Messung des Abbaus von Hirnödem nach dem Schlaganfall, Infarktzone und Blut-Hirn-Barrierenabbau in einem einzigen Satz von Nagetier-Gehirnproben

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Technik zur Messung der drei wichtigsten Parameter ischämischer Hirnverletzungen an demselben Satz von Nagetier-Gehirnproben. Die Verwendung von nur einer Hirnprobe ist in Bezug auf ethische und wirtschaftliche Kosten sehr vorteilhaft.

Zusammenfassung

Eine der häufigsten Ursachen für Morbidität und Mortalität weltweit ist ischämischer Schlaganfall. Historisch gesehen beinhaltet ein Tiermodell, das zur Stimulierung des ischämischen Schlaganfalls verwendet wird, die mittlere Hirnarterienverschluss (MCAO). Infarktzone, Hirnödem und Blut-Hirn-Schranke (BBB) Abbau werden als Parameter gemessen, die das Ausmaß der Hirnverletzung nach MCAO widerspiegeln. Eine wesentliche Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass diese Messungen normalerweise in verschiedenen Hirnproben von Ratten durchgeführt werden, was aufgrund der großen Anzahl von Ratten, die für eine angemessene Stichprobengröße eingeschläfert werden müssen, zu ethischen und finanziellen Belastungen führt. Hier stellen wir eine Methode zur genauen Beurteilung von Hirnverletzungen nach MCAO vor, indem wir Infarktzonen, Hirnödeme und BBB-Permeabilität in den gleichen Rattengehirnen messen. Diese neuartige Technik bietet eine effizientere Möglichkeit, die Pathophysiologie des Schlaganfalls zu bewerten.

Einleitung

Eine der häufigsten Ursachen für Morbidität und Sterblichkeit weltweit ist Schlaganfall. Weltweit macht ischämischer Schlaganfall 68% aller Schlaganfallfälle aus, während in den Vereinigten Staaten ischämischer Schlaganfall 87% der Schlaganfallfälle^1,2ausmacht. Es wird geschätzt, dass die wirtschaftliche Belastung durch Schlaganfall in den Vereinigten Staaten³⁴ Milliarden Dollar 2 und 45 Milliarden Euro in der Europäischen Union³erreicht. Tiermodelle des Schlaganfalls sind notwendig, um seine Pathophysiologie zu studieren, neue Methoden für die Bewertung zu entwickeln und neue therapeutische Optionen vorzuschlagen⁴.

Ischämischer Schlaganfall tritt mit Okklusion einer großen Zerebralparese auf, in der Regel die mittlere Hirnarterie oder einer seiner Zweige⁵. So haben Modelle des ischämischen Schlaganfalls historisch gesehen mittlere Zerebrale Arterienverschluss (MCAO)^{6,7,8,9,10,11,12}. Nach MCAO wird eine neurologische Verletzung am häufigsten durch Messung der Infarktzone (IZ) mit einer 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Färbemethode¹³, Hirnödem (BE) mit Trocknung oder Berechnung hemisphärischer Volumina^14,15,16, und Blut-Hirn-Schranke (BBB) Permeabilität durch eine Spektrometrie-Technik mit Evans blaue Färbung^17,18,19.

Die traditionelle MCAO-Methode verwendet separate Sätze von Gehirnen für jede der drei Gehirnmessungen. Bei einem großen Stichprobenumfang führt dies zu einer erheblichen Anzahl eingeschläferter Tiere mit zusätzlichen ethischen und finanziellen Erwägungen. Eine alternative Methode zur Verringerung dieser Kosten würde Messungen aller drei Parameter in einem einzigen Satz von Post-MCAO Nagetiergehirnen beinhalten.

Frühere Versuche wurden unternommen, um Kombinationen von Parametern in derselben Gehirnprobe zu messen. Die gleichzeitigen immunfluoreszierenden Färbemethoden²⁰ sowie andere molekulare und biochemische Analysen²¹ wurden nach TTC-Färbung in derselben Hirnprobe beschrieben. Wir haben zuvor Gehirnhälften berechnet, um Hirnödeme zu bewerten, und TTC-Färbung durchgeführt, um die Infarktzone im selben Gehirnsatz¹⁵zu berechnen.

Im vorliegenden Protokoll stellen wir eine modifizierte MCAO-Technik vor, die ischämische Hirnverletzungen misst, indem sie die Durchlässigkeit von IZ, BE und BBB in denselben Nagetierhirnen ermittelt. IZ wird durch TTC-Färbung gemessen, BE wird durch Berechnung des hemisphärischen Volumens bestimmt und BBB-Permeabilität wird durch Spektrometriemethoden¹⁹ermittelt. In diesem Protokoll verwendeten wir ein modifiziertes MCAO-Modell, das auf der direkten Insertion und Fixierung des Monofilamentkatheters in die innere Halsschlagader (ICA) und der weiteren Blockierung des Blutflusses zur mittleren Hirnarterie (MCA)²²basiert. Diese modifizierte Methode zeigt eine verringerte Sterblichkeits- und Morbiditätsrate im Vergleich zur traditionellen MCAO-Methode^16,22.

Dieser neue Ansatz bietet ein finanziell solides und ethisches Modell zur Messung neurologischer Verletzungen nach MCAO. Diese Bewertung der wichtigsten Parameter der ischämischen Hirnverletzung wird dazu beitragen, seine Pathophysiologie umfassend zu untersuchen.

Protokoll

Die folgenden Verfahren wurden gemäß den Empfehlungen der Erklärung von Helsinki und Tokio und der Leitlinien für die Verwendung von Versuchstieren der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt. Die Experimente wurden auch vom Animal Care Committee an der Ben-Gurion Universität des Negev genehmigt.

1. Vorbereitung von Ratten auf das Experimentelle Verfahren

1. Wählen Sie erwachsene männliche Sprague-Dawley Ratten ohne unbedenkte Pathologie, die jeweils zwischen 300 und 350 g wiegen.
2. Halten Sie alle Ratten bei Raumtemperatur bei 22 °C, mit 12 Stunden licht- und dunkler Zyklen vor dem Experiment.
3. Stellen Sie sicher, dass Nahrungsmittel und Wasser ad libitum verfügbar sind.
4. Führen Sie alle Prozeduren zwischen 6:00 .m und 14:00 uhr .m durch.

2. Vorbereitung von Ratten auf die Operation

1. Anästhesisieren Sie die Ratten 30 min mit Isofluran (4% für Induktion und 2% für die Wartung) und 24% Sauerstoff (1,5 l/min).
   1. Testen Sie das Niveau der Anästhesie bei den Ratten, indem Sie sicherstellen, dass sie keinen Pedalentzugsreflex haben.
2. Setzen Sie den 24-Spur-Katheter in die Schwanzvene ein.
   HINWEIS: Die Schwänewämt für vasodilatation wird nicht durchgeführt.
   1. Legen Sie die Ratten auf den Tisch in einer supine Position. Verwenden Sie medizinisches Klebeband, um alle vier Gliedmaßen der Ratten anzubringen.
3. Legen Sie die Sonde zur Temperaturmessung vor der Operation in das Rattenrektum.
4. Während des Verfahrens eine Heizplatte pflegen, um eine Körpertemperatur von 37 °C zu unterstützen.
5. Fügen Sie Salbe in beiden Augen der Ratte zum Schutz.
6. Rasieren Sie den operationsischen Bereich und desinfizieren Sie mit drei Anwendungen von 10% Povidon-Jod gefolgt von 70% Isopropylalkohol.

3. Rechte Seite mittlere Zerebrale Arterie Okklusion

HINWEIS: MCAO wird durch eine modifizierte Technik durchgeführt, wie zuvor beschrieben^16,22,23, mit der Verwendung von Instrumenten beschrieben von McGarry et al.²⁴ und Ulua et al.²⁵.

1. Sezieren Sie die Haut und oberflächliche Faszien an der ventralen Mittellinie des Halses mit chirurgischer Pinzette und Schere mit gebogenen Klingen.
2. Identifizieren Sie das Muskeldreieck, bestehend aus der ICA, der äußeren Halsschlagader (ECA) und der gemeinsamen Halsschlagader (CCA).
3. Trennen Sie vorsichtig die richtige CCA und ICA vom Vagusnerv mit Mikrozangen für die Gefäßchirurgie.
4. Stellen Sie die richtige CCA und die ICA zur Seite. Blockieren Sie den Blutfluss, der von der CCA zur ICA kommt, entweder mit Mikroclips oder speziellen Tourniquets für die Gefäßchirurgie. Machen Sie einen Schnitt (ca. 1 mm) auf der ICA mit Mikroschere für die Gefäßchirurgie.
5. Legen Sie einen Monofilamentkatheter (4-0 Nylon) direkt durch die ICA, ca. 18,5-19 mm vom Bifurkationspunkt des rechten CCA in den Kreis von Willis, bis sie einen leichten Widerstand erreichen, um den MCA²⁶zu verschließen.
6. Ligate um die ICA über der Bifurkation von CCA.
7. Führen Sie für die scheinbetriebene Steuerungsgruppe ein Einsetzen von Nylongewinde anstelle der Schritte 3.5 und 3.6^16,22.
8. 5 ml 0,9% Natriumchlorid durch intraperitoneale Injektion verabreichen.
9. Schließen Sie die Wunde durch Naht und bringen Sie die Ratte in einen Erholungsbereich.
   HINWEIS: Wenige Minuten nach dem Ende der Anästhesie wacht die Ratte auf und bewegt sich selbstständig um den Käfig.
10. Bei 23 h nach MCAO 2% Evans blau in Salin (4 ml/kg)^23,26 in die Schwanzvene für beide operierten Gruppen über eine Kanüle²⁷injizieren.
    HINWEIS: Dies wird als Blut -Hirn-Permeability-Tracer verwendet. 60 Minuten zirkulieren lassen.

4. Bestimmung der Infarktzone

1. Messen Sie IZ bei 24 h nach MCAO, wie zuvor beschrieben^{9,15,18,19,26}.
   HINWEIS: Ratten, die mehr als 20% ihres Gewichts verloren haben oder Anfälle oder Hemiplegie entwickelt haben, sind vom Experiment ausgeschlossen.
2. Euthanisieren Sie die Ratte, indem Sie das inspirierte Gasgemisch durch 20% Sauerstoff und 80% Kohlendioxid ersetzen, bis die Ratte aufhört, spontan zu atmen.
3. Öffnen Sie die Brust mit einem 5-6 cm seitlichen Schnitt durch die Bauchwand unter dem Rippenkäfig mit Schere und chirurgischen Zangen.
4. Führen Sie einen Zwerchfellschnitt entlang der gesamten Länge des Rippenkäfigs mit Schere und chirurgischen Zangen durch.
5. Sorgfältige Verdrängung der Lunge, durch schneiden Sie durch den Rippenkäfig bis zum Schlüsselbein auf der rechten und linken Seite²⁸.
6. Durchdieseln Sie mit 200 ml normaler Saline durch die linke Herzkammer.
7. Punktieren oder Incise das rechte Vorhof des Herzens mit der Schere.
8. Enthauptung mit einer Guillotine durchführen und Hirngewebe sammeln.
9. Mit Irisschere, von der Foramen magnum bis zum distalen Rand der hinteren Schädeloberfläche auf beiden Seiten geschnitten.
10. Trennen Sie die Riechbirnen, nervöse Verbindungen entlang der ventralen Oberfläche und dorsale Oberfläche des Schädels vom Gehirn.
11. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Kopf.
12. Produzieren Sie 6 Gehirnscheiben, indem Sie 2 mm dicke horizontale Abschnitte mit einem .009" Edelstahl, unbeschichtet, einrandige Rasierklinge.
13. 30 min bei 37 °C in 0,05% TTC inkubieren.
14. Legen Sie das Hirngewebe auf die Mikroskopdias und führen Sie ein optisches Scannen dieser 6 Gehirnscheiben mit einer Auflösung von 1600x1600 dpi durch (siehe z. B. Beilage 1).
15. Fügen Sie einen blauen Filter mit einem Fotoeditor (z. B. Adobe Photoshop CS2) mit der Kanalmixer-Funktion (Bild > Anpassungen > Kanalmixer)hinzu und speichern Sie das Bild als JPEG-Dateiformat.
    HINWEIS: Nach dem Anwenden des blauen Filters wird das Bild grauskaliert angezeigt.
16. Öffnen Sie das gespeicherte Bild in ImageJ 1.37v^29,30.
    HINWEIS: Dieses Computerprogramm verwendet eine Schwellenwertfunktion, um die Pixel zu isolieren und zu berechnen, die entweder schwarz oder weiß sind (siehe Abbildung 1).
17. Wählen Sie für jede der 6 Gehirnscheiben des Bildes jede Hemisphäre (rechtsverletzte ipsilaterale und unverletzte Kontralaterale) als separate Bilddatei mit dem Werkzeug "Polygonauswahl" aus dem Hauptmenü aus und speichern Sie sie.
18. Legen Sie den Cut-off für die Bestimmung von IZ fest, indem Sie eine automatische Schwellenwertfunktion aus dem Hauptmenü der ImageJ-Software verwenden, indem Sie Bild > Anpassen > Schwellenwertauswählen und die Anzahl der Pixel in jeder Hemisphäre eines einzelnen Gehirnsatzes messen.
    HINWEIS: Makros können für diesen Schritt in der ImageJ-Software verwendet werden (siehe Ergänzung 2 für den Code). Der Cut-off ist ein kritischer Parameter, um zu bestimmen, welche Pixel in Weiß konvertiert werden sollen und welche je nach Grautoninton in Schwarz konvertiert werden sollen (siehe Ergänzung 3 und Ergänzung 4 als Beispiele). ImageJ vergleicht dann weiße und schwarze Pixel, um IZ zu bestimmen. Basierend auf den Färbeprotokollen und Scannereinstellungen haben wir einen konstanten Cut-off-Wert von 0,220 verwendet.
19. Führen Sie die Messung der IZ-Korrektur für Gewebeschwellungen mit den Verhältnissen der Ipsilateralen und Contralateralen Zerebralpwarten (RICH) Methode^13,23 (siehe Beispiel in Supplement 5).
    
    HINWEIS: Die Infarktgröße wird als Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre bewertet.

5. Bestimmung von Hirnödem³¹

HINWEIS: Verwenden Sie ImageJ 1.37v für die Messung von BE^32,33.

1. Messen Sie BE 24 h nach MCAO. Verwenden Sie für die Berechnung von BE die Daten aus dem volumen der linken und rechten Halbkugel (in Einheiten).
2. Führen Sie optisches Scannen mit einer Auflösung von 1600x1600 dpi durch (siehe z. B. Beilage 1).
3. Wählen Sie Gehirnhälften aus und setzen Sie den Cut-off zur Bestimmung von BE mit ImageJ 1.37v, wie oben in den Abschnitten 4.17-4.19 beschrieben.
4. Geben Sie den BE-Bereich als Prozentsatz der Standardbereiche der nicht betroffenen kontralateralen Hemisphäre aus, berechnet nach der RICH-Methode unter Verwendung der folgenden Gleichung (siehe Beispiel in Beilage 5)^23,34.
   
   HINWEIS: Die Ausdehnung von BE wird als Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre bewertet.

6. Bestimmung der BBB-Störung

1. Messen Sie BBB-Störung 24 h nach MCAO.
2. Teilen Sie die rechte und linke Hemisphäre in sechs Scheiben und legen Sie jede in ein Mikrozentrifugenrohr.
3. Homogenisieren Sie jede Scheibe des Hirngewebes in Trichloressigsäure, basierend auf der Berechnung von 1 g Hirngewebe in 4 ml 50% Trichloressigsäure.
4. Zentrifuge bei 10.000 x g für 20 min.
5. Verdünnt überstandflüssigkeit 1:3 mit 96% Ethanol.
6. Durchführen von Lumineszenzspektrophotometrie durch den Einsatz von Spektrophotometrie-Software, die Installation der Platte und die Durchführung eines Probenmesswerts unter Verwendung der folgenden Parameter: Fluoreszenzintensitäts-Anregungswellenlänge von 620 nm (Bandbreite 10 nm) und eine Emissionswellenlänge von 680 nm (Bandbreite 10 nm)^23,35 ; Mod-Top; Nummer Fleisch 25; Handbuch 100; Schütteln 1 Sek., 1 mm.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von 620 nm (Bandbreite 10 nm) und eine Emissionswellenlänge von 680 nm (Bandbreite 10 nm). ^23,35

Ergebnisse

Infarktzonenmessung

Ein t-Test mit unabhängiger Stichprobe ergab, dass 19 Ratten, die dauerhaften MCAO unterzogen wurden, eine signifikante Zunahme des Hirninfarktvolumens im Vergleich zu den 16 scheinbetriebenen Ratten zeigten (MCAO=7,49% ± 3,57 vs. Schein = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (siehe Abbildung 2A)). Die Daten werden als mittlerer Prozentsatz der kontralateralen Hemisphäre ± SD ausgedrückt.

Diskussion

Das Hauptziel des vorliegenden Protokolls bestand darin, konsistente Messungen von drei Hauptparametern ischämischer Verletzungen zu demonstrieren: IZ, BE und BBB-Permeabilität. Frühere Studien in diesem Bereich haben die Möglichkeit gezeigt, einen oder zwei dieser Parameter zusammen in derselben Stichprobe durchzuführen. Neben der Kostensenkung, die diese dreiteilige Methode bietet, bietet sie auch ein wünschenswerteres bioethisches Modell, das die Anzahl der Tiere begrenzt, die operiert und anschließend eingesch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Syringe	Braun	4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	Sigma-Aldrich	500 cc	Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe	Braun	305620
3-0 Silk sutures	Henry Schein	1007842
4-0 Nylon suture	4-00
Brain & Tissue Matrices	Sigma-Aldrich	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P	Sigma-Aldrich	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	Sigma-Aldrich	HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale	Sigma-Aldrich	Rs 4,000
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Eppendorf pipette	Sigma-Aldrich	Z683884
Eppendorf tube	Sigma-Aldrich	EP0030119460
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	Model: Infinite 200 PRO multimode reader	Optional.
Fluorescence detector	Molecular Devices LLC	VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument	Optional.
Gauze sponges	Fisher	22-362-178
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips	Sigma-Aldrich
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Infusion cuff	ABN	IC-500
Micro forceps	Sigma-Aldrich
Micro scissors	Sigma-Aldrich
Multiset	Teva Medical	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating forceps	Sigma-Aldrich
Operating scissors	Sigma-Aldrich
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F	Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5606
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11	Sigma-Aldrich	S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows	Adobe
ImageJ 1.37v	NIH		The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Windows 10	Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	298-96-4
50% trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9
Ethanol 96 %	Romical		Flammable liquid
Evans blue 2%	Sigma-Aldrich	314-13-6
Isoflurane, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017