Измерение посттактного церебрального отека, зоны инфаркта и пробок гемо-мозгового барьера в одном наборе образцов мозга грызунов

Резюме

Этот протокол описывает новый метод измерения трех наиболее важных параметров ишемической черепно-мозговой травмы на том же наборе образцов мозга грызунов. Использование только одного образца мозга является весьма выгодным с точки зрения этических и экономических издержек.

Аннотация

Одной из наиболее распространенных причин заболеваемости и смертности во всем мире является ишемический инсульт. Исторически сложилось так, что животное модель, используемая для стимулирования ишемического инсульта включает в себя окклюзию средней мозговой артерии (MCAO). Зона инфаркта, отек мозга и распад гемо-мозгового барьера (BBB) измеряются как параметры, отражающие степень черепно-мозговой травмы после MCAO. Существенным ограничением этого метода является то, что эти измерения, как правило, получены в различных образцах мозга крыс, что приводит к этическим и финансовым бременем из-за большого количества крыс, которые должны быть усыпляются для соответствующего размера выборки. Здесь мы представляем метод точной оценки черепно-мозговой травмы после MCAO путем измерения зоны инфаркта, отек мозга и BBB проницаемости в том же наборе крыс мозга. Этот новый метод обеспечивает более эффективный способ оценки патофизиологии инсульта.

Введение

Одной из наиболее распространенных причин заболеваемости и смертности во всем мире является инсульт. Во всем мире ишемический инсульт составляет 68% всех случаев инсульта, в то время как в Соединенных Штатах ишемический инсульт составляет 87% случаев^{инсульта 1,2}. Подсчитано, что экономическое бремя инсульта достигает $ 34 млрд в^{Соединенных Штатах 2} и 45 млрд евро в Европейском союзе³. Модели инсульта животных необходимы для изучения его патофизиологии, разработки новых методов оценки и предложить новые терапевтические^{варианты 4.}

Ишемический инсульт происходит при окклюзии основной мозговой артерии, обычно средней мозговой артерии или одной из ее ветвей^5. Так, в моделях ишемического инсульта исторически задействованы окклюзия средней мозговой артерии^{(MCAO) 6,7,8,9,10,11,12.} Вслед за MCAO, неврологические травмы чаще всего оценивается путем измерения зоны инфаркта (ИЗ) с использованием 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (TTC)^{окрашивания метод 13}, отек мозга (BE) с помощью сушки или расчета объемов полушария^{14 , 15,16,}и^{гемового}мозга барьер (BBB) проницаемость по технике спектрометрии с использованием Эванс синий^{окрашивания 17,18,19}.

Традиционный метод MCAO использует отдельные наборы мозгов для каждого из трех измерений мозга. Для большого размера выборки, это приводит к значительному числу усыпляемых животных, с дополнительными этическими и финансовыми соображениями. Альтернативный метод для облегчения этих расходов будет включать измерения всех трех параметров в одном наборе мозгов грызунов после MCAO.

Предыдущие попытки были сделаны для измерения комбинаций параметров в том же образце мозга. Одновременно иммунофторесцентные^{методы окрашивания 20,} а также другие^{молекулярно-биохимические анализы 21 были описаны} после окрашивания ТТК в том же образце мозга. Ранее мы вычислили объемы полушария мозга для оценки отеков мозга и выполнили Окрашивание ТТК для расчета зоны инфаркта в том же наборе^{мозга 15.}

В настоящем протоколе мы представляем модифицированный метод MCAO, который измеряет ишемическую черепно-мозговую травму путем определения проницаемости ИК, BE и BBB в том же наборе мозгов грызунов. Я измеряется TTC окрашивания, BE определяется путем расчета объема полушария, и BBB проницаемость получена методами спектрометрии¹⁹. В этом протоколе мы использовали модифицированную модель MCAO, основанную на прямой вставке и фиксации монофильтрного катетера во внутреннюю соонную артерию (ICA) и дальнейшем блокировании притока крови к средней мозговой артерии (MCA)²². Этот модифицированный метод показывает снижение уровня смертности и заболеваемости по сравнению с традиционным методом^{MCAO 16,22}.

Этот новый подход обеспечивает финансово-звуковую и этическую модель для измерения неврологических травм после MCAO. Такая оценка основных параметров ишемической черепно-мозговой травмы поможет всесторонне исследовать ее патофизиологию.

протокол

Следующие процедуры были проведены в соответствии с рекомендациями Хельсинкской и Токийской деклараций и Руководящих принципов использования экспериментальных животных Европейского сообщества. Эксперименты были также одобрены Комитетом по уходу за животными в Университете Бен-Гуриона в Негеве.

1. Подготовка крыс к экспериментальной процедуре

1. Выберите взрослых самцов крыс Спраг-Доули без явной патологии, каждая весом от 300 до 350 г.
2. Поддерживайте всех крыс при комнатной температуре при температуре 22 градусов по Цельсию, с 12 часами световых и темных циклов перед экспериментом.
3. Убедитесь, что пища и вода доступны объявление libitum.
4. Выполните все процедуры с 6:00 .m до 14:00 .m.

2. Подготовка крыс к операции

1. Обезболивать крыс в течение 30 мин с изофлураном (4% для индукции и 2% для обслуживания) и 24% кислорода (1,5 л/мин).
   1. Проверьте уровень анестезии у крыс, гарантируя, что они не имеют педаль вывода рефлекс.
2. Вставьте катетер 24-го калибра в хвостовую вену.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хвост потепление для вазодилатации не выполняется.
   1. Поместите крыс на стол в положении лежа. Используйте медицинскую ленту, чтобы прикрепить все четыре конечности крыс.
3. Поместите зонд для измерения температуры в прямую кишку крысы перед операцией.
4. Во время процедуры, поддерживать нагревательной пластины для поддержки температуры тела 37 градусов по Цельсию.
5. Добавить мазь в обоих глазах крысы для защиты.
6. Бритье хирургической области и дезинфицировать с тремя приложениями 10% povidone-йода следуют 70% изопропилового спирта.

3. Правая сторона средней мозговой артерии окклюзии

ПРИМЕЧАНИЕ: MCAO выполняется по модифицированной технике,^{как описано ранее 16,22,23}, с использованием инструментов, описанных McGarry et al.²⁴ и Ulu' et al.²⁵.

1. Рассекают кожу и поверхностную фасцию на брюшной средней линии шеи хирургическим пинцетом и ножницами с изогнутыми лезвиями.
2. Определите мышечный треугольник, состоящий из ICA, внешней сонной артерии (ЭКА) и общей сонной артерии (CCA).
3. Тщательно отделяйте правые CCA и ICA от блуждающего нерва с микросилами для сосудистой хирургии.
4. Разоблачить право CCA и ICA. Блокируйте приток крови, поступающий из CCA в ICA, используя либо микро-клипы или специальные турникеты для сосудистой хирургии. Сделайте разрез (примерно 1 мм) на ICA с помощью микросхем для сосудистой хирургии.
5. Вставьте монофильтрный катетер (4-0 нейлона) непосредственно через ICA, около 18,5-19 мм от точки бифуркации правой CCA в круг Уиллиса до достижения легкого сопротивления, чтобы окквил MCA²⁶.
6. Ligate вокруг ICA над bifurcation CCA.
7. Для фиктивной контрольной группы выполните вставку нейлонового потока вместо шагов 3.5 и 3.6^16,22.
8. Администрирование 5 мл 0,9% хлорида натрия путем внутриперитонеальной инъекции.
9. Закройте рану швом и возьмите крысу в зону восстановления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Через несколько минут после окончания анестезии, крыса проснется и двигаться самостоятельно вокруг клетки.
10. На 23 ч после MCAO, вводить 2% Эванс синий в солевой раствор (4^{мл/кг) 23,26 в хвостовую} вену для обеих эксплуатируемых групп через канюлю²⁷.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это используется в качестве кровевидного проницаемости трассировщика. Разрешить циркулировать в течение 60 минут.

4. Определение зоны инфаркта

1. Измерьте ИК на 24 ч после MCAO,^{как описано}ранее 9^,15,18,19,26.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы, которые потеряли более 20% своего веса или развитых судорог или гемиплегии исключены из эксперимента.
2. Euthanize крысы, заменив вдохновил газовой смеси с 20% кислорода и 80% углекислого газа, пока крыса перестает дышать спонтанно.
3. Откройте грудь с 5-6 см боковой разрез через брюшную стенку под грудной клеткой с помощью ножниц и хирургических типсов.
4. Выполните диафрагматический разрез по всей длине грудной клетки с ножницами и хирургическими миппами.
5. Тщательно вытесняя легкие, прорезать грудную клетку до ключицы справа и слева^28.
6. Перелив с 200 мл нормального солевого раствора через левый желудочек сердца.
7. Прокол или резвиться правого атриума сердца с ножницами.
8. Выполните обезглавливание с помощью гильотины и собирать ткани мозга.
9. Используя ножницы радужной оболочки глаза, вырезать из foramen magnum к дистальной кромке задней поверхности черепа с обеих сторон.
10. Отделить обонятельные луковицы, нервные соединения вдоль брюшной поверхности и спинной поверхности черепа от мозга.
11. Удалите мозг из головы.
12. Производить 6 ломтиков мозга, создавая 2 мм толщиной горизонтальные секции с 0,009 "нержавеющей стали, без покрытия, один край лезвие бритвы.
13. Инкубация в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию в 0,05% TTC.
14. Поместите ткани мозга на слайды микроскопа и выполните оптическое сканирование этих 6 ломтиков мозга с разрешением 1600x1600 dpi (см. дополнение 1, например).
15. Добавьте синий фильтр с фоторедактором (например, Adobe Photoshop CS2) с помощью функции Channel Mixer (изображение и настройкии функции Channel Mixer)и сохраните изображение в формате файла JPEG.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После применения синего фильтра изображение будет отображаться в сером масштабе.
16. Откройте сохраненное изображение в ImageJ 1.37v^29,30.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта компьютерная программа использует пороговую функцию для изоляции и расчета пикселей, которые являются черными или белыми (см. рисунок 1).
17. Для каждого из 6 ломтиков мозга изображения, выберите и сохраните каждое полушарие (правый раненый ипсилатеральный и левый невредимым контралатеральный) в качестве отдельного файла изображения с использованием инструмента "полигон выбор" из основного меню.
18. Установите отсею для определения ИК с помощью функции автоматического порога из основного меню программного обеспечения ImageJ, выбрав изображение и отрегулируйте пороговое значение иизмерьте количество пикселей в каждом полушарии одного набора мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Макрос может быть использован для этого шага в программном обеспечении ImageJ (см. Дополнение 2 для кода). Отрезание является критическим параметром для определения того, какие пиксели преобразовать в белый, а какие преобразовать в черный в зависимости от оттенка серого (см. Дополнение 3 и дополнение 4 в качестве примеров). ImageJ затем сравнивает белые и черные пиксели, чтобы определить ИК. Основываясь на протоколе окрашивания и настройках сканера, мы использовали постоянное значение выреза 0.220.
19. Выполните измерение коррекции ИК для отеков тканей с помощью соотношения ипсилатеральных и контралатеральных полушарий головного мозга (RICH)^{метод 13,23} (см. пример в дополнение 5).
    
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер инфаркта оценивается как процент от контралатерального полушария.

5. Определение отека мозга³¹

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ImageJ 1.37v для измерения BE^32,33.

1. Мера BE 24 h после MCAO. Для расчета BE используйте данные из объема левого и правого полушария (в единицах).
2. Выполните оптическое сканирование с разрешением 1600x1600 dpi (см. дополнение 1, например).
3. Выберите полушария мозга и установите отрезание для определения BE с ImageJ 1.37v, как описано выше в разделах 4.17-4.19.
4. Выразите область BE в процентах от стандартных областей незатронутого контралатерального полушария, рассчитанного методом RICH с использованием следующего уравнения (см. пример в дополнении 5)^23,34.
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Степень BE оценивается как процент от контралатерального полушария.

6. Определение нарушения BBB

1. Мера BBB нарушения 24 ч после MCAO.
2. Разделите правое и левое полушария на шесть ломтиков и положите каждое из них в микроцентрифугную трубку.
3. Гомогенизировать каждый кусочек ткани мозга в трихлороатетической кислоте, основываясь на расчете 1 г ткани мозга в 4 мл 50% трихлороактической кислоты.
4. Центрифуга при 10 000 х г в течение 20 мин.
5. Разбавить супернатант жидкость 1:3 с 96% этанола.
6. Выполните спектрофотометрию люминесценции, используя программное обеспечение спектрофотометрии, устанавливая пластину и выполняя показания образца, используя следующие параметры: Флуоресцентная интенсивность возбуждения длины волны 620 нм (ширина 10 нм) и длина волны выбросов 680 нм (ширина 10^{нм) 23,35;} Мод сверху; Номер Плоть 25; Руководство 100; Встряхивание 1 сек, 1 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте восклицательный длина волны 620 нм (ширина 10 нм) и длину волны выбросов 680 нм (ширина 10 нм). ^23,35

Результаты

Измерение инфарктной зоны

Независимый образец t-test показал, что 19 крыс, которые прошли постоянный MCAO продемонстрировали значительное увеличение объема инфаркта мозга по сравнению с 16 фиктивных крыс (MCAO 7,49% ± 3,57 против. Шам - 0,31% ± 1,9, т(28,49) - 7,56, р-н; 0,01 (см.

Обсуждение

Основная цель настоящего протокола состояла в том, чтобы продемонстрировать последовательные измерения трех основных параметров ишемической травмы: проницаемости ИЭЗ, BE и BBB. Предыдущие исследования в этой области продемонстрировали возможность совместного выполнения одного или дв?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Syringe	Braun	4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	Sigma-Aldrich	500 cc	Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe	Braun	305620
3-0 Silk sutures	Henry Schein	1007842
4-0 Nylon suture	4-00
Brain & Tissue Matrices	Sigma-Aldrich	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P	Sigma-Aldrich	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	Sigma-Aldrich	HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale	Sigma-Aldrich	Rs 4,000
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Eppendorf pipette	Sigma-Aldrich	Z683884
Eppendorf tube	Sigma-Aldrich	EP0030119460
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	Model: Infinite 200 PRO multimode reader	Optional.
Fluorescence detector	Molecular Devices LLC	VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument	Optional.
Gauze sponges	Fisher	22-362-178
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips	Sigma-Aldrich
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Infusion cuff	ABN	IC-500
Micro forceps	Sigma-Aldrich
Micro scissors	Sigma-Aldrich
Multiset	Teva Medical	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating forceps	Sigma-Aldrich
Operating scissors	Sigma-Aldrich
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F	Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5606
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11	Sigma-Aldrich	S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows	Adobe
ImageJ 1.37v	NIH		The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Windows 10	Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	298-96-4
50% trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9
Ethanol 96 %	Romical		Flammable liquid
Evans blue 2%	Sigma-Aldrich	314-13-6
Isoflurane, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017