635 to S.R.) und ein Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 to S.R.) unterstützt. Wir danken Dr. Kevin Woolfrey für die Hilfe beim Mikroskop, Dr. K. Ulrich Bayer für den Einsatz seines Epifluoreszenzmikroskops und Thomas Südhof (Stanford University) für das LRRTM2-Plasmid.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL disposable microtubes with snap capsVWR89000-028Incubation of mixed population of HEK cells
1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membraneThermo Fisher567-0020Sterilization of HEK media
15 mL SpectraTube centrifuge tubesWard’s Science470224-998Harvesting HEK cells
6 well sterile tissue culture platesVWR100062-892culturing HEK cells
Calcium ChlorideSigma223506-500GCalcium phosphate transfection, HEK cell resuspension
Centrifuge- Sorvall Legend RTKendro Laboratory Products75004377Harvesting HEK cells
CO2 cell incubatorThermo ScientificHERACELL 150iIncubation of HEK cells during growth
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvateCorning10-013-CVHEK cell maintenance
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)Gibco14190-144Passaging/harvesting HEK cell
Ethylenediaminetetraacetic acidSigmaED-500GHarvesting HEK cells
Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth areaCorning9381M26Culturing HEK cells
Fetal Bovine SerumSigma17L184HEK cell maintenance
HEK293T cellsATCCModel system
ImageJNIHV: 2.0.0-rc-69/1.52pImage analysis
Magnesium Chloride hexahydrateSigmaM9272-500GHEK cell resuspension
Sodium phosphate dibasic anhydrousFisher BioReagentsBP332-500Calcium phosphate transfection
Trypsin 0.25% (1X) SolutionGE Healthcare Life SciencesSH30042.01Passaging HEK cells
Tube rotatorIncubation of mixed population of HEK cells
UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive ChargedDenville Scientific Inc.M1021Image acquisition
Wide-field microscopeZeissAxio Vert 200MImage acquisition

Referenzen

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