Detección de ADN libre de células en muestras de plasma sanguíneo de pacientes con cáncer

Resumen

En este artículo presentamos un protocolo detallado para la técnica de biopsia líquida no invasiva, incluyendo recolección de sangre, separación de plasma y capa buffy, extracción de ADN cfDNA y germinlina, cuantificación del ADN cfDNA o de la línea germinal, y análisis de enriquecimiento de fragmentos cfDNA.

Resumen

Identificar mutaciones en tumores de pacientes con cáncer es un paso muy importante en el manejo de enfermedades. Estas mutaciones sirven como biomarcadores para el diagnóstico tumoral, así como para la selección del tratamiento y su respuesta en pacientes con cáncer. El método estándar de oro actual para detectar mutaciones tumorales implica una prueba genética del ADN tumoral mediante biopsias tumorales. Sin embargo, este método invasivo es difícil de realizar repetidamente como una prueba de seguimiento del repertorio mutacional tumoral. La biopsia líquida es una técnica nueva y emergente para detectar mutaciones tumorales como un enfoque de biopsia fácil de usar y no invasivo.

Las células cancerosas se multiplican rápidamente. Paralelamente, numerosas células cancerosas se someten a apoptosis. Los desechos de estas células se liberan en el sistema circulatorio de un paciente, junto con piezas de ADN finamente fragmentadas, llamadas fragmentos de ADN libre de células (CFDNA), que llevan mutaciones del ADN tumoral. Por lo tanto, para identificar biomarcadores basados en CFDNA utilizando la técnica de biopsia líquida, se recogen muestras de sangre de los pacientes con cáncer, seguidas de la separación del plasma y la capa buffy. A continuación, el plasma se procesa para el aislamiento de cfDNA, y la capa de buffy respectiva se procesa para el aislamiento del ADN genómico de un paciente. A continuación, se comprueban ambas muestras de ácido nucleico en busca de su cantidad y calidad; y se analizaron para detectar mutaciones utilizando técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS).

En este manuscrito, presentamos un protocolo detallado para la biopsia líquida, incluyendo la recolección de sangre, plasma y separación de capa buffy, extracción de ADN cfDNA y germlina, cuantificación del ADN cfDNA o germinina, y análisis de enriquecimiento de fragmentos cfDNA.

Introducción

Los avances tecnológicos han llevado a la secuenciación de cientos de genomas y transcriptomas de cáncer^1. Esto ha contribuido a comprender los paisajes de cambios moleculares en diferentes tipos de cáncer^2. Otros estudios sobre estos paisajes han ayudado a caracterizar las alteraciones somáticas secuenciales y las fusiones génicas-génicas³ que están implicadas en el cáncer o la progresión tumoral, al interrumpir en serie las vías de apoptosis^4. Por lo tanto, las mutaciones somáticas y las fusiones génicas pueden proporcionar información sobre tumores sirviendo como biomarcadores en pacientes individuales para un tumor particular tipo^5,identificando el pronóstico de tumores primarios existentes^6,categorizando tumores secundarios basados en cambios moleculares^7,e identificando dianas tumorales farmacológicas^8. Dicha información puede facilitar la selección de tratamientos personalizados para pacientes con cáncer y en la determinación de respuestas positivas y negativas al tratamiento^9. Sin embargo, la obtención de material tumoral para identificar el perfil genómico del tejido tumoral es un procedimiento invasivo^10. Además, una biopsia tumoral comprende sólo una pequeña parte de un tumor heterogéneo; y, por lo tanto, no ser representativo para el perfil molecular de todo el tumor^11. El monitorización en serie y el genotipado tumoral requieren una recopilación repetida de tejidos tumorales, que, por lo general, no es factible debido a la invasión del procedimiento de biopsia tumoral y a los problemas de seguridad que surgen de dichos procedimientos^12.

La técnica de biopsia líquida, por otro lado, ha ganado una enorme atención en oncología de precisión en la última década^13,14. Se debe principalmente a la no invasión de esta técnica, y a la posibilidad de que se repita en múltiples puntos de tiempo, lo que permite una técnica de monitorización fácil de usar y segura para los cursos de la enfermedad^15,16. La biopsia líquida se basa en un fenómeno de que las células tumorales se multiplican rápidamente, y al mismo tiempo muchas de ellas se someten a apoptosis y necrosis. Esto conduce a la liberación de restos celulares apoptóticos en la sangre de los pacientes, junto con los fragmentos de ADN que se cortan en tamaños precisos durante la apoptosis^17. La apoptosis de las células no cancerosas también conduce a la liberación de sus desechos celulares en la sangre, sin embargo, la tasa de apoptosis en estas células es relativamente mucho menor que las células tumorales^18. La razón de la técnica de biopsia líquida es capturar moléculas asociadas al tumor como ADN, ARN, proteínas y células tumorales^14,19 que circulan continuamente en la sangre. Varias técnicas²⁰ se pueden utilizar para el análisis de estas moléculas, incluyendo secuenciación de próxima generación (NGS), reacción en cadena de la polimerasa de gota digital (ddPCR), PCR en tiempo real y ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA). La técnica de biopsia líquida permite identificar biomarcadores que son características de las células tumorales. Estas moléculas de biomarcador no sólo se liberan de partes específicas de un tumor, sino más bien de todas las partes del tumor^21. Por lo tanto, los marcadores identificados en la biopsia líquida representan el perfil molecular de todo un tumor heterogéneo, además de otros tumores en el cuerpo, por lo tanto, tener ventajas sobre la técnica basada en biopsia de tejido^22.

El cfDNA tiene un corto tiempo de vida media en la sangre circulante que va desde unos minutos hasta 1-2 horas^23. Sin embargo, el corto tiempo de vida media de cfDNA facilita los análisis en tiempo real mediante la evaluación de la respuesta al tratamiento y evaluaciones dinámicas del tumor. Los niveles de CFDNA derivados del tumor indican el pronóstico de la etapa/tamaño del tumor evidenciado por varios estudios, que mostraron una relación entre los niveles de CFDNA y los resultados de supervivencia^24. Además, los estudios han demostrado que el CFDNA tiene una mejor capacidad de predicción que los marcadores tumorales existentes^25. El pronóstico del CFDNA es aún más pronunciado después del tratamiento oncológico, los niveles más altos de CFDNA después del tratamiento se correlacionan bien con una tasa reducida de supervivencia y resistencia al tratamiento. Mientras que, los niveles más bajos de CFDNA después del tratamiento generalmente corresponden con la respuesta positiva al tratamiento. Además, el CFDNA facilita la detección precoz de la respuesta al tratamiento que los métodos de detección tradicionales.

El CFDNA aumenta la posibilidad de detección precoz de mutaciones asociadas al cáncer: durante la enfermedad en etapa temprana^15,la aparición de síntomas²⁶ y antes del diagnóstico de cáncer de hasta 2 años^27. Como cfDNA se libera de múltiples regiones tumorales o focos, su análisis proporciona una visión completa del genoma tumoral que representa^28. Por lo tanto, el CFDNA permite detectar mutaciones somáticas que podrían haberse perdido en las muestras de tejido^29. Como la heterogeneidad intra-tumoral y las mutaciones subclonales pueden ser detectadas por la secuenciación profunda de regiones genómicas que abarcan miles de bases, por lo tanto el análisis de la CFDNA permite descubrir subtipos moleculares específicos con firmas genómicas distintas^13. Para obtener un nivel similar de información a través de la muestra de tejido se habrían necesitado muchas biopsias sólidas.

Además, los niveles de CFDNA en pacientes con una enfermedad localizada como el cáncer de colon, ovario y pulmón después de un tratamiento quirúrgico y/o quimioterapia, demostraron ser un potente marcador pronóstico para la recurrencia del cáncer y los resultados del tratamiento^20. Además, en pacientes con cáncer de colon, mama y pulmón, los análisis de cfDNA de la sangre pudieron detectar con éxito los cambios específicos del tumor, lo que llevó a la predicción precisa de recurrencia con varios meses de antelación^13. Además, los marcadores de resistencia al tratamiento, como mutaciones KRAS en pacientes con CRC que reciben tratamiento anti-EGFR^30; VAF para genes como PIK3CA, MED1 o EGFR en pacientes con cáncer de mama después del tratamiento con diversas terapias^31; y la mutación de resistencia al EGFR T790M en pacientes con cáncer de pulmón tratados con TKIs³² dirigidos por EGFR también se puede identificar mediante el análisis cfDNA.

En resumen, el análisis cfDNA se puede utilizar para identificar biomarcadores precisos en el campo de la oncología^13,33. En este protocolo, se procesaron muestras de sangre de 3 pacientes con glioma y 3 controles sanos para obtener ADN genómico de los WBC y cfDNA del plasma. En el cáncer de glioma, las mutaciones en IDH, TERT, ATRX, EGFR y TP53 sirven como un diagnóstico, así como marcadores pronósticos que pueden ayudar en el diagnóstico precoz de tumores de glioma, clasificando diferentes tipos de tumores de glioma, guiando el tratamiento preciso para el paciente individual y entendiendo la respuesta al tratamiento^34,35. El estado mutacional de estos genes se puede identificar utilizando CFDNA derivado de la sangre. En este manuscrito, presentamos un protocolo detallado de cfDNA derivado del plasma que se ha utilizado para estudiar los cambios mutacionales en el cáncer de glioma^12. Este protocolo de biopsia líquida basado en cfDNA explicado en este artículo se puede utilizar para estudiar los cambios mutacionales en muchos otros tipos de cánceres. Además, un estudio reciente ha demostrado que la biopsia líquida basada en cfDNA puede detectar 50 tipos diferentes de cánceres^36.

La recolección, almacenamiento y envío de muestras de sangre son pasos cruciales en este protocolo, ya que la temperatura incontrolada durante estos pasos causa lisis de los WBC, lo que conduce a la liberación de ADN genómico del CMB en el plasma y causa contaminación de la muestra cfDNA, que afecta al resto del procedimiento^37. La hemólisis debido a la temperatura incontrolada puede afectar los procesos de preparación de muestras aguas abajo de cfDNA, como los pasos^{PCR 38}. El suero contiene una alta proporción de cfDNA germinal en lugar de plasma, aunque presenta un gran ruido de fondo para cfDNA³⁹asociado al tumor. Por lo tanto, para aislar el cfDNA asociado al tumor, el plasma es una muestra adecuada^39. La sangre extraída en un anti-coagulante que contenga tubo de recolección de sangre debe reducirse inmediatamente o en un plazo de hasta dos horas, para separar el plasma y evitar la contaminación por CFDNA. En este protocolo, se utilizan tubos de recolección de sangre dedicados a la conservación comercial cfDNA (ver Tabla de Materiales),que son una alternativa al anticoagulante que contiene tubos de recolección de sangre. Estos tubos dedicados de recolección de sangre preservan cfDNA y cfRNA, y previenen la lisis de los WBC durante un tiempo de hasta 30 días a temperatura ambiente, y hasta 8 días a 37 °C. Esto facilita el mantenimiento de la temperatura adecuada durante un envío de muestras de sangre y hasta que el plasma y el CMB se separan^40.

Actualmente hay tres tipos de metodologías de extracción cfDNA disponibles: aislamiento de fase, columna de espín a base de membrana de silicio y aislamiento magnético basado en cuentas^41. El método de columna de espín basado en membrana de silicio produjo una gran cantidad de cfDNA con alta integridad en comparación con otros métodos de extracción cfDNA⁴².

La evaluación cuantitativa del ADN es un requisito fundamental en la biopsia líquida, hay una necesidad de desarrollar un procedimiento simple, asequible y estandarizado para su fácil implementación y uso amplio. Tres métodos comúnmente utilizados para la cuantificación cfDNA son espectrofotométricos, fluorimétricos y qPCR. El método fluorimétrico se demuestra mejor que los demás métodos relativos a la precisión, el costo y la facilidad de conducción^43.

La integridad y pureza del cfDNA se puede estimar mediante electroforesis agarose o electroforesis capilar. La electroforesis de agarose no muestra sensibilidad a baja concentración de CFDNA ni tiene alta resolución para mostrar un tamaño preciso de fragmentos de CFDNA. Por otro lado, la electroforesis capilar tiene una ventaja sobre la electroforesis de agarose al superar los desafíos asociados y, por lo tanto, ampliamente utilizado por los investigadores para el análisis del tamaño de fragmentos cfDNA. En este protocolo, la distribución del tamaño del fragmento de cfDNA aislado se estimó utilizando un instrumento automatizado de electroforesis capilar (véase Tabla de materiales).

Protocolo

Antes de la recolección de sangre, se requiere el consentimiento informado de los sujetos que participan en la investigación y deben obtenerse. La investigación descrita en este manuscrito se realizó de acuerdo con el Centro Médico Rabin, el comité ético de Israel (código ético: 0039-17-RMC) y la Facultad de Medicina Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Comité ético de Alemania (código ético: D 405/14).

1. Recolección y almacenamiento de muestras de sangre en tubos conservantes cfDNA o cfRNA

1. Etiquete correctamente los tubos de conservación
2. Recoger ~ 8 ml de sangre en el tubo de preservación cf-DNA (ver Tabla de materiales),utilizando un conjunto de recolección de sangre y un soporte, según el protocolo institucional estándar para la venipuntura como se describe a continuación.
   NOTA: El uso de un conjunto de recolección de sangre puede prevenir un posible flujo posterior de la sangre desde el tubo.
   1. Alinee al paciente con el brazo en una posición hacia abajo.
   2. Sujete el tubo erguido, con la tapa hacia arriba, mientras se asegura de que el contenido del tubo no toque la tapa o la punta de la aguja.
   3. A medida que la sangre comienza a fluir hacia el tubo, suelte el torniquete lentamente.
3. Inmediatamente después de que el tubo esté lleno de sangre (capacidad máxima: 8,4 ml de sangre entera), invierta suavemente el tubo (gire la muñeca del brazo que sostiene el tubo 180° hacia abajo y hacia atrás) 5 veces para estabilizar la muestra.
   NOTA: La inversión garantiza que el conservante se mezcle uniformemente con la muestra. Sin embargo, no vuelva a agitar el contenido, incluso antes de la preparación del plasma. La mezcla insuficiente de conservantes con la muestra de sangre conduce a la desestabilización del contenido y la formación de micro coágulos o hemólisis. En esta etapa, el protocolo se puede continuar inmediatamente para la separación plasmática o tubos llenos de sangre pueden esperar hasta 30 días a temperatura ambiente (15-25 °C), y hasta 8 días a 37 °C.

2. Separación y almacenamiento de plasma y capa buffy

1. Centrífuga el tubo de conservación lleno de sangre a 425 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente para separar el plasma.
   NOTA: Los pasos 2.2 y 2.3 deben realizarse en un armario de bioseguridad.
2. Pipetear cuidadosamente la capa superior de plasma a un tubo fresco en 1 mL aliquots, sin perturbar las capas inferiores.
3. Transfiera cuidadosamente la siguiente capa de capa buffy a un tubo fresco (la capa aparece como un anillo por encima de los pellets RBC), evitando los RBC en la capa inferior.
4. Proceda al paso 3 con plasma y paso 4 con la capa buffy. Si es necesario, almacene el contenido separado a -80 °C.

3. Purificación de cfDNA circulante a partir de 1 ml de plasma

NOTA: Este paso se realiza con un kit comercial (consulte Tabla de materiales). Todos los búferes se proporcionan con el kit.

1. Preparación de tampones y reactivos
   PRECAUCIÓN: No agregue soluciones ácidas o lejía directamente a los residuos de preparación de muestras. Las sales de guanidina presentes en lysis buffer, tampón de unión y tampone de lavado-1 cuando se combinan con lejía o ácidos pueden producir compuestos altamente reactivos.
   1. Búfer de enlace: Mezcle 300 ml de concentrado de búfer de enlace con 200 ml de isopropanol 100% para hacer 500 ml de búfer de enlace de trabajo. Conservar a temperatura ambiente.
      NOTA: El búfer de unión permite la unión óptima de los ácidos nucleicos circulantes a la membrana de sílice. 500 ml del búfer de encuadernación es suficiente para procesar 276, 138, 92, 69 o 55 muestras de 1, 2, 3, 4 o 5 ml de plasma respectivamente y es estable durante 1 año a temperatura ambiente.
   2. Wash Buffer-1: Mezcle 19 ml de concentrado Wash Buffer-1 con 25 ml de etanol 96-100% para hacer 44 ml de wash buffer-1 en funcionamiento. Conservar a temperatura ambiente.
      NOTA: Wash Buffer-1 elimina los contaminantes unidos a la membrana de sílice. 44 ml de lavado de trabajo Buffer-1 es suficiente para procesar 73 muestras de plasma de 1/2/3/4/5 ml y es estable durante 1 año a temperatura ambiente.
   3. Wash Buffer-2: Mezcle bien 13 mL de concentrado de buffer-2 de lavado con 30 ml de etanol 96-100% para hacer 43 ml de tampone de lavado de trabajo-2. Conservar a temperatura ambiente.
      NOTA: Wash Buffer-2 elimina los contaminantes unidos a la membrana de sílice. 43 ml de lavado de trabajo Buffer-2 es suficiente para procesar ~ 56 muestras de 1/2/3/4/5 mL de plasma y es estable durante 1 año a temperatura ambiente.
   4. A un tubo que contenga ARN portador liofilizado de 310 μg, agregue 1.550 μL de tampón de elución, para preparar una solución portadora de ARN de 0,2 μg/μL. Después de disolver completamente el ARN portador, divida la solución a coácuotas adecuadas y guárdelo a –30 °C a –15 °C. No congele estos alícuotas más de 3 veces. Al buffer de lisis, tal y como se muestra en de la tabla S1, agregue el ARN portador reconstituido disuelto en el buffer de elution.
      NOTA: Porque el ARN portador no se disuelve directamente en el buffer de lisis, primero debe disolverse en un búfer de elución y, a continuación, en el búfer de lisis. En primer lugar, la unión de ácidos nucleicos por membrana de sílice se mejora cuando hay muy pocas moléculas diana presentes en la muestra. En segundo lugar, el riesgo de degradación del ARN se reduce debido a la presencia de grandes cantidades de ARN portador.
2. Antes de iniciar el aislamiento, lleve las columnas y muestras a temperatura ambiente y ajuste los volúmenes de la muestra a 1 ml con solución salina estéril amortiguada por fosfato (PBS), si es necesario. Precalentamiento 2 baños de agua o bloques de calefacción que contienen tubos centrífugas de 50 ml y tubos de recogida de 2 ml a 60 °C y 56 °C, respectivamente.
3. A un tubo centrífuga de 50 ml, agregue 100 μL de Proteinase K, 1 mL de plasma y 0,8 ml de tampón Lysis que contenga 1,0 μg de ARN portador (preparado en el paso 3.1.4). Cierre el tubo centrífuga con una tapa y mezcle el contenido por vórtice de pulso durante 30 s, a la vez que garantiza un vórtice visible en el tubo. La mezcla exhaustiva de los contenidos es importante para una lisis eficiente.
   NOTA: Inmediatamente después del vórtice, proceda al paso 3.4, sin demora.
4. Incubar la solución a 60 °C durante 30 min.
5. Retire la tapa, agregue 1,8 ml del búfer de unión al tubo y mezcle a fondo con el vórtice de pulso durante 15-30 s después de colocar la tapa.
6. Incubar la mezcla resultante durante 5 minutos sobre hielo e insertar la columna de membrana de sílice en el aparato de vacío que está conectado a la bomba de vacío. A continuación, inserte firmemente un extensor de tubo de 20 ml en la columna abierta para evitar fugas de muestra.
7. Vierta cuidadosamente la mezcla incubada en el extensor de tubo de la columna y encienda la bomba de vacío. Después de que toda la mezcla de lysate se ejecute completamente a través de las columnas, apague la bomba de vacío, suelte la presión a 0 mbar y retire y deseche el extensor del tubo.
   NOTA: Evitando la contaminación cruzada, el extensor del tubo debe desecharse cuidadosamente, para evitar su propagación sobre las columnas adyacentes.
8. Retire la columna del aparato de vacío, inserte en el tubo de recogida y centrífuga a 11.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente, para eliminar cualquier lisato residual. Deseche el flujo a través.
9. Añadir 600 μL de Wash Buffer-1 en la columna, centrífuga a 11.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente, desechar el flujo a través.
10. Añadir 750 μL de Wash Buffer-2 a la columna, centrífuga a 11.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente, y desechar el flujo a través.
11. Añadir 750 μL de etanol (96–100%) a la columna, centrífuga a 11.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y desechar el flujo a través.
12. Centrífuga la columna a 20.000 x g durante 3 minutos, colocándola en un tubo de recogida limpio de 2 ml.
13. Seque completamente el conjunto de columnas de membrana colocándolo en un nuevo tubo de recogida de 2 ml con la tapa abierta e incubando a 56 °C durante 10 minutos.
14. Coloque la columna en un tubo de elución limpio de 1,5 ml. En el centro de la membrana de columna, aplicar 20-150 μL de tampón de elución e incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos con la tapa cerrada.
    NOTA: Asegúrese de que el búfer de elución esté equilibrado a temperatura ambiente. En caso de utilizar búfer de elución inferior a 50 μL, asegúrese de que se dispensa cuidadosamente en el centro de la membrana. Esto ayuda con la elución completa del ADN encuadernado. Sin embargo, el volumen de elución no es fijo y se puede cambiar según las aplicaciones de nivel inferior. El eluato recuperado puede ser de hasta 5 μL y ciertamente menor que el volumen de elución aplicado a la columna.
15. Centrífuga el eluato recuperado en una microcentrífuga a 20.000 x g durante 1 minuto para obtener los ácidos nucleicos, y almacenar a -20 °C.

4. Purificación del ADN genómico de buffy coat

NOTA: El kit comercial utilizado en este protocolo se menciona en la Tabla de materiales. Los búferes y reactivos mencionados en el protocolo siguiente, es decir, el búfer de lisis A, el búfer de lisis B, el búfer de lavado X, el búfer de lavado Y, el tampón de proteinasa, el búfer de elución y Proteinase K forman parte de este kit comercial.

1. Preparación de los tampones y reactivos
   PRECAUCIÓN: No agregue soluciones ácidas o lejía directamente a los residuos de preparación de muestras. Sales de guanidina presentes en Lysis buffer B y Wash buffer X cuando se combinan con lejía o ácidos, pueden producir compuestos altamente reactivos.
   1. Tampone de lavado Y: Mezcle bien 12 ml de concentrado Wash Buffer Y con etanol de 48 ml (96-100%) para obtener 60 ml de lavado de trabajo Buffer Y. Almacenar a temperatura ambiente.
      NOTA: 60 mL de lavado de trabajo Buffer Y es suficiente para procesar 100 muestras de capa de buffy y es estable durante 1 año.
   2. Proteinasa K: Preparar la solución Proteinase K disolviendo 30 mg de Proteinasa K liofilizada en 1,35 ml de Proteinase Buffer.
      NOTA: La solución de trabajo total de Proteinase K es suficiente para procesar 52 muestras de capa de buffy. La solución de trabajo Proteinase K se puede almacenar durante al menos 6 meses a -20 °C.
2. Pasos antes del inicio del procedimiento
   1. Equilibrar el abrigo buffy a temperatura ambiente.
   2. Ajuste el bloque de calor o el baño de agua a 56 °C.
3. Suspenda la capa buffy en el búfer A de lisis para obtener un volumen final de 200 μL. A continuación, añadir 25 μL de solución Proteinase K, y 200 μL de Lysis buffer B. Mezclar por vórtice e incubar a 70 °C durante 10-15 min. Asegúrese de que las muestras estén completamente cubiertas con la solución de lisis.
   NOTA: Para procesar series de muestras, Proteinase K y Lysis buffer A pueden ser premezclados 10-15 minutos antes del procedimiento, pero ya no antes de eso, ya que Proteinase K se auto-digiere en el búfer de lisis A sin sustrato.
4. Añadir 210 μL de etanol 96–100% a la mezcla y vórtice anteriores vigorosamente.
   NOTA: La adición de etanol puede formar un precipitado encorvado; sin embargo, esto no afectará el aislamiento del ADN. Asegúrese de cargar el precipitado también en la columna, como se muestra en los pasos siguientes.
5. Cargue toda la muestra en la columna de sílice colocada en un tubo de recogida. Centrífuga durante 1 min a 11.000 x g. Coloque la columna en un nuevo tubo de recogida y deseche el tubo anterior junto con el flujo.
   NOTA: Repita el paso de centrifugación si la muestra no se dibuja completamente a través de la matriz.
6. Agregue 500 μL de Wash buffer X, centrífuga durante 1 min a 11.000 x g, y deseche el flujo a través.
7. Coloque la columna en el tubo de recolección, agregue 600 μL de Wash Buffer Y en la columna, centrífuga durante 1 min a 11.000 x g y deseche el flujo.
8. Una vez más, coloque la columna en el tubo de recolección y centrífuga la columna durante 1 min a 20.000 x g para secar la membrana de sílice.
9. Incubar la columna a temperatura ambiente durante 1 min, colocarla en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y luego añadir 100 μL de tampón de elución. Luego, eleje el ADN centrifugando durante 1 min a 11.000 x g y almacenar a -20 °C.

5. Cuantificación del CFDNA y el ADN genómico mediante fluorómetro

1. Antes de iniciar el protocolo, realice los pasos siguientes.
   1. Diluir 2 μL de ADN genómico eluted (del paso 4.9) en proporciones 1:10 con agua libre de nucleasa ultrapura. Debido a las bajas concentraciones esperadas, no diluya las muestras de CFDNA del paso 3.15.
   2. Equilibrar el ensayo Standard #1 y ensayo Standard #2 a temperatura ambiente.
2. Prepare un total de 6 tubos transparentes de paredes delgadas de tamaño de 0,5 ml.
   NOTA: El protocolo presentado es para la cuantificación de 2 muestras de ADN genómico y 2 cfDNA, por lo tanto, 4 tubos para 4 muestras y este ensayo requiere 2 estándares.
3. Etiquete las tapas del tubo.
   NOTA: El etiquetado en el lado del tubo podría interferir con la lectura. Además, los tubos estándar de ensayo están etiquetados cuidadosamente, ya que la calibración del fluorómetro requiere que las normas estén en el orden correcto.
4. Diluya el reactivo del ensayo en 1:200 con el búfer de ensayo para preparar la solución de trabajo. Para 4 muestras y 2 estándares, utilice 6 μL de reactivo de ensayo más 1.194 μL de tampón de ensayo para hacer 1.200 μL (200 μL en cada tubo) de solución de trabajo.
   NOTA: No utilice un recipiente de vidrio, sino que utilice un tubo de plástico limpio. Cada tubo debe contener aproximadamente 200 μL del volumen final (un tubo estándar de ensayo debe contener 190 μL de la solución de trabajo, y el tubo de muestra debe contener 180-199 μL de la solución de trabajo). Se debe preparar una solución de trabajo suficiente para adaptarse a todos los estándares y muestras de ensayo.
5. En los tubos estándar de ensayo de trabajo, agregue 190 μL de solución de trabajo y 10 μL estándar de ensayo y mezcle la solución por vórtice durante 2-3 s. Evite la formación de burbujas dentro de la solución.
6. En los tubos de muestra, añadir 198 μL solución de trabajo y 2 μL de CFDNA o ADN genómico. Mezcle la solución vórtice durante 2-3 s y manténgala incubada a temperatura ambiente durante 2 minutos.
7. En la pantalla'Inicio'del instrumento del fluorómetro, pulse'ADN'y seleccione'Ensayo de alta sensibilidad dsDNA',para mostrar la pantalla'Estándares',luego pulse'Sí'en la pantalla del fluorómetro 'Estándares' para leer los estándares.
8. En la cámara de muestra, inserte el ensayo Estándar #1 tubo, cierre la tapa y pulse 'Leer'. Retire el tubo una vez finalizada la lectura (aproximadamente 3 s) y repita el mismo paso para #2 estándar.
9. Se muestra una pantalla de muestra después de la finalización del proceso de calibración, luego inserte un tubo de muestra y repita el paso '5.8'. A continuación, la "pantalla de muestra" mostrará un valor que corresponde a la concentración de la muestra después de la dilución en el tubo de muestra.
10. Para cada paso de repetición de muestra '5.9', hasta que se lean todas las muestras.
11. Utilice la siguiente ecuación para calcular la concentración real de la muestra.
    
    NOTA: Los valores de ensayo están en ng/mL y corresponden a la concentración después de la dilución en el tubo de ensayo. Ecuación mencionada en el paso anterior 5.11, valor QF es el valor dado por el instrumento fluorómetro, y x es el número de microlitros de muestra añadidos al tubo de ensayo. Las unidades para los valores QF generados por la ecuación son similares al valor proporcionado por el fluorómetro. Por ejemplo, si el valor del fluorómetro está en ng/mL, las unidades para la concentración calculadas por la ecuación son ng/mL.

6. Distribución del tamaño del fragmento de ADN de cfDNA por analizador de fragmentos

1. El paso antes de iniciar el procedimiento: Equilibrar el concentrado de tinte de ADN y la matriz de gel de ADN a temperatura ambiente durante 30 minutos.
2. Preparación de la mezcla de tinte de gel
   PRECAUCIÓN: Manejar soluciones con precaución como DMSO se sabe para facilitar la entrada de moléculas orgánicas en los tejidos.
   1. Descongelar completamente el DMSO vórtice el vial concentrado de tinte de ADN durante 10 s. Pipetear 15 μL de este concentrado en un vial de matriz de gel de ADN y almacenar a 4 °C en la oscuridad.
   2. Una vez más, vórtice el vial tapado durante 10 s hasta que se visualiza la mezcla del gel y el tinte.
   3. Vierta la mezcla en un filtro de giro en el receptáculo superior.
   4. Microcentrífuga el filtro de espín a 2.240 x g ± 20% durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   5. Etiquete el tinte de gel preparado en el tubo y deseche el filtro, según buenas prácticas de laboratorio. Etiquete el tubo y registre la fecha de preparación.
      NOTA: Deseche el filtrado según buenas prácticas de laboratorio. La mezcla de tinte de gel se puede utilizar para 5 chips de ADN de alta sensibilidad (SA). Si no se utiliza durante más de 1 h, guárdelo a 4 °C. El almacenamiento en la oscuridad es posible hasta 6 semanas.
3. Para cargar la mezcla de tinte de gel, asegúrese de la posición de la placa base de la estación de cebado de viruta y ajuste el clip en la posición más baja.
   1. Eequilibra la mezcla de tinte de gel a temperatura ambiente durante 30 minutos, mientras monitorea la exposición a la luz.
   2. Tome un nuevo chip de ADN HS de una bolsa sellada y colóquelo en la estación de cebado de virutas, luego retire 9.0 μL de la mezcla de tinte de gel y prescinda en la parte inferior del pozo de chip, marcado como 'G'.
      NOTA: Dibuje la mezcla de tinte de gel, evitando las partículas que pueden acumularse en la parte inferior del vial. Mientras dispensa bien la mezcla de tinte de gel en el chip de ADN HS, inserte la punta de la pipeta por completo, para evitar la formación de grandes burbujas de aire. Además, tocar la pipeta en los bordes del pozo producirá malos resultados.
   3. Coloque el émbolo a 1 ml y cierre la estación de cebado de virutas. Asegúrese de que el bloqueo del pestillo haga clic y establezca el temporizador en 60 s, luego presione el émbolo hacia abajo hasta que esté sujetado por el clip, y exactamente después de 60 s, suelte el émbolo con el mecanismo de liberación del clip.
   4. Cuando el émbolo retroceda al menos a la marca de 0,3 ml, espere 5 s y, a continuación, tire lentamente hacia atrás hasta la posición de 1 ml, luego abra la estación de cebado de virutas y retire de nuevo 9,0 μL de la mezcla de tinte de gel y dispense en la parte inferior del chip de ADN del SA, marcado como 'G'.
4. Para cargar el marcador de ADN, dispense 5 μL del marcador de ADN en el pozo, marcado con el símbolo de escalera. Repita el procedimiento para todos los 11 pozos de muestra.
5. Para cargar la escalera y las muestras, dispense 1 μL de la escalera de ADN en el pozo, marcada con el símbolo de escalera y luego agregue 1 μL de muestra (pozos usados) o 1 μL de marcador (pozos no utilizados) en todos los 11 pozos de muestra.
6. Vórtice el chip de ADN HS para 60 s a 2.400 rpm colocando el chip horizontalmente en el adaptador. Asegúrese de que la protuberancia que fija el chip de ADN del SA no esté dañada durante el vórtice.
7. Para insertar el chip de ADN HS en el instrumento del analizador de fragmentos, abra la tapa y asegúrese de que el cartucho de electrodo esté correctamente insertado, y el selector de virutas se coloca en "DsHigh Sensitivity DNA" en el instrumento del analizador de fragmentos.
8. Monte cuidadosamente el chip de ADN del SA en el receptáculo, que sólo cabe de una manera, luego pierda la tapa asegurándose de que el cartucho de electrodo se ajuste exactamente a los pozos del chip de ADN del SA.
9. La pantalla en la pantalla de software del analizador de fragmentos indica el chip de ADN HS insertado y la tapa cerrada, a través del icono de chip en la parte superior izquierda de la pantalla.
10. Para iniciar la ejecución del chip de ADN del SA, seleccione el ensayo de alta sensibilidad dsDNA en el menú'Ensayo'en la pantalla del instrumento, luego llene correctamente la tabla de nombres de muestra alimentando información como nombres de muestra y comentarios e inicie la ejecución del chip haciendo clic en el botón'Inicio' en la parte superior derecha de la pantalla.
11. Limpieza de electrodos después de una carrera de chip de ADN del SA: Retire inmediatamente el chip de ADN del SA utilizado, tan pronto como se complete el ensayo y deseche de él de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio. Realice el siguiente procedimiento para garantizar que los electrodos estén limpios, sin restos de residuos del ensayo anterior.
    1. Llene lentamente 350 μL de agua de grado de análisis desionizado en uno de los pozos limpiadores de electrodos y coloque el limpiador de electrodos en el instrumento del analizador de fragmentos abriendo la tapa y luego cierre la tapa y espere unos 10 s.
    2. Retire el limpiador de electrodos abriendo la tapa y espere otros 10 s, para que el agua de los electrodos se evapore antes de cerrar la tapa.

Resultados

Separación por plasma
8.5-9 mL de sangre recolectada en tubos conservantes cfDNA o cfRNA produce alrededor de ~4 ml de plasma en volumen. El volumen de plasma separado de la sangre recolectada en tubos EDTA puede variar dependiendo de la temperatura. La exposición de tubos EDTA que contienen sangre a una temperatura superior a 37 °C conduce a una disminución del rendimiento del volumen plasmático⁴⁴.

Resultados del ensayo del fluorómetro...

Discusión

La recolección de sangre de un paciente en un tubo, envío y almacenamiento son pasos iniciales cruciales en la biopsia líquida. El manejo inadecuado puede afectar la calidad del plasma y, por lo tanto, puede interferir con los resultados de la biopsia líquida^47. Si se recoge una muestra de sangre en un tubo sanguíneo EDTA, el plasma debe separarse dentro de las dos horas posteriores a la recolección de sangre para evitar la lisis de los WBC y liberar su ADN genómico en el plasma

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C