Tek Bir Kemirgen Beyin Örneklerinde İnme Sonrası Serebral Ödem, Enfarktüs Bölgesi ve Kan-Beyin Bariyeri Kırılımının Ölçülmesi

Özet

Bu protokol, aynı kemirgen beyin örnekleri kümesinde iskemik beyin hasarının en önemli üç parametresini ölçmenin yeni bir tekniğini açıklar. Sadece bir beyin örneği kullanmak etik ve ekonomik maliyetler açısından oldukça avantajlıdır.

Özet

Dünya genelinde morbidite ve mortalitenin en sık nedenlerinden biri iskemik inmedir. Tarihsel olarak, iskemik inmeyi uyarmak için kullanılan bir hayvan modeli orta serebral arter tıkanıklığını (MCAO) içerir. Enfarktüs bölgesi, beyin ödemi ve kan-beyin bariyeri (BBB) bozulması MCAO sonrası beyin hasarının boyutunu yansıtan parametreler olarak ölçülür. Bu yöntemin önemli bir sınırlaması, bu ölçümlerin normalde farklı sıçan beyin örneklerinde elde edilmesi ve uygun bir örnek boyutu için ötenazi yapılması gereken çok sayıda sıçan nedeniyle etik ve finansal yüklere yol açtır. Burada, aynı sıçan beyin kümesinde enfarktüs bölgesini, beyin ödemini ve BBB geçirgenliğini ölçerek MCAO'yu takiben beyin hasarının doğru bir şekilde değerlendirilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu yeni teknik, inmenin patofizyolojisini değerlendirmek için daha verimli bir yol sağlar.

Giriş

Dünya genelinde morbidite ve mortalitenin en sık nedenlerinden biri inmedir. Küresel olarak, iskemik inme tüm inme vakalarının% 68'ini temsil ederken, Amerika Birleşik Devletleri'nde iskemik inme, inme vakalarının% 87'sini oluşturur^1,2. İnmenin ekonomik yükünün Amerika Birleşik Devletleri'nde² ve Avrupa Birliği'nde 45 milyar Euro'ya ulaştığı tahmin edilmektedir³. İnmenin hayvan modelleri patofizyolojisini incelemek, değerlendirme için yeni yöntemler geliştirmek ve yeni terapötik seçenekler önermek için gereklidir⁴.

İskemik inme, genellikle orta serebral arter veya dallarından biri olan majör bir serebral arterin tıkanması ile ortaya çıkar⁵. Bu nedenle, iskemik inme modelleri tarihsel olarak orta serebral arter tıkanıklığını (MCAO)⁶, 7^,8,9,10,^11,12'yikapsamıştır. MCAO'yu takip ederek, nörolojik yaralanma en sık 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) boyama yöntemi¹³, beyin ödemi (BE) kullanılarak enfarktüs bölgesi (IZ) ölçülerek değerlendirilir. ) Evans mavi boyama^{17 , 18,19}kullanarak bir spektrometre tekniği ile kurutma veya hesaplama hemisferik hacimleri 14 , 15^,16vekan beyin bariyeri (BBB) geçirgenliği kullanarak.

Geleneksel MCAO yöntemi, üç beyin ölçümünün her biri için ayrı beyin kümeleri kullanır. Büyük bir örneklem boyutu için, bu, ek etik ve finansal hususlarla birlikte önemli sayıda ötenaziye tabi hayvanla sonuçlanır. Bu maliyetleri hafifletmek için alternatif bir yöntem, MCAO sonrası kemirgen beyinlerinin tek bir kümesindeki üç parametrenin de ölçümünü içerecektir.

Aynı beyin örneğindeki parametrelerin kombinasyonlarını ölçmek için önceki girişimler yapılmıştır. Aynı beyin örneğinde TTC lekelemeden sonra eşzamanlı immünoresan boyama yöntemleri²⁰ ve diğer moleküler ve biyokimyasal analizler²¹ tanımlanmıştır. Daha önce beyin ödemini değerlendirmek için beyin yarımküre hacimlerini hesapladık ve aynı beyin setinde enfarktüs bölgesini hesaplamak için TTC boyama yaptık¹⁵.

Mevcut protokolde, aynı kemirgen beyin kümesinde IZ, BE ve BBB geçirgenliğini belirleyerek iskemik beyin hasarını ölçen değiştirilmiş bir MCAO tekniği sunuyoruz. IZ TTC boyama ile ölçülür, BE yarım küre hacmi hesaplanarak belirlenir ve BBB geçirgenliği spektrometre yöntemleri ile elde edilir¹⁹. Bu protokolde, monofilament kateterin iç karotid artere (ICA) doğrudan yerleştirilmesine ve sabitlenmesine ve orta serebral artere (MCA) kan akışının daha fazla engellenmesine dayanan modifiye bir MCAO modeli kullandık²². Bu değiştirilmiş yöntem, geleneksel MCAO yöntemi^16,22'yekıyasla ölüm ve morbidite oranının azaldığını göstermektedir.

Bu yeni yaklaşım, MCAO'dan sonra nörolojik hasarı ölçmek için finansal açıdan sağlam ve etik bir model sunmaktadır. İskemik beyin hasarının ana parametrelerinin bu değerlendirmesi, patofizyolojisinin kapsamlı bir şekilde araştırılmasına yardımcı olacaktır.

Protokol

Aşağıdaki prosedürler Helsinki ve Tokyo Bildirgesi'nin önerilerine ve Avrupa Topluluğu Deney Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Yönergelere göre gerçek yapılmıştır. Deneyler, Negev Ben-Gurion Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından da onaylandı.

1. Sıçanların deneysel prosedüre hazırlanması

1. Her biri 300 ila 350 g ağırlığında, açık patolojisi olmayan yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanlarını seçin.
2. Deneyden önce 12 saatlik açık ve karanlık döngülerle tüm sıçanları oda sıcaklığında 22 °C'de koruyun.
3. Yiyecek ve suyun mevcut reklam libitum olduğundan emin olun.
4. Tüm işlemleri 06:00.m ile 14:00 .m arasında gerçekleştirin.

2. Sıçanların ameliyata hazırlanması

1. Sıçanları izofluran (indüksiyon için% 4 ve bakım için% 2) ve% 24 oksijen (1.5 L / dk) ile 30 dakika uyuşturun.
   1. Pedal çekme refleksine sahip olmadıklarından emin olarak sıçanlardaki anestezi seviyesini test edin.
2. 24 kalibrelik kateteri kuyruk damarına yerleştirin.
   NOT: Vazodilasyon için kuyruk ısıtma işlemi yapılmaz.
   1. Sıçanları masaya bir supine pozisyonunda yerleştirin. Farelerin dört uzuvlarını yapıştırmak için tıbbi bant kullan.
3. Sıcaklık ölçümü için probu ameliyattan önce sıçan rektumuna yerleştirin.
4. İşlem sırasında, 37 °C çekirdek vücut sıcaklığını desteklemek için bir ısıtma plakası muhafaza edin.
5. Koruma için sıçanın her iki gözüne de merhem ekleyin.
6. Cerrahi bölgeyi tıraş edin ve % 10 povidon-iyot ve ardından% 70 izopropil alkol ile üç uygulama ile dezenfekte edin.

3. Sağ taraf orta serebral arter tıkanma

NOT: MCAO, daha önce^16,22^,23olarak tanımlandığı gibi, McGarry ve ark.²⁴ve Uluç ve ark.²⁵ tarafından açıklanan enstrümanların kullanımı ile değiştirilmiş bir teknikle^{gerçekleştirilir.}

1. Boynun ventral orta hattındaki deriyi ve yüzeysel fasyayı cerrahi cımbız ve kavisli bıçaklarla makasla parçalara ayrıştırın.
2. ICA, harici karotis arter (ECA) ve ortak şahdamardan (CCA) oluşan kas üçgenini tanımlayın.
3. Damar cerrahisi için doğru CCA ve ICA'yı mikroforceps ile vagus sinirinden dikkatlice ayırın.
4. Doğru CCA ve ICA'yı açığa çıkar. CCA'dan ICA'ya gelen kan akışını mikro klipsler veya damar cerrahisi için özel turnikeler kullanarak engelleyin. Vasküler cerrahi için mikros makas kullanarak ICA üzerinde bir kesi (yaklaşık 1 mm) yapın.
5. McA 26'yı tıkamak için, sağ CCA'nın çatallanma noktasından Willis çemberine hafif bir dirence ulaşana kadar yaklaşık 18,5-19 mm uzaklıkta, doğrudan ICA'dan bir monofilament kateter^(4-0naylon) yerleştirin.
6. CCA'nın çatallanmasının üzerinde ICA'nın etrafında ligat.
7. Sham tarafından çalıştırılan denetim grubu için, adım 3.5 ve 3.6^16,22yerine naylon iplik ekleme gerçekleştirin.
8. intraperitoneal enjeksiyon ile% 0.9 sodyum klorürün 5 mL'sini uygulayın.
9. Yarayı dikişle kapatın ve sıçanı bir iyileşme alanına götürün.
   NOT: Anestezinin bitiminden birkaç dakika sonra, sıçan uyanacak ve kafesin etrafında bağımsız olarak hareket edecektir.
10. MCAO'dan sonra 23 saat sonra, salin (4 mL / kg)^{23,26% 2} Evans mavisini bir kanonül²⁷aracılığıyla her iki ameliyat grubu için kuyruk damarına enjekte edin.
    NOT: Bu, kan-beyin geçirgenlik izleyicisi olarak kullanılır. 60 dakika boyunca dolaşmasına izin verin.

4. Enfarktüs bölgesinin belirlenmesi

1. IZ'yi MCAO'dan sonra 24 saat olarak^ölçün,daha önce açıklandığı gibi⁹,^15,18,19,26.
   NOT: Kilolarının % 20'sinden fazlasını kaybeden veya nöbet veya hemipleji gelişen sıçanlar deneyden çıkarılır.
2. Fare kendiliğinden nefes almaya son verene kadar ilham alan gaz karışımını% 20 oksijen ve% 80 karbondioksit ile değiştirerek sıçanı ötenazi edin.
3. Makas ve cerrahi dikiz kullanarak göğüs kafesinin altındaki karın duvarından 5-6 cm yanal kesi ile göğsü açın.
4. Makas ve cerrahi önps ile göğüs kafesinin tüm uzunluğu boyunca diyaframlı bir kesi gerçekleştirin.
5. Akciğerleri dikkatlice yerinden çıkarmak, göğüs kafesini sağ ve sol taraftaki köprücük kemiğine kadar kesin²⁸.
6. Kalbin sol ventrikülünden 200 mL normal salin ile perfuse.
7. Kalbin sağ kulakçıkını makasla delin veya kuluçkaya yatırın.
8. Giyotin kullanarak kafa kesme işlemi gerçekleştirin ve beyin dokusunu toplayın.
9. İris makası kullanarak, foramen magnum'dan her iki taraftaki arka kafatası yüzeyinin distal kenarına kesin.
10. Koku ampullerini, ventral yüzey boyunca sinir bağlantılarını ve kafatasının dorsal yüzeyini beyinden ayırın.
11. Beyni kafasından çıkar.
12. .009" paslanmaz çelik, kaplamasız, tek kenarlı jilet ile 2 mm kalınlığında yatay bölümler oluşturarak 6 beyin dilimi üretin.
13. %0,05 TTC'de 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır.
14. Beyin dokusunu mikroskop slaytlarına yerleştirin ve bu 6 beyin diliminin 1600x1600 dpi çözünürlüğe sahip optik taramasını gerçekleştirin (örneğin, ek 1'e bakın).
15. Kanal Karıştırıcı işlevini(Görüntü > Ayarlamalar >Kanal Karıştırıcısı) kullanarak fotoğraf düzenleyicisi (örneğin, Adobe Photoshop CS2) içeren mavi bir filtre ekleyin ve görüntüyü JPEG dosya biçimi olarak kaydedin.
    NOT: Mavi filtre uygulandıktan sonra görüntü gri tonlamalı görünecektir.
16. Kaydedilen görüntüyü ImageJ 1.37v^29,30'da açın.
    NOT: Bu bilgisayar programı, siyah veya beyaz pikselleri yalıtmak ve hesaplamak için bir eşik işlevi kullanır (bkz. Şekil 1).
17. Görüntünün 6 beyin diliminin her biri için, ana menüden "çokgen seçim" aracını kullanarak her yarımküreyi (sağ yaralı ipsilateral ve sol yaralanmamış kontralatör) ayrı bir görüntü dosyası olarak seçin ve kaydedin.
18. Görüntü > Ayarla > Eşik'i seçerek ImageJ yazılımının ana menüsünden otomatik eşik işlevini kullanarak IZ'yi belirlemek için kesmeyi ayarlayın ve tek bir beyin kümesinin her yarımküreslerindeki piksel sayısını ölçün.
    NOT: ImageJ yazılımında bu adım için makrolar kullanılabilir (bkz. kod için Ek 2). Kesme, hangi piksellerin beyaza dönüştürüleceklerini ve grinin gölgesine bağlı olarak hangilerinin siyaha dönüştürüleceklerini belirlemek için kritik bir parametredir (örnek olarak Ek 3 ve Ek 4'e bakın). ImageJ daha sonra IZ'yi belirlemek için beyaz ve siyah pikselleri karşılaştırır. Boyama protokolü ve tarayıcı ayarlarına dayanarak, 0.220 sabit bir kesme değeri kullandık.
19. Ipsilateral ve Kontrallateral Serebral Yarımküre Oranları (RICH) yöntemi^13,23 kullanarak doku şişmesi için IZ düzeltme ölçümünü gerçekleştirin (Ek 5'tekiörneğe bakın).
    
    NOT: Enfarktüs boyutu kontrallateral yarımkürenin bir yüzdesi olarak değerlendirilir.

5. Beyin ödeminin belirlenmesi³¹

NOT: BE 32 , 33 ölçümü için ImageJ^1.37vkullanın.

1. MCAO'dan sonra 24 saat ölçün. BE'nin hesaplanması için, sol ve sağ yarımküre hacmindeki verileri (birimler halinde) kullanın.
2. 1600x1600 dpi çözünürlükte optik tarama gerçekleştirin (örneğin, Ek 1'e bakın).
3. Beyin yarımkürelerini seçin ve yukarıda 4.17-4.19 bölümlerinde açıklandığı gibi ImageJ 1.37v ile BE'yi belirlemek için kesmeyi ayarlayın.
4. BE alanını, aşağıdaki denklem kullanılarak RICH yöntemiyle hesaplanan etkilenmemiş kontrallateral yarımkürenin standart alanlarının yüzdesi olarak ifade edin (Ek 5'tekiörneğe bakınız)^23,34.
   
   NOT: BE kapsamı kontrallateral yarımkürenin bir yüzdesi olarak değerlendirilir.

6. BBB kesintisinin belirlenmesi

1. MCAO'dan sonra BBB kesintisini 24 saat ölçün.
2. Sağ ve sol yarımküreleri altı dilime bölün ve her birini bir mikrosantrifüj tüpüne koyun.
3. Beyin dokusunun her dilimini trikloroasetik asitte homojenize edin, %50 trikloroasetik asidin 4 mL'sinde 1 g beyin dokusunun hesaplanmasına dayanarak.
4. 20 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüj.
5. %96 etanol ile süpernatant sıvı 1:3 seyreltin.
6. Spektrofotometri yazılımını kullanarak, plakayı yükleyerek ve aşağıdaki parametreleri kullanarak örnek bir okuma gerçekleştirerek lüminesans spektrofotometrisi gerçekleştirin: Floresan yoğunluğu 620 nm (bant genişliği 10 nm) ve emisyon dalga boyu 680 nm (bant genişliği 10 nm)^23,35 ; Mod üst; Sayı Et 25; Manuel 100; Sallanıyor 1 sn, 1 mm.
   NOT: 620 nm'lik (bant genişliği 10 nm) bir heyecan dalga boyu ve 680 nm emisyon dalga boyu (bant genişliği 10 nm) kullanın. ^23,35

Sonuçlar

Enfarktüs bölgesi ölçümü

Bağımsız örneklemli bir t-testi, kalıcı MCAO uygulanan 19 sıçanın, 16 sahte fareye kıyasla beyin enfarktüs hacminde önemli bir artış gösterdiğini göstermiştir (MCAO=% 7.49 ± 3.57 vs. Sham = %0,31 ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (bkz. Şekil 2A)). Veriler, SD'± kontrallateral yarımkürenin ortalama bir yüzdesi olarak ifade edilir.

Beyin öde...

Tartışmalar

Mevcut protokolün temel amacı, iskemik yaralanmanın üç ana parametresinin tutarlı ölçümlerini göstermekti: IZ, BE ve BBB geçirgenliği. Bu alanda daha önce yapılan çalışmalar, bu parametrelerden bir veya ikisinin aynı örnekte birlikte gerçekleştirilme olasılığını ortaya koymuştur. Bu üç parçalı yöntemin sunduğu maliyet azaltmanın yanı sıra, ameliyat edilmesi ve daha sonra ötenazi yapılması gereken hayvan sayısını sınırlayan daha arzu edilen bir biyoetik model de sağlar. Tüm hi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Syringe	Braun	4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	Sigma-Aldrich	500 cc	Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe	Braun	305620
3-0 Silk sutures	Henry Schein	1007842
4-0 Nylon suture	4-00
Brain & Tissue Matrices	Sigma-Aldrich	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P	Sigma-Aldrich	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	Sigma-Aldrich	HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale	Sigma-Aldrich	Rs 4,000
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Eppendorf pipette	Sigma-Aldrich	Z683884
Eppendorf tube	Sigma-Aldrich	EP0030119460
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	Model: Infinite 200 PRO multimode reader	Optional.
Fluorescence detector	Molecular Devices LLC	VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument	Optional.
Gauze sponges	Fisher	22-362-178
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips	Sigma-Aldrich
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Infusion cuff	ABN	IC-500
Micro forceps	Sigma-Aldrich
Micro scissors	Sigma-Aldrich
Multiset	Teva Medical	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating forceps	Sigma-Aldrich
Operating scissors	Sigma-Aldrich
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F	Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5606
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11	Sigma-Aldrich	S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows	Adobe
ImageJ 1.37v	NIH		The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
SPSS Statistics 22	IBM
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Windows 10	Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	298-96-4
50% trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9
Ethanol 96 %	Romical		Flammable liquid
Evans blue 2%	Sigma-Aldrich	314-13-6
Isoflurane, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017