Medición del edema cerebral post-accidente cerebrovascular, zona infarta y descomposición de la barrera hematoencefálica en un solo conjunto de muestras cerebrales de roedores

Resumen

Este protocolo describe una novedosa técnica de medir los tres parámetros más importantes de la lesión cerebral isquémica en el mismo conjunto de muestras cerebrales de roedores. El uso de una sola muestra cerebral es altamente ventajoso en términos de costos éticos y económicos.

Resumen

Una de las causas más comunes de morbilidad y mortalidad en todo el mundo es el accidente cerebrovascular isquémico. Históricamente, un modelo animal utilizado para estimular el accidente cerebrovascular isquémico implica oclusión arterial cerebral media (MCAO). La zona infarta, el edema cerebral y la descomposición de la barrera hematoencefálica (BBB) se miden como parámetros que reflejan el alcance de la lesión cerebral después del MCAO. Una limitación significativa a este método es que estas mediciones se obtienen normalmente en diferentes muestras de cerebro de rata, lo que conduce a cargas éticas y financieras debido al gran número de ratas que necesitan ser eutanasiadas para un tamaño de muestra adecuado. Aquí presentamos un método para evaluar con precisión las lesiones cerebrales después de MCAO midiendo la zona infarta, el edema cerebral y la permeabilidad bbb en el mismo conjunto de cerebros de ratas. Esta novedosa técnica proporciona una manera más eficiente de evaluar la fisiopatología del accidente cerebrovascular.

Introducción

Una de las causas más comunes de morbilidad y mortalidad en todo el mundo es el accidente cerebrovascular. A nivel mundial, el accidente cerebrovascular isquémico representa el 68% de todos los casos de accidente cerebrovascular, mientras que en los Estados Unidos el accidente cerebrovascular isquémico representa el 87% de los casos de accidente cerebrovascular^1,2. Se estima que la carga económica del ictus alcanza los 34.000 millones de dólares en los Estados Unidos^2.000 millones de dólares y los 45.000 millones de euros en la Unión Europea^3. Los modelos animales de ictus son necesarios para estudiar su fisiopatología, desarrollar nuevos métodos de evaluación y proponer nuevas opciones terapéuticas^4.

El accidente cerebrovascular isquémico ocurre con oclusión de una arteria cerebral importante, generalmente la arteria cerebral media o una de sus ramas^5. Así, los modelos de accidente cerebrovascular isquémico han implicado históricamente oclusión arterial cerebral media (MCAO)^{6,7,8,9,10,11,12.} Después de MCAO, las lesiones neurológicas se evalúan con mayor frecuencia midiendo la zona infarta (IZ) utilizando un método de tinción de cloruro de 2,3,5 tripfeniltrazolium (TTC)^13,edema cerebral (BE) usando^{14, 15,16,}y la permeabilidad de la barrera hemisférica de la barrera hemisférica de la sangre (BBB) mediante una técnica de espectrometría utilizando las manchas azules evans^17,18,19.

El método tradicional MCAO utiliza conjuntos separados de cerebros para cada una de las tres mediciones cerebrales. Para un gran tamaño de muestra, esto resulta en un número significativo de animales eutanasiados, con consideraciones éticas y financieras añadidas. Un método alternativo para aliviar estos costos implicaría mediciones de los tres parámetros en un solo conjunto de cerebros de roedores post-MCAO.

Se han realizado intentos anteriores para medir combinaciones de parámetros en la misma muestra cerebral. Se han descrito métodos de tinción inmunofluorescentes simultáneas^20, así como otros análisis moleculares y bioquímicos²¹ después de la tinción de TTC en la misma muestra cerebral. Hemos calculado previamente los volúmenes del hemisferio cerebral para evaluar el edema cerebral y hemos realizado manchas de TTC para calcular la zona infarta en el mismo cerebro establecido¹⁵.

En el protocolo actual, presentamos una técnica de MCAO modificada que mide la lesión cerebral isquémica a través de la determinación de la permeabilidad iz, BE y BBB en el mismo conjunto de cerebros de roedores. Iz se mide mediante tinción TTC, BE se determina calculando el volumen hemisférico, y la permeabilidad BBB se obtiene mediante métodos de espectrometría¹⁹. En este protocolo, utilizamos un modelo MCAO modificado, basado en la inserción directa y fijación del catéter monofilamento en la arteria carótida interna (ICA) y el bloqueo adicional del flujo sanguíneo a la arteria cerebral media (MCA)^22. Este método modificado muestra una disminución de la tasa de mortalidad y morbilidad en comparación con el método tradicional MCAO^16,22.

Este nuevo enfoque proporciona un modelo financieramente sólido y ético para medir lesiones neurológicas después de MCAO. Esta evaluación de los principales parámetros de la lesión cerebral isquémica ayudará a investigar exhaustivamente su fisiopatología.

Protocolo

Los siguientes procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Declaración de Helsinki y Tokio y las Directrices para el uso de animales experimentales de la Comunidad Europea. Los experimentos también fueron aprobados por el Comité de Cuidado animal de la Universidad Ben-Gurion del Negev.

1. Preparación de ratas para el procedimiento experimental

1. Seleccione ratas macho sprague-dawley adultas sin patología excesiva, cada una con un peso de entre 300 y 350 g.
2. Mantenga todas las ratas a temperatura ambiente a 22 °C, con 12 horas de ciclos claros y oscuros antes del experimento.
3. Asegúrese de que los alimentos y el agua estén disponibles ad libitum.
4. Realice todos los procedimientos entre las 6:00 a.m. y las 2:00 p.m.

2. Preparación de ratas para cirugía

1. Anestesiar las ratas durante 30 min con isoflurano (4% para inducción y 2% para mantenimiento) y 24% oxígeno (1,5 L/min).
   1. Pruebe el nivel de anestesia en las ratas asegurándose de que no tengan un reflejo de abstinencia del pedal.
2. Inserte el catéter del calibre 24 en la vena de la cola.
   NOTA: El calentamiento de la cola para vasodilatación no se realiza.
   1. Coloque las ratas sobre la mesa en posición supina. Utilice cinta médica para colocar las cuatro extremidades de las ratas.
3. Coloque la sonda para medir la temperatura en el recto de la rata antes de la cirugía.
4. Durante el procedimiento, mantenga una placa de calentamiento para soportar una temperatura corporal del núcleo de 37 °C.
5. Agregue ungüento en ambos ojos de la rata para protegerse.
6. Afeitar el área quirúrgica y desinfectar con tres aplicaciones de 10% povidone-yodo seguido de 70% alcohol isopropílico.

3. Oclusión de la arteria cerebral media derecha

NOTA: MCAO se realiza mediante una técnica modificada, como se describió anteriormente^16,22,23, con el uso de instrumentos descritos por McGarry et al.²⁴ y Uluç et al.²⁵.

1. Disecciona la piel y la fascia superficial en la línea media ventral del cuello con pinzas quirúrgicas y tijeras con cuchillas curvas.
2. Identificar el triángulo muscular, formado por el ICA, la arteria carótida externa (ECA) y la arteria carótida común (CCA).
3. Separe cuidadosamente el CCA y el ICA correctos del nervio vago con microaplicaps para la cirugía vascular.
4. Exponga el CCA y el ICA correctos. Bloquee el flujo sanguíneo que proviene de la CCA al ICA utilizando micro-clips o torniquetes especiales para cirugía vascular. Haga una incisión (aproximadamente 1 mm) en el ICA usando microscisores para cirugía vascular.
5. Inserte un catéter monofilamento (nylon 4-0) directamente a través del ICA, aproximadamente 18,5-19 mm desde el punto de bifurcación de la CCA derecha en el círculo de Willis hasta alcanzar una resistencia leve, para ocultar el MCA^26.
6. Ligar alrededor del ICA por encima de la bifurcación de CCA.
7. Para el grupo de control operado por sham, realice una inserción de hilo de nylon en lugar de los pasos 3.5 y 3.6^16,22.
8. Administrar 5 ml de cloruro de sodio al 0,9% mediante inyección intraperitoneal.
9. Cierre la herida por sutura y lleve a la rata a un área de recuperación.
   NOTA: Unos minutos después del final de la anestesia, la rata se despertará y se moverá independientemente alrededor de la jaula.
10. A las 23 h después de MCAO, inyectar 2% Evans azul en solución salina (4 mL/kg)^23,26 en la vena trasera para ambos grupos operados a través de una cánula^27.
    NOTA: Esto se utiliza como un trazador de permeabilidad cerebro-sangre. Dejar circular durante 60 minutos.

4. Determinación de la zona infarta

1. Medir IZ a las 24 h después de MCAO como se describió anteriormente^{9,15,18,19,26}.
   NOTA: Las ratas que perdieron más del 20% de su peso o desarrollaron convulsiones o hemiplejia están excluidas del experimento.
2. Eutanasia a la rata reemplazando la mezcla de gas inspirada por un 20% de oxígeno y un 80% de dióxido de carbono hasta que la rata deje de respirar espontáneamente.
3. Abra el pecho con una incisión lateral de 5-6 cm a través de la pared abdominal debajo de la caja torácica con tijeras y fórceps quirúrgicos.
4. Realice una incisión diafragmática a lo largo de toda la longitud de la caja torácica con tijeras y fórceps quirúrgicos.
5. Desplazar cuidadosamente los pulmones, cortar a través de la caja torácica hasta la clavícula en los lados derecho e izquierdo^28.
6. Perfuso con 200 ml de solución salina normal a través del ventrículo izquierdo del corazón.
7. Pinchazo o incienso el atrio derecho del corazón con tijeras.
8. Realiza la decapitación usando una guillotina y recoge tejido cerebral.
9. Usando tijeras de iris, corta desde el antenombre hasta el borde distal de la superficie posterior del cráneo en ambos lados.
10. Separa las bombillas olfativas, las conexiones nerviosas a lo largo de la superficie ventral y la superficie dorsal del cráneo del cerebro.
11. Extraiga el cerebro de la cabeza.
12. Produzca 6 rebanadas cerebrales creando secciones horizontales de 2 mm de espesor con una hoja de afeitar de .009", sin recubrimiento y de un solo borde.
13. Incubar durante 30 min a 37 °C en 0.05% TTC.
14. Coloque el tejido cerebral en las diapositivas del microscopio y realice la exploración óptica de estas 6 rebanadas cerebrales con una resolución de 1600x1600 dpi (ver Suplemento 1 por ejemplo).
15. Añada un filtro azul con un editor de fotos (por ejemplo, Adobe Photoshop CS2) utilizando la función Mezclador de canales(Imagen > Ajustes > Mezclador de canales)y guarde la imagen como formato de archivo JPEG.
    NOTA: Después de aplicar el filtro azul, la imagen aparecerá en escala de grises.
16. Abra la imagen guardada en ImageJ 1.37v^29,30.
    NOTA: Este programa informático utiliza una función de umbral para aislar y calcular los píxeles que son en blanco o negro (consulte la figura 1).
17. Para cada uno de los 6 sectores cerebrales de la imagen, seleccione y guarde cada hemisferio (ipsilateral lesionado derecho e contralateral izquierdo sin lesiones) como un archivo de imagen independiente utilizando la herramienta "selección de polígonos" del menú principal.
18. Establezca el límite para determinar IZ mediante una función de umbral automático en el menú principal del software ImageJ seleccionando Imagen > Ajustar > Umbraly mida el número de píxeles en cada hemisferio de un solo conjunto cerebral.
    NOTA: Las macros se pueden utilizar para este paso en el software ImageJ (consulte suplemento 2 para el código). El corte es un parámetro crítico para determinar qué píxeles convertir al blanco y qué convertir al negro dependiendo del tono de gris (consulte Suplemento 3 y Suplemento 4 como ejemplos). A continuación, ImageJ compara píxeles blancos y negros para determinar IZ. Basándonos en el protocolo de tinción y la configuración del escáner, usamos un valor de corte constante de 0,220.
19. Realizar la medición de la corrección de IZ para la hinchazón del tejido utilizando las relaciones de los hemisferios cerebrales ipsilaterales y contralaterales (RICH) método^13,23 (ver ejemplo en suplemento 5).
    
    NOTA: El tamaño infarto se evalúa como un porcentaje del hemisferio contralateral.

5. Determinación del edema cerebral³¹

NOTA: Utilice ImageJ 1.37v para la medición de BE^32,33.

1. Mida BE 24 h después de MCAO. Para el cálculo de BE, utilice los datos del volumen del hemisferio izquierdo y derecho (en unidades).
2. Realice el escaneo óptico con una resolución de 1600x1600 ppp (consulte suplemento 1, por ejemplo).
3. Seleccione los hemisferios cerebrales y establezca el corte para determinar BE con ImageJ 1.37v, como se describió anteriormente en las secciones 4.17-4.19.
4. Exprese el área BE como porcentaje de las áreas estándar del hemisferio contralateral no afectado, calculada por el método RICH utilizando la siguiente ecuación (véase el ejemplo en Suplemento 5)^23,34.
   
   NOTA: La extensión de BE se evalúa como un porcentaje del hemisferio contralateral.

6. Determinación de la interrupción del BBB

1. Mida la interrupción de BBB 24 h después de MCAO.
2. Divida los hemisferios derecho e izquierdo en seis rebanadas y coloque cada uno en un tubo de microcentrífuga.
3. Homogeneizar cada rebanada del tejido cerebral en ácido tricloroacético, basado en el cálculo de 1 g de tejido cerebral en 4 ml de ácido tricloroacético al 50%.
4. Centrífuga a 10.000 x g durante 20 min.
5. Diluir líquido sobrenadante 1:3 con 96% etanol.
6. Realice espectrofotometría de luminiscencia utilizando software de espectrofotometría, instalando la placa y realizando una lectura de muestra utilizando los siguientes parámetros: Longitud de onda de excitación de intensidad de fluorescencia de 620 nm (ancho de banda 10 nm) y una longitud de onda de emisión de 680 nm (ancho de banda 10 nm)^23,35 ; Mod superior; Número Carne 25; Manual 100; Agitar 1 s, 1 mm.
   NOTA: Utilice una longitud de onda de excitación de 620 nm (ancho de banda 10 nm) y una longitud de onda de emisión de 680 nm (ancho de banda 10 nm). ^23,35

Resultados

Medición de zona infarto

Una prueba t de muestra independiente indicó que 19 ratas que se sometieron a MCAO permanente demostraron un aumento significativo en el volumen de infartos cerebrales en comparación con las 16 ratas operadas por sham (MCAO=7.49% ± 3.57 contra. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (véase la Figura 2A)). Los datos se expresan como un porcentaje medio del hemisferio contralateral ± SD.

<...

Discusión

El objetivo principal del presente protocolo era demostrar mediciones consistentes de tres parámetros principales de lesión isquémica: IZ, BE y BBB permeabilidad. Estudios previos en este campo han demostrado la posibilidad de realizar uno o dos de estos parámetros juntos en la misma muestra. Además de la reducción de costes que ofrece este método de tres partes, también proporciona un modelo bioético más deseable que limita el número de animales que deben ser operados y posteriormente eutanasiados. Al igual q...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Syringe	Braun	4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	Sigma-Aldrich	500 cc	Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe	Braun	305620
3-0 Silk sutures	Henry Schein	1007842
4-0 Nylon suture	4-00
Brain & Tissue Matrices	Sigma-Aldrich	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P	Sigma-Aldrich	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	Sigma-Aldrich	HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale	Sigma-Aldrich	Rs 4,000
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Eppendorf pipette	Sigma-Aldrich	Z683884
Eppendorf tube	Sigma-Aldrich	EP0030119460
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	Model: Infinite 200 PRO multimode reader	Optional.
Fluorescence detector	Molecular Devices LLC	VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument	Optional.
Gauze sponges	Fisher	22-362-178
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips	Sigma-Aldrich
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Infusion cuff	ABN	IC-500
Micro forceps	Sigma-Aldrich
Micro scissors	Sigma-Aldrich
Multiset	Teva Medical	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating forceps	Sigma-Aldrich
Operating scissors	Sigma-Aldrich
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F	Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5606
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11	Sigma-Aldrich	S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows	Adobe
ImageJ 1.37v	NIH		The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
SPSS Statistics 22	IBM
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Windows 10	Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	298-96-4
50% trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9
Ethanol 96 %	Romical		Flammable liquid
Evans blue 2%	Sigma-Aldrich	314-13-6
Isoflurane, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017