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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo ottimizzato per misurare rapidamente e semiquantitativamente le interazioni ligando-recettore in trans in un sistema cellulare eterologo utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Abstract

Le interazioni proteiche alle interfacce cellulari impongono una moltitudine di risultati biologici che vanno dallo sviluppo dei tessuti e dalla progressione del cancro alla formazione e al mantenimento della sinapsi. Molte di queste interazioni fondamentali si verificano in trans e sono tipicamente indotte da interazioni eterofile o omofile tra cellule che esprimono coppie di legame ancorate a membrana. Chiarire come le mutazioni rilevanti della malattia interrompano queste interazioni proteiche fondamentali può fornire informazioni su una miriade di campi della biologia cellulare. Molti test di interazione proteina-proteina in genere non disambiguano tra cis e interazioni trans, il che potenzialmente porta a una sopravvalutazione dell'estensione di legame che si sta verificando in vivo e comporta una purificazione intensiva del lavoro delle proteine e / o apparecchiature di monitoraggio specializzate. Qui presentiamo un semplice protocollo ottimizzato che consente l'osservazione e la quantificazione di solo interazioni trans senza la necessità di lunghe purificazione proteica o attrezzature specializzate. Il saggio di aggregazione cellulare HEK prevede la miscelazione di due popolazioni indipendenti di cellule HEK, ognuna delle quali esprime ligandi affini legati alla membrana. Dopo un breve periodo di incubazione, i campioni vengono immagine e gli aggregati risultanti vengono quantificati.

Introduzione

Le interazioni sinaptiche facilitate dalle molecole di adesione sinaptica sono fondamentali per lo sviluppo, l'organizzazione, le specifiche, il mantenimento e la funzione delle sinapsi e la generazione di reti neurali. L'identificazione di queste molecole di adesione delle cellule transsinaptiche è in rapido aumento; pertanto, è fondamentale identificare partner vincolanti e capire come queste nuove molecole di adesione interagiscono tra loro. Inoltre, il sequenziamento del genoma ha identificato mutazioni in molte di queste molecole di adesione che sono comunemente collegate a una moltitudine di disturbi del neurosviluppo, neuropsichiatrici e della dipendenza1. Mutazioni nei geni che codificano per molecole sinaptiche di adesione cellulare possono alterare negativamente le interazioni trasmissibili e possono contribuire ad alterazioni fisiopatiche nella formazione e o nel mantenimento della sinapsi.

Esistono più saggi per valutare quantitativamente le interazioni proteina-proteina come la calorimetria isotermica, il dicroismo circolare, la risonanza plasmonicasuperficiale 2 e, sebbene di natura quantitativa, hanno diversi limiti. In primo luogo, richiedono proteine ricombinanti, a volte richiedendo lunghi e noiosi passaggi di purificazione. In secondo luogo, richiedono sofisticate attrezzature specializzate e competenze tecniche. In terzo luogo, possono sopravvalutare l'estensione del legame in quanto consentono sia interazioni cis che trans tra proteine che sono naturalmente legate a una membrana in vivo. Qui proponiamo un saggio semplice e relativamente rapido che testa esclusivamente le interazioni trans.

Per aggirare molte delle complicazioni associate ai test proteici purificati, abbiamo ottimizzato un saggio di interazione proteica a base cellulare che riassume le interazioni trans in un sistema di cellule eterologhe ridotto. Questo saggio è stato precedentemente utilizzato in varie forme per studiare le interazioni transcellulari. In questo approccio, le molecole di adesione delle cellule candidate vengono trasfette in cellule HEK293T. In condizioni fisiologiche, le cellule HEK293T non mostrano auto-aggregazione, rendendole modelli esemplari per questo saggio. Tuttavia, quando vengono combinate singole popolazioni di cellule HEK che esprimono recettore e ligando, il legame del recettore e del ligando forza l'aggregazione delle cellule HEK. Questa aggregazione è mediata esclusivamente da interazioni trans ed è solitamente osservabile in decine di minuti. Non sono necessari passaggi di purificazione delle proteine in questo metodo, e l'efficienza del metodo si basa sul paradigma che le popolazioni di cellule HEK che esprimono molecole di adesione affini vengono combinate e quindi immaginiate solo decine di minuti dopo. Inoltre, questo metodo è relativamente economico, in quanto non sono necessari né anticorpi né attrezzature costose. L'unica apparecchiatura necessaria per l'acquisizione dei dati è un microscopio fluorescente standard. Un ulteriore vantaggio di questo saggio basato sulle cellule è la capacità di migliorare rapidamente l'effetto delle mutazioni puntili rilevanti della malattia sulle interazioni trans. Questo può essere eseguito trasfettando le cellule HEK con cDNA delle varianti mutanti della proteina di interesse.

In questo protocollo, presentiamo un esempio in cui studiamo se una mutazione missense in Neurexin3α (Neurexin3αA687T), identificata in un paziente a cui è stata diagnosticata una profonda disabilità intellettiva ed epilessia, altera le interazioni in trans con la proteina transmembrana ripetuta ricca di leucina 2 (LRRTM2). Neurexin3α è un membro della famiglia evolutivamente conservata di molecole di adesione cellulare presinaptica e mentre recenti lavori hanno identificato molteplici ruoli alla sinapsi3,4, 5,6,7, la nostra comprensione sinaptica di questa molecola e di tutti i membri della famiglia delle neuressine rimane incompleta. LRRTM2 è una proteina di adesione a cellule postsinaptiche eccitatorie che partecipa alla formazione e al mantenimento della sinapsi8,9,10. È importante sottolineare che LRRTM2 interagisce esclusivamente con le isoforme di neurexina che mancano dell'esone alternativo del sito di giunzione 4 (SS4-) ma non con isoforme di neuresina contenenti l'esone alternativo del sito di giunzione 4 (SS4+). La mutazione del missense umano (A687T) identificata in Neurexin3α si trova in una regione extracellulare non studiato che è conservata evolutivamente e viene conservata tra tutte le neuressine alfa7. Poiché l'interazione tra queste due molecoleè stata stabilita 8,9,11, abbiamo posto la domanda: la capacità di legame di Neurexin3α SS4- a LRRTM2 è alterata da una mutazione puntile A687T? Questo saggio ha rivelato che la mutazione del punto A687T ha inaspettatamente migliorato l'aggregazione di Neurexin3α a LRRTM2 suggerendo che la regione extracellulare in cui si trova la mutazione puntile, gioca un ruolo nella mediazione delle interazioni transsinattiche.

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Protocollo

1. Coltura cellulare e trasfezione

  1. Rendere i supporti cellulari HEK con DMEM, 1x (Modifica del mezzo dell'aquila di Dulbecco) integrati con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio e FBS al 10%. Filtro sterile.
  2. Predeterminare ligandi e recettori adatti per il test di aggregazione.
    NOTA: Neurexin3α SS4+/- e uno dei suoi ligandi noti, LRRTM2, sono stati utilizzati in questo studio. Ligandi e recettori di interesse sono stati espressi da cDNA in pcDNA3.1. Un assieme Gibson è stato utilizzato per inserire Neurexin3α in pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
    GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
  3. Preparare le celle HEK293T.
    1. Far crescere le cellule HEK293T fino alla confluenza in un pallone T-75.
    2. Una volta confluente, utilizzare 2 mL di tripina e posizionare in un incubatore a 37 °C per 2 minuti. Aggiungere 6 ml di supporti HEK al pallone per rimospendare le celle e trasferire tutti gli 8 ml in un tubo conico da 15 ml.
    3. Pellet a 500 x g per 5 min e resuspend in supporti cellulari HEK per un totale di 8 mL.
    4. Contare le cellule e aggiungere 735.000 celle in ogni pozzo di una piastra a 6 po'. Regolare il volume finale a 2 mL per ogni pozzo utilizzando il supporto cellulare HEK.
    5. Mettere in incubatrice a 37 °C e lasciare che le cellule crescano durante la notte o fino a raggiungere il 50-60% di confluenza.
  4. Trasfetto cellule HEK293T utilizzando il metodo del fosfatodi calcio 13.
    1. Trasfetto bene-1 con 3 μg della proteina di interesse e co-trasfettura con 1 μg di proteina fluorescente (3 μg di pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- e 1 μg di mCherry).
    2. Trasfetto bene-2 come nel passaggio 1.4.1. ma con la proteina mutata di interesse (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
    3. Trasfetto bene-3 con 3 μg del ligando di interesse e co-trasfetto con 1 μg di un'altra proteina fluorescente (3 μg di pcDNA3.1 LRRTM2 e 1 μg di GFP).
    4. Trasfetto bene-4 e ben 5 per servire come controlli negativi: ben-4 con 1 μg di GFP e ben-5 con 1 μg di mCherry.
    5. Preparare un'altra piastra (come nel passaggio 1.4.1-1.4.4) se si richiedono condizioni o controlli aggiuntivi (Neurexin3αWT/A687T SS4+).
      NOTA: L'efficienza della trasfezione viene analizzata 24 ore dopo la trasfezione al microscopio a epifluorescenza e quantificata come il numero di cellule che esprimono la proteina fluorescente con cui sono state trasfette. Un approccio più snello includerebbe la trasfezione delle cellule HEK con una codifica vettoriale bicistronica per una proteina fluorescente e il ligando di interesse ed è altamente raccomandato sopra la co-trasfezione. Nel caso di questo studio, le neuressine alfa sono ~ 4,3 kb e la bassa intensità di fluorescenza è stata osservata usando un sistema bicistronico che richiede la co-trasfezione.
  5. 48 ore dopo la trasfezione, cellule di raccolta per l'aggregazione.
    1. Lavare ogni bene due volte con PBS.
    2. Aggiungere 1 mL di EDTA da 10 mM in PBS in ogni pozzo per dissociare delicatamente le interazioni da cellula a cellula e incubare la piastra a 37 °C per 5 min.
      NOTA: La tripsidena non è raccomandata per il passaggio 1.5.2 a causa della potenziale scissione proteolitica delle molecole di adesione in studio. Inoltre, dopo l'aggiunta di EDTA, il protocollo potrebbe non essere interrotto fino al completamento poiché le celle saranno ora esposte a condizioni ambientali.
    3. Toccare delicatamente la piastra per staccare le celle e raccoglierla in tubi conici separati da 15 ml.
    4. Centrifuga tubi conici a 500 x g e temperatura ambiente per 5 min.
  6. Mentre le cellule sono in pellettizzazione, preparare 6 tubi di incubazione etichettando la parte superiore di ogni tubo di microcentrifugo ad ogni condizione.
    NOTA: Ogni permutazione delle condizioni GFP e mCherry deve essere utilizzata per comprendere tutte le condizioni sperimentali e i controlli adeguati. Ad esempio: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4--mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2-GFP. Crea tubi aggiuntivi per adattarsi a ulteriori condizioni e controlli.
  7. Rimuovere le cellule supernatanti e resuspend in 500 μL di mezzi HEK con CaCl2 da 10 mM e MgCl2 da 10 mM riscaldati a 37 °C.
    NOTA: L'aggiunta di CaCl2 e MgCl2 consente alle molecole di adesione di ristabilire il legame ed è necessaria solo se i partner di interazione transcellulare in questione richiedono formazioni divalenti per l'adesione.
  8. Contare le cellule in ogni tubo conico da 15 ml utilizzando un emocitometro e aliquote 200.000 celle di ciascuna condizione in un tubo appropriato dal passo 1.6.1 per una miscela 1:1 in un volume totale di 500 μL.
    NOTA: Per contare e aliquota devono essere previsti solo 5 minuti per condizione.
  9. Incubare i tubi a temperatura ambiente in un rotatore a tubo lento.

2. Acquisizione di immagini

  1. Ottimizzare i parametri di acquisizione del microscopio per campioni specifici. In questo esempio, le immagini sono state scattate su un microscopio a campo largo. Utilizzare un obiettivo 5x air (NA: 0.15; WD: 20000 μm) per ottenere un campo abbastanza grande per l'analisi.
  2. Valutare l'aggregazione di base immediatamente dopo aver mescolato le due condizioni delle celle HEK nel passaggio 1.8. Queste sono ora le immagini 'time zero'.
    1. Pipetta 40 μL di ogni miscela di campioni su un vetrino del microscopio caricato e immagine sotto fluorescenza sia nei canali 488 che 561.
    2. Acquisire tre diversi campi di visualizzazione con un piano di messa a fuoco per goccia di esempio.
  3. Acquisisci le immagini finali a 60 minuti come immagine "tempo 60".
    1. Per ottenere l'immagine "tempo 60" della miscela dopo un'incubazione di 60 minuti, prendere un altro campione di 40 μL di ciascuna condizione da tubi rotanti e pipettare ogni campione su uno scivolo carico. Immagine come nel passaggio 2.2.2.
      NOTA: l'aggregazione cellulare deve essere controllata ogni 15 minuti fino a quando non si verifica la saturazione. La tempistica dell'aggregazione dipenderà dalle proteine testate.

3. Analisi ImageJ/Fiji

  1. Per quantificare l'estensione dell'aggregazione utilizzando Fiji/ImageJ, salvare i file di analisi.
    1. Salvare i file di codifica supplementari forniti nella cartella imageJ macros del computer.
    2. Installare la macro di aggregazione fornita (Plugin, Macro, Installa e selezionare il file "AggregationAssay.txt").
  2. Determinare le soglie.
    1. Caricare un 'time zero' .tif file in imageJ e dividere i canali (Image | Colore | Canali divisi).
      NOTA: l'immagine 'time zero' viene utilizzata per determinare la soglia e la dimensione minima del puncta per l'intero esperimento.
    2. Maschera ogni canale(plugin | Macro | AggregationAssay_MakeMask). Verrà visualizzata la finestra Crea maschera da immagine. Accanto a Determine Threshold for Image e Determine Cluster Params from Histogram e fare clic su OK.
    3. Determinare la soglia dell'immagine utilizzando la barra delle diapositive, registrare il numero a destra della barra della diapositiva e fare clic su OK.
    4. Verrà visualizzato un istogramma delle dimensioni del cluster. Selezionare una dimensione del cluster dall'istogramma adatto all'esperimento, digitare questo numero nella casella Dimensioni cluster minimo: e fare clic su OK. I cluster al di sotto di questa dimensione non verranno analizzati.
  3. Eseguire l'analisi.
    1. Aprire l'immagine "tempo 60" della condizione 1 in imageJ e dividere i canali come nel passaggio 3.2.1.
    2. Maschera ogni canale (plugin, macro, AggregationAssay_MakeMask). Utilizzare la stessa soglia e dimensione determinata nel passaggio 3.2.3 e nel passaggio 3.2.4. Deselezionare le caselle accanto a Determina soglia per immagine e Determinare i parametri cluster dall'istogramma e digitare manualmente le dimensioni e le soglie nei campi appropriati, quindi fare clic su OK.
    3. Calcolare l'indice di aggregazione (Plugins | Macro | AggregationAssay_CalculateOverlap). Selezionare i canali mascherati da confrontare e la directory in cui verranno salvate i file risultanti.
    4. Ripetere i passaggi da 3.3.1 a 3.3.3 per ogni immagine "tempo 60" in ogni condizione.
      NOTA: L'indice di aggregazione è definito come l'area di sovrapposizione totale divisa per la somma delle due aree di canale meno l'area di sovrapposizione moltiplicata per 100 (indice di aggregazione = area di sovrapposizione/[area del canale 1 + area del canale 2 – area di sovrapposizione] x 100). Questa normalizzazione è un'operazione 'OR' tra i due canali mascherati che rappresentano i pixel totali in entrambe le maschere.

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Risultati

La mutazione A687T aumenta Neurexin3α SS4- legando a LRRTM27
Per indagare come le interazioni intercellulari di due proteine sinaptiche note siano influenzate dall'introduzione di una mutazione puntile riscontrata in un paziente con disabilità intellettiva ed epilessia, abbiamo usato il suddetto saggio di aggregazione cellulare HEK (Figura 1). Le cellule sono state trasfette secondo la sezione 1 e preparate per l'imaging secondo le sezioni 1 e 2 del protocoll...

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Discussione

Sezionare le interazioni proteina-proteina che si verificano in trans durante l'adesione cellulare può portare a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari alla base dei processi cellulari di base tra cui la formazione, la funzione e il mantenimento delle sinapsi durante la maturazione e il rimodellamento. Le implicazioni delle interazioni cellula-cellula si espandono oltre la neurobiologia e hanno ruoli più ampi nella trasduzione del segnale, nella migrazione cellulare e nello sviluppo deite...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institute of Mental Health (R00MH103531 e R01MH116901 a J.A.), una borsa di formazione pre-dottorato del National Institute of General Medicine (da T32GM007635 a S.R.) e una Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 to S.R.). Ringraziamo il Dr. Kevin Woolfrey per l'aiuto al microscopio, il Dr. K Ulrich Bayer per l'uso del suo microscopio epifluorescente e Thomas Südhof (Stanford University) per il plasmide LRRTM2.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL disposable microtubes with snap capsVWR89000-028Incubation of mixed population of HEK cells
1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membraneThermo Fisher567-0020Sterilization of HEK media
15 mL SpectraTube centrifuge tubesWard’s Science470224-998Harvesting HEK cells
6 well sterile tissue culture platesVWR100062-892culturing HEK cells
Calcium ChlorideSigma223506-500GCalcium phosphate transfection, HEK cell resuspension
Centrifuge- Sorvall Legend RTKendro Laboratory Products75004377Harvesting HEK cells
CO2 cell incubatorThermo ScientificHERACELL 150iIncubation of HEK cells during growth
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvateCorning10-013-CVHEK cell maintenance
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)Gibco14190-144Passaging/harvesting HEK cell
Ethylenediaminetetraacetic acidSigmaED-500GHarvesting HEK cells
Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth areaCorning9381M26Culturing HEK cells
Fetal Bovine SerumSigma17L184HEK cell maintenance
HEK293T cellsATCCModel system
ImageJNIHV: 2.0.0-rc-69/1.52pImage analysis
Magnesium Chloride hexahydrateSigmaM9272-500GHEK cell resuspension
Sodium phosphate dibasic anhydrousFisher BioReagentsBP332-500Calcium phosphate transfection
Trypsin 0.25% (1X) SolutionGE Healthcare Life SciencesSH30042.01Passaging HEK cells
Tube rotatorIncubation of mixed population of HEK cells
UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive ChargedDenville Scientific Inc.M1021Image acquisition
Wide-field microscopeZeissAxio Vert 200MImage acquisition

Riferimenti

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