Misurazione dell'edema cerebrale post-ictus, della zona infarct e della rottura della barriera ematica-encefalica in un singolo set di campioni cerebrali dei roditori

Riepilogo

Questo protocollo descrive una nuova tecnica di misurazione dei tre parametri più importanti della lesione cerebrale ischemica sullo stesso set di campioni cerebrali di roditori. L'uso di un solo campione cerebrale è altamente vantaggioso in termini di costi etici ed economici.

Abstract

Una delle cause più comuni di morbilità e mortalità in tutto il mondo è l'ictus ischemico. Storicamente, un modello animale utilizzato per stimolare l'ictus ischemico coinvolge l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO). Zona infarct, edema cerebrale e rottura della barriera ematico-encefalica (BBB) sono misurati come parametri che riflettono l'entità della lesione cerebrale dopo MCAO. Una limitazione significativa a questo metodo è che queste misurazioni sono normalmente ottenute in diversi campioni di cervello di ratto, portando a oneri etici e finanziari dovuti al gran numero di ratti che devono essere eutanasiati per una dimensione del campione appropriata. Qui presentiamo un metodo per valutare con precisione le lesioni cerebrali dopo MCAO misurando la zona infarct, l'edema cerebrale e la permeabilità BBB nello stesso set di cervelli di ratto. Questa nuova tecnica fornisce un modo più efficiente per valutare la fisiopatologia dell'ictus.

Introduzione

Una delle cause più comuni di morbilità e mortalità in tutto il mondo è l'ictus. A livello globale, l'ictus ischemico rappresenta il 68% di tutti i casi di ictus, mentre negli Stati Uniti l'ictus ischemico rappresenta l'87% dei casi^{di ictus 1,2}. Si stima che l'onere economico dell'ictus raggiunga i 34 miliardi di dollari negli Stati^{Uniti 2} e 45 miliardi di euro nell'Unione europea³. I modelli animali di ictus sono necessari per studiarne la fisiopatologia, sviluppare nuovi metodi di valutazione e proporre nuove opzioni terapeutiche⁴.

L'ictus ischemico si verifica con occlusione di una grande arteria cerebrale, di solito l'arteria cerebrale centrale o uno dei suoi rami⁵. Così, i modelli di ictus ischemico hanno storicamente coinvolto l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO)^{6,7,8,9,10,11,12}. Dopo MCAO, lesione neurologica è più comunemente valutata misurando la zona infar bene (IZ) utilizzando un metodo di colorazione 2,3,5-tripfeniltetrazolo (TTC)¹³, edema cerebrale (BE) utilizzando essiccazione o calcolo dei volumi emisferici^14,15,16e permeabilità alla barriera epatica (BBB) con una tecnica di spettrometria che utilizza la colorazione blu Evans^17,18,19.

Il tradizionale metodo MCAO utilizza insiemi separati di cervelli per ciascuna delle tre misurazioni cerebrali. Per un campione di grandi dimensioni, ciò si traduce in un numero significativo di animali eutanasiati, con considerazioni etiche e finanziarie aggiuntive. Un metodo alternativo per alleviare questi costi comporterebbe misurazioni di tutti e tre i parametri in un unico insieme di cervelli di roditori post-MCAO.

Precedenti tentativi sono stati fatti per misurare combinazioni di parametri nello stesso campione cerebrale. Metodi simultanei di colorazione immunofluorescente²⁰ e altre analisi molecolari e^{biochimiche 21 sono} stati descritti dopo la colorazione TTC nello stesso campione cerebrale. In precedenza abbiamo calcolato i volumi dell'emisfero cerebrale per valutare l'edema cerebrale ed eseguito la colorazione TTC per calcolare la zona infarct nello stesso set cerebrale¹⁵.

Nel presente protocollo, presentiamo una tecnica MCAO modificata che misura le lesioni cerebrali ischemiche attraverso la determinazione della permeabilità IZ, BE e BBB nello stesso set di cervelli di roditori. IZ è misurato dalla colorazione TTC, BE è determinato calcolando il volume emisferico e la permeabilità BBB è ottenuta con metodi di spettrometria¹⁹. In questo protocollo, abbiamo utilizzato un modello MCAO modificato, basato sull'inserimento diretto e la fissazione del catetere monofilamento nell'arteria carotide interna (ICA) e sull'ulteriore blocco del flusso sanguigno verso l'arteria cerebrale media (MCA)²². Questo metodo modificato mostra una diminuzione del tasso di mortalità e morbilità rispetto al metodo tradizionale MCAO^16,22.

Questo nuovo approccio fornisce un modello finanziario ed etico per misurare le lesioni neurologiche dopo l'MCAO. Questa valutazione dei principali parametri della lesione cerebrale ischemica aiuterà a indagare in modo completo la sua fisiopatologia.

Protocollo

Secondo le raccomandazioni della dichiarazione di Helsinki e di Tokyo e degli orientamenti per l'impiego di animali da esperimento della Comunità europea, sono state condotte le seguenti procedure. Gli esperimenti sono stati approvati anche dal Comitato per la cura degli animali dell'Università Ben-Gurion del Negev.

1. Preparazione dei ratti alla procedura sperimentale

1. Selezionare ratti maschi adulti Sprague-Dawley senza patologia troppo grave, ognuno del peso compreso tra 300 e 350 g.
2. Mantenere tutti i ratti a temperatura ambiente a 22 °C, con 12 ore di cicli di luce e buio prima dell'esperimento.
3. Assicurarsi che cibo e acqua siano disponibili ad libitum.
4. Eseguire tutte le procedure tra le 6:00 .m e le 14:00.m.

2. Preparare i ratti per l'intervento chirurgico

1. Anestetizzare i ratti per 30 min con isoflurane (4% per l'induzione e 2% per la manutenzione) e 24% ossigeno (1,5 L/min).
   1. Testare il livello di anestesia nei ratti assicurandosi che non abbiano un riflesso di prelievo del pedale.
2. Inserire il catetere calibro 24 nella vena di coda.
   NOTA: Il riscaldamento della coda per la vasodilatazione non viene eseguito.
   1. Posizionare i ratti sul tavolo in posizione supina. Usa il nastro medico per apporre tutti e quattro gli arti dei topi.
3. Posizionare la sonda per la misurazione della temperatura nel retto del ratto prima dell'intervento chirurgico.
4. Durante la procedura, mantenere una piastra di riscaldamento per sostenere una temperatura corporea interna di 37 °C.
5. Aggiungere un unguento in entrambi gli occhi del topo per la protezione.
6. Radere l'area chirurgica e disinfettare con tre applicazioni del 10% di povidone-iodio seguito dal 70% di alcol isopropile.

3. Occlusione dell'arteria cerebrale centrale laterale destra

NOTA: MCAO è eseguito con una tecnica modificata, come^{precedentemente descritto 16,22,23}, con l'uso di strumenti descritti da McGarry et^al.

1. Sezionare la pelle e la fascia superficiale alla linea mediana ventrale del collo con pinzette chirurgiche e forbici con lame curve.
2. Identificare il triangolo muscolare, costituito dall'ICA, dall'arteria carotide esterna (ECA) e dall'arteria carotide comune (CCA).
3. Separare accuratamente il CCA e l'ICA giusti dal nervo vascolare con microforza per la chirurgia vascolare.
4. Esponi il CCA giusto e l'ICA. Bloccare il flusso sanguigno proveniente dal CCA all'ICA utilizzando micro-clip o speciali laccio emostatici per la chirurgia vascolare. Effettuare un'incisione (circa 1 mm) sull'ICA utilizzando microscissori per la chirurgia vascolare.
5. Inserire un catetere monofilamento (4-0 nylon) direttamente attraverso l'ICA, a circa 18,5-19 mm dal punto di biforcazione del CCA destro nel cerchio di Willis fino a raggiungere una lieve resistenza, per occludere l'MCA^26.
6. Ligate intorno all'ICA sopra la biforcazione del CCA.
7. Per il gruppo di controllo gestito da sham, eseguire un inserimento di filo di nylon invece dei passaggi 3.5 e 3.6^16,22.
8. Somministrare 5 mL di cloruro di sodio 0,9% per iniezione intraperitoneale.
9. Chiudere la ferita per sutura e portare il topo in un'area di recupero.
   NOTA: Pochi minuti dopo la fine dell'anestesia, il topo si sveglierà e si muoverà in modo indipendente intorno alla gabbia.
10. A 23 ore dopo MCAO, iniettare il 2% di Evans blu in soluzione salina (4 mL/kg)^23,26 nella vena di coda per entrambi i gruppi azionati tramite una cannula²⁷.
    NOTA: Questo è usato come tracciante permeabilità sangue-cervello. Lasciare circolare per 60 minuti.

4. Determinazione della zona infaritta

1. Misurare IZ a 24 ore dopo MCAO come descritto in^{precedenza 9,15,18,19,26}.
   NOTA: I ratti che hanno perso più del 20% del loro peso o sviluppato convulsioni o emiplegia sono esclusi dall'esperimento.
2. Eutanasia del ratto sostituendo la miscela di gas ispirata con il 20% di ossigeno e l'80% di anidride carbonica fino a quando il topo non smette di respirare spontaneamente.
3. Aprire il torace con un'incisione laterale di 5-6 cm attraverso la parete addominale sotto la gabbia toracica usando forbici e forcep chirurgiche.
4. Eseguire un'incisione diaframmatica lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica con forbici e forceli chirurgici.
5. Spostare con cura i polmoni, tagliare attraverso la gabbia toracica fino alla clavicola sui lati destro e sinistro²⁸.
6. Perfondere con 200 mL di soluzione salina normale attraverso il ventricolo sinistro del cuore.
7. Forare o incidere l'atrio destro del cuore con le forbici.
8. Eseguire la decapitazione usando una ghigliottina e raccogliere il tessuto cerebrale.
9. Usando le forbici dell'iride, tagliate dal forame magnum al bordo distale della superficie posteriore del cranio su entrambi i lati.
10. Separare i bulbi olfattivi, le connessioni nervose lungo la superficie ventrale e la superficie dorsale del cranio dal cervello.
11. Rimuovi il cervello dalla testa.
12. Produci 6 fette cerebrali creando sezioni orizzontali spesse 2 mm con una lama in acciaio inossidabile .009", non patinato e a bordo singolo.
13. Incubare per 30 min a 37 °C nello 0,05% di TTC.
14. Posizionare il tessuto cerebrale sulle diapositive del microscopio ed eseguire la scansione ottica di queste 6 fette cerebrali con una risoluzione di 1600x1600 dpi (vedi supplemento 1 per esempio).
15. Aggiungete un filtro blu con un editor di foto (ad esempio Adobe Photoshop CS2) utilizzando la funzione Mixer canale (Image > Adjustments > Channel Mixer) e salvate l'immagine come formato di file JPEG.
    NOTA: dopo aver applicato il filtro blu, l'immagine apparirà in scala di grigi.
16. Aprire l'immagine salvata in ImageJ 1.37v^29,30.
    NOTA: questo programma per computer utilizza una funzione di soglia per isolare e calcolare i pixel in bianco o nero (vedere figura 1).
17. Per ciascuna delle 6 fette cerebrali dell'immagine, selezionare e salvare ogni emisfero (ipsilaterale ferito a destra e contralaterale sinistro illeso) come file di immagine separato utilizzando lo strumento "selezione poligonale" dal menu principale.
18. Impostare il cut-off per determinare IZ utilizzando una funzione di soglia automatica dal menu principale del software ImageJ selezionando Immagine > Regola > Sogliae misurare il numero di pixel in ogni emisfero di un singolo insieme cerebrale.
    NOTA: le macro possono essere utilizzate per questo passaggio nel software ImageJ (vedere il Supplemento 2 per il codice). Il cut off è un parametro critico per determinare quali pixel convertire in bianco e quali convertire in nero a seconda della tonalità di grigio (vedi Supplemento 3 e Supplemento 4 come esempi). ImageJ confronta quindi i pixel bianchi e neri per determinare IZ. In base al protocollo di colorazione e alle impostazioni dello scanner, abbiamo utilizzato un valore di cut-off costante di 0,220.
19. Eseguire la misurazione della correzione IZ per il gonfiore dei tessuti utilizzando il metodo RICH (Ratios of Ipsilateral and Contralateral Cerebral Hemispheres)^13,23 (vedere esempio nel Supplemento 5).
    
    NOTA: La dimensione infarct è valutata come percentuale dell'emisfero contralaterale.

5. Determinazione dell'edema cerebrale³¹

NOTA: Utilizzare ImageJ 1.37v per la misurazione di BE^32,33.

1. Misurare BE 24 ore dopo MCAO. Per il calcolo di BE, utilizzare i dati del volume dell'emisfero sinistro e destro (in unità).
2. Eseguire la scansione ottica con una risoluzione di 1600x1600 dpi (vedere ad esempio il Supplemento 1).
3. Selezionare gli emisferi cerebrali e impostare il cut-off per determinare BE con ImageJ 1.37v, come descritto sopra nelle sezioni 4.17-4.19.
4. Esprimere l'area BE come percentuale delle aree standard dell'emisfero contralaterale non influenzato, calcolata con il metodo RICH utilizzando l'equazione seguente (vedere l'esempio nel Supplemento 5)^23,34.
   
   NOTA: L'estensione di BE è valutata come percentuale dell'emisfero contralaterale.

6. Determinazione dell'interruzione della BBB

1. Misurare l'interruzione della BBB 24 ore dopo MCAO.
2. Dividere gli emisferi destro e sinistro in sei fette e metterli in un tubo di microcentrifugo.
3. Omogeneizzare ogni fetta del tessuto cerebrale in acido tricloroacetico, sulla base del calcolo di 1 g di tessuto cerebrale in 4 mL di acido tricloroacetico al 50%.
4. Centrifuga a 10.000 x g per 20 min.
5. Diluire il liquido supernatante 1:3 con il 96% di etanolo.
6. Eseguire la spettrofotometria a luminescenza utilizzando il software di spettrofotometria, installando la piastra ed eseguendo una lettura del campione utilizzando i seguenti parametri: lunghezza d'onda di eccitazione dell'intensità di fluorescenza di 620 nm (larghezza di banda 10 nm) e lunghezza d'onda di emissione di 680 nm (larghezza di banda 10 nm)^23,35 ; Mod top; Numero Carne 25; Manuale 100; Tremante 1 sec, 1 mm.
   NOTA: utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 620 nm (larghezza di banda 10 nm) e una lunghezza d'onda di emissione di 680 nm (larghezza di banda 10 nm). ^{23di35 anni}

Risultati

Misurazione della zona infarto

Un test t a campione indipendente ha indicato che 19 ratti sottoposti a MCAO permanente hanno dimostrato un aumento significativo del volume di infarto cerebrale rispetto ai 16 ratti sottoposti a sham (MCAO =7,49% ± 3,57 vs. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (cfr. figura 2A)). I dati sono espressi come percentuale media dell'emisfero ± SD.

Misurazio...

Discussione

L'obiettivo principale del presente protocollo era quello di dimostrare misurazioni coerenti di tre parametri principali della lesione ischemica: permeabilità IZ, BE e BBB. Studi precedenti in questo campo hanno dimostrato la possibilità di eseguire uno o due di questi parametri insieme nello stesso campione. Oltre alla riduzione dei costi offerta da questo metodo in tre parti, fornisce anche un modello bioetico più desiderabile che limita il numero di animali che devono essere utilizzati e successivamente eutanasiati...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Syringe	Braun	4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	Sigma-Aldrich	500 cc	Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe	Braun	305620
3-0 Silk sutures	Henry Schein	1007842
4-0 Nylon suture	4-00
Brain & Tissue Matrices	Sigma-Aldrich	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P	Sigma-Aldrich	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	Sigma-Aldrich	HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale	Sigma-Aldrich	Rs 4,000
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Eppendorf pipette	Sigma-Aldrich	Z683884
Eppendorf tube	Sigma-Aldrich	EP0030119460
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	Model: Infinite 200 PRO multimode reader	Optional.
Fluorescence detector	Molecular Devices LLC	VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument	Optional.
Gauze sponges	Fisher	22-362-178
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips	Sigma-Aldrich
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Infusion cuff	ABN	IC-500
Micro forceps	Sigma-Aldrich
Micro scissors	Sigma-Aldrich
Multiset	Teva Medical	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating forceps	Sigma-Aldrich
Operating scissors	Sigma-Aldrich
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F	Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5606
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11	Sigma-Aldrich	S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows	Adobe
ImageJ 1.37v	NIH		The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
SPSS Statistics 22	IBM
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Windows 10	Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	298-96-4
50% trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9
Ethanol 96 %	Romical		Flammable liquid
Evans blue 2%	Sigma-Aldrich	314-13-6
Isoflurane, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017