Mesure des interactions transcellulaires par agrégation protéique dans un système cellulaire hétéroologeux

Résumé

Ici, nous présentons un protocole optimisé pour mesurer rapidement et semiquantitativement les interactions ligand-récepteur dans trans dans un système cellulaire heterologous utilisant la microscopie de fluorescence.

Résumé

Les interactions protéiques aux interfaces cellulaires dictent une multitude de résultats biologiques allant du développement tissulaire et de la progression du cancer à la formation et à l’entretien de la synapse. Bon nombre de ces interactions fondamentales se produisent en trans et sont généralement induites par des interactions hétérophiliques ou homophiliques entre les cellules exprimant des paires de liaisons ancrées dans la membrane. L’élucidation de la façon dont les mutations pertinentes à la maladie perturbent ces interactions protéiques fondamentales peut donner un aperçu d’une myriade de domaines de biologie cellulaire. De nombreux analyses d’interaction protéine-protéine ne se désambigulent généralement pas entre les interactions cis et trans, ce qui conduit potentiellement à une surestimation de l’étendue de la liaison qui se produit in vivo et impliquent la purification à forte intensité de main-d’œuvre des protéines et / ou de l’équipement de surveillance spécialisée. Ici, nous présentons un protocole simple optimisé qui permet l’observation et la quantification des interactions trans seulement sans avoir besoin de longues purifications de protéines ou d’équipements spécialisés. L’analyse d’agrégation cellulaire HEK implique le mélange de deux populations indépendantes de cellules HEK, chacune exprimant des ligands cognate liés à la membrane. Après une courte période d’incubation, les échantillons sont photographiés et les agrégats qui en résultent sont quantifiés.

Introduction

Les interactions synaptiques facilitées par les molécules d’adhérence synaptique sont fondamentales pour le développement, l’organisation, la spécification, la maintenance et la fonction des synapses et la génération de réseaux neuronaux. L’identification de ces molécules transsynaptiques d’adhérence de cellules augmente rapidement ; il est donc fondamentalement important d’identifier des partenaires contraignants et de comprendre comment ces nouvelles molécules d’adhérence interagissent les unes avec les autres. En outre, le séquençage du génome a identifié des mutations dans beaucoup de ces molécules d’adhérence qui sont généralement liées à une multitude de troubles neurodéveloppementaux, neuropsychiatriques et de toxicomanie¹. Les mutations dans les gènes qui codent pour les molécules synaptiques d’adhérence cellulaire peuvent modifier négativement les interactions trans et peuvent contribuer à des altérations pathophysiologiques de la formation et ou de l’entretien de la synapse.

Il existe de multiples analyses pour évaluer quantitativement les interactions protéine-protéine telles que la calorimétrie isotherme, le dichroism circulaire, la résonance plasmonique de surface^{2 et} bien que quantitatives, elles ont plusieurs limites. Tout d’abord, ils nécessitent des protéines recombinantes, exigeant parfois des étapes de purification longues et fastidieuses. Deuxièmement, ils nécessitent un équipement spécialisé sophistiqué et une expertise technique. Troisièmement, ils peuvent surestimer l’étendue de la liaison car ils permettent à la fois cis et interactions trans entre les protéines qui sont naturellement attachés à une membrane in vivo. Ici, nous proposons un test simple et relativement rapide qui teste exclusivement les interactions trans.

Pour contourner bon nombre des complications associées aux analyses de protéines purifiées, nous avons optimisé un test d’interaction protéique à base de cellules qui récapitule les interactions trans dans un système cellulaire héterologique réduit. Cet essai a été précédemment utilisé sous diverses formes pour étudier les interactions transcellulaires. Dans cette approche, les molécules d’adhérence des cellules candidats sont transfectées en cellules HEK293T. Dans des conditions physiologiques, les cellules HEK293T ne présentent pas d’auto-agrégation, ce qui en fait des modèles exemplaires pour cet essai. Cependant, lorsque des populations individuelles de cellules HEK exprimant des récepteurs et des ligands sont combinées, la liaison du récepteur et la ligand force l’agrégation des cellules HEK à se produire. Cette agrégation est médiée exclusivement par des interactions trans et est généralement observable en dizaines de minutes. Aucune étape de purification des protéines n’est requise dans cette méthode, et l’efficacité de la méthode repose sur le paradigme selon laquelle les populations de cellules HEK exprimant des molécules d’adhérence cognate sont combinées, puis photographiées seulement des dizaines de minutes plus tard. En outre, cette méthode est relativement peu coûteuse, car ni anticorps ni équipement coûteux ne sont nécessaires. Le seul équipement nécessaire à l’acquisition de données est un microscope fluorescent standard. Un avantage supplémentaire à cet essai basé sur la cellule est la capacité de dépister rapidement l’effet des mutations de point pertinentes de la maladie sur les interactions trans. Ceci peut être exécuté en transfectant des cellules de HEK avec des CDNAs des variantes mutantes de la protéine d’intérêt.

Dans ce protocole, nous présentons un exemple dans lequel nous étudions si une mutation de missense dans Neurexin3α (Neurexin3α^A687T),identifiée dans un patient diagnostiqué avec la déficience intellectuelle profonde et l’épilepsie, modifie des interactions dans trans avec la protéine transmembrane répétée riche en leucine 2 (LRRTM2). Neurexin3α est un membre de la famille evolutionarily conservé des molécules présynaptiques d’adhérence cellulaire et tandis que les travaux récents ont identifié de multiples rôles à la synapse^3,4,5,6,7, notre compréhension synaptique de cette molécule et tous les membres de la famille neurexin reste incomplète. LRRTM2 est une protéine excitatrice d’adhérence cellulaire postsynaptique qui participe à la formation et à l’entretien de la synapse^8,9,10. Fait important, LRRTM2 interagit exclusivement avec les isoformes de neurexine qui n’ont pas le site d’épissage 4 exon alternatif (SS4-) mais pas avec les isoformes de neurexin contenant le site d’épissage 4 exon alternatif (SS4+). La mutation de missense humaine (A687T) identifiée dans Neurexin3α est située dans une région extracellulaire non étudiée qui est evolutionarily conservée et est conservée entre tous les alpha neurexins⁷. Comme l’interaction entre ces deux molécules a été^{établie 8,9,11}, nous avons posé la question: est la capacité contraignante de Neurexin3α SS4- à LRRTM2 modifié par une mutation point A687T? Cet essai a indiqué que la mutation de point d’A687T a augmenté de façon inattendue l’agrégation de Neurexin3α à LRRTM2 suggérant que la région extracellulaire dans laquelle la mutation ponctuelle est située, joue un rôle dans la médiation des interactions transsynaptiques.

Protocole

1. Culture cellulaire et transfection

1. Faire des médias cellulaires HEK avec DMEM, 1x (Modification de Dulbecco de Eagle’s Medium) complété par 4,5 g/L de glucose, L-glutamine & pyruvate de sodium et 10% FBS. Filtre stérile.
2. Prédéterminer les ligands et les récepteurs appropriés pour l’analyse d’agrégation.
   REMARQUE : Neurexin3α SS4+/- et l’un de ses ligands connus, LRRTM2, ont été utilisés dans cette étude. Ligands et récepteurs d’intérêt ont été exprimés des CDNA dans pcDNA3.1. Un assemblage Gibson a été utilisé pour insérer Neurexin3α dans pcDNA3.1¹². Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCGCGCCCCCCATGAGCTTTACCCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. Préparer les cellules HEK293T.
   1. Faire pousser les cellules HEK293T à la confluence dans un flacon T-75.
   2. Une fois confluent, utiliser 2 mL de trypsine et placer dans un incubateur de 37 °C pendant 2 min. Ajouter 6 mL de médias HEK au flacon pour résusquer les cellules et transférer les 8 mL dans un tube conique de 15 mL.
   3. Granulé à 500 x g pendant 5 min et résuspendez dans les médias cellulaires HEK pour un total de 8 mL.
   4. Comptez les cellules et ajoutez 735 000 cellules dans chaque puits d’une plaque de 6 puits. Réglez le volume final à 2 mL pour chaque puits à l’aide de supports cellulaires HEK.
   5. Placer dans un incubateur à 37 °C et permettre aux cellules de croître pendant la nuit ou jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 50 à 60 %.
4. Cellules transfect HEK293T utilisant la méthode de phosphate de calcium^13.
   1. Transfect bien-1 avec 3 μg de la protéine d’intérêt et co-transfect avec 1 μg de protéine fluorescente (3 μg de pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- et 1 μg de mCherry).
   2. Transfect bien-2 comme dans l’étape 1.4.1. mais avec la protéine mutée d’intérêt (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-).
   3. Transfect bien-3 avec 3 μg du ligand d’intérêt et co-transfect avec 1 μg d’une autre protéine fluorescente (3 μg de pcDNA3.1 LRRTM2 et 1 μg de GFP).
   4. Transfect bien-4 et bien-5 pour servir de contrôles négatifs: bien-4 avec 1 μg de GFP et bien-5 avec 1 μg de mCherry.
   5. Préparer une autre plaque (comme à l’étape 1.4.1-1.4.4) si vous avez besoin de conditions ou de commandes supplémentaires (Neurexin3α^WT/A687T SS4+).
      REMARQUE : L’efficacité de transfection est analysée 24 h après transfection sous un microscope d’épifluorescence et quantifiée comme nombre de cellules exprimant la protéine fluorescente avec laquelle elles ont été transfectées. Une approche plus rationalisée comprendrait la transfection des cellules HEK avec un codage vectoriel bicisronique pour une protéine fluorescente et le ligand d’intérêt et est fortement recommandé au-dessus de la co-transfection. Dans le cas de cette étude, les néurexines alpha sont ~4.3 kb et l’intensité de fluorescence basse a été observée utilisant un système bicistronic nécessitant la co-transfection.
5. 48 heures après la transfection, récolter les cellules pour l’agrégation.
   1. Lavez-les deux fois avec du PBS.
   2. Ajouter 1 mL de 10 mM d’EDTA dans chaque puits pour dissocier délicatement les interactions cellule à cellule et incuber la plaque à 37 °C pendant 5 min.
      REMARQUE : La trypsine n’est pas recommandée pour l’étape 1.5.2 en raison du clivage protéolytique potentiel des molécules d’adhérence dans l’étude. En outre, après l’ajout EDTA le protocole ne peut pas être arrêté jusqu’à ce que l’achèvement que les cellules seront maintenant exposés à des conditions ambiantes.
   3. Appuyez doucement sur la plaque pour détacher les cellules et récoltez chacune bien dans des tubes coniques séparés de 15 mL.
   4. Tubes coniques centrifugeuses à 500 x g et température ambiante pendant 5 min.
6. Pendant que les cellules sont granulées, préparez 6 tubes d’incubation en étiquetant le dessus de chaque tube de microcentrifugeuse à chaque condition.
   REMARQUE : Chaque permutation des conditions GFP et mCherry doit être utilisée pour englober toutes les conditions expérimentales et les contrôles appropriés. Par exemple: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3α^WT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3α^A687T SS4- -mCherry, 5. Neurexin3α^WT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3α^A687T SS4- -mCherry/LRRTM2—GFP. Fabriquer des tubes supplémentaires pour répondre à d’autres conditions et contrôles.
7. Retirer les cellules supernatantes et résuspendantes dans 500 μL de supports HEK avec 10 mM CaCl₂ et 10 mM MgCl₂ réchauffés à 37 °C.
   REMARQUE : L’ajout de CaCl_{2 et} de MgCl₂ permet aux molécules d’adhérence de rétablir la liaison et n’est nécessaire que si les partenaires d’interaction transcellulaire en question nécessitent des cations divalentes pour l’adhérence.
8. Comptez les cellules dans chaque tube conique de 15 mL à l’aide d’un hémocytomètre et aliquot 200.000 cellules de chaque condition dans le tube approprié de l’étape 1.6.1 pour un mélange 1:1 dans un volume total de 500 μL.
   REMARQUE: Il ne devrait prendre que 5 min par condition pour compter et aliquot quantités.
9. Incuber les tubes à température ambiante dans un rotateur à tube lent.

2. Acquisition d’images

1. Optimisez les paramètres d’acquisition du microscope pour des échantillons spécifiques. Dans cet exemple, des images ont été prises sur un microscope à champ large. Utilisez un objectif 5x air (NA: 0.15; DEO: 20000 μm) pour obtenir un champ assez grand pour l’analyse.
2. Évaluer l’agrégation de base immédiatement après le mélange des deux conditions des cellules HEK à l’étape 1.8. Ce sont maintenant les images « temps zéro ».
   1. Pipette 40 μL de chaque mélange d’échantillon sur une lame de microscope chargée et l’image sous fluorescence dans les canaux 488 et 561.
   2. Acquérir trois champs de vision différents à un seul plan de mise au point par goutte d’échantillon.
3. Obtenez des images finales à 60 min sous forme d’image 'time 60'.
   1. Pour obtenir l’image « temps 60 » du mélange après une incubation de 60 min, prenez un autre échantillon de 40 μL de chaque condition à partir de tubes rotatifs et pipette chaque échantillon sur une diapositive chargée. Image comme dans l’étape 2.2.2.
      REMARQUE : L’agrégation cellulaire doit être vérifiée toutes les 15 minutes jusqu’à ce que la saturation se produise. Le moment de l’agrégation dépendra des protéines testées.

3. Analyse ImageJ/Fidji

1. Pour quantifier l’étendue de l’agrégation à l’aide de Fiji/ImageJ, enregistrez les fichiers d’analyse.
   1. Enregistrez les fichiers de codage supplémentaires fournis dans le dossier macros imageJ sur l’ordinateur.
   2. Installez la macro agrégation fournie (Plugins, Macros, Installer et sélectionnez le fichier « AgrégationAssay.txt »).
2. Déterminez les seuils.
   1. Chargez un fichier « time zero » .tif en imageJ et divisez les canaux(Image | Couleur | Canaux fractionnements).
      REMARQUE : L’image « temps zéro » est utilisée pour déterminer le seuil et la plus petite taille de ponction pour l’ensemble de l’expérience.
   2. Masquer chaque canal(Plugins | Macros | AggregationAssay_MakeMask). Faire masque de fenêtre d’image apparaîtra. Cochez les cases à côté de Déterminer le seuil d’image et déterminez les params de cluster à partir de l’histogramme et cliquez sur OK.
   3. Déterminez le seuil de l’image à l’aide de la barre de diapositives, enregistrez le numéro à droite de la barre de diapositives et cliquez sur OK.
   4. Un histogramme de taille de cluster apparaîtra. Sélectionnez une taille de cluster à partir de l’histogramme qui convient à l’expérience, tapez ce nombre dans la taille min cluster: boîte, et cliquez sur OK. Les grappes inférieures à cette taille ne seront pas analysées.
3. Exécutez l’analyse.
   1. Ouvrez l’image « temps 60 » de l’état 1 dans l’imageJ et divisez les canaux comme à l’étape 3.2.1.
   2. Masquez chaque canal (Plugins, Macros, AggregationAssay_MakeMask). Utilisez le même seuil et la même taille déterminés à l’étape 3.2.3 et à l’étape 3.2.4. Désélectionner les cases à côté de déterminer le seuil d’image et déterminer les params de cluster à partir de l’histogramme et taper manuellement la taille et les seuils dans les champs appropriés, puis cliquez sur OK.
   3. Calculer l’indice d’agrégation(Plugins | Macros | AggregationAssay_CalculateOverlap). Sélectionnez les canaux masqués à comparer et l’annuaire dans lequel les fichiers résultants enregistreront.
   4. Répétez les étapes 3.3.1-3.3.3 pour chaque image 'time 60' dans toutes les conditions.
      REMARQUE : L’indice d’agrégation est défini comme la zone de chevauchement totale divisée par la somme des deux zones de canal moins la zone de chevauchement multipliée par 100 (indice d’agrégation = zone de chevauchement/[zone du canal 1 + zone du canal 2 – zone de chevauchement] x 100). Cette normalisation est une opération « OR » entre les deux canaux masqués représentant le total des pixels dans l’un ou l’autre masque.

Résultats

La mutation A687T augmente Neurexin3α SS4- liaison à LRRTM2⁷
Pour étudier comment les interactions intercellulaires de deux protéines synaptiques connues sont affectées par l’introduction d’une mutation ponctuelle trouvée chez un patient souffrant de déficience intellectuelle et d’épilepsie, nous avons utilisé l’analyse d’agrégation cellulaire HEK ci-dessus (figure 1). Les cellules ont été transfectées selon l’article 1 et préparées p...

Discussion

Disséquer les interactions protéine-protéine qui se produisent en trans pendant l’adhérence cellulaire peut conduire à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents aux processus cellulaires de base, y compris la formation, la fonction et le maintien des synapses pendant la maturation et le remodelage. Les implications des interactions cellule à cellule s’élargissent au-delà de la neurobiologie et jouent un rôle plus large dans la transduction du signal, la migration cellulaire et l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL disposable microtubes with snap caps	VWR	89000-028	Incubation of mixed population of HEK cells
1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane	Thermo Fisher	567-0020	Sterilization of HEK media
15 mL SpectraTube centrifuge tubes	Ward’s Science	470224-998	Harvesting HEK cells
6 well sterile tissue culture plates	VWR	100062-892	culturing HEK cells
Calcium Chloride	Sigma	223506-500G	Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension
Centrifuge- Sorvall Legend RT	Kendro Laboratory Products	75004377	Harvesting HEK cells
CO2 cell incubator	Thermo Scientific	HERACELL 150i	Incubation of HEK cells during growth
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV	HEK cell maintenance
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)	Gibco	14190-144	Passaging/harvesting HEK cell
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	ED-500G	Harvesting HEK cells
Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area	Corning	9381M26	Culturing HEK cells
Fetal Bovine Serum	Sigma	17L184	HEK cell maintenance
HEK293T cells	ATCC		Model system
ImageJ	NIH	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	Image analysis
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma	M9272-500G	HEK cell resuspension
Sodium phosphate dibasic anhydrous	Fisher BioReagents	BP332-500	Calcium phosphate transfection
Trypsin 0.25% (1X) Solution	GE Healthcare Life Sciences	SH30042.01	Passaging HEK cells
Tube rotator			Incubation of mixed population of HEK cells
UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged	Denville Scientific Inc.	M1021	Image acquisition
Wide-field microscope	Zeiss	Axio Vert 200M	Image acquisition