암 환자의 혈장 샘플에서 세포없는 DNA 의 검출

요약

이 논문에서 우리는 혈액 수집, 혈장 및 버피 코트 분리, cfDNA 및 생식선 DNA 추출, cfDNA 또는 생식선 DNA의 정량화 및 cfDNA 단편 농축 분석을 포함한 비 침습적 액체 생검 기술에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

초록

암 환자의 종양에 있는 돌연변이를 확인하는 것은 질병 관리에 있는 아주 중요한 단계입니다. 이 돌연변이는 암 환자에 있는 처리 선택 그리고 그것의 반응을 위한 종양 진단을 위한 biomarkers 역할을 합니다. 종양 돌연변이를 검출하기 위한 현재 금 표준 방법은 종양 생검을 통해 종양 DNA의 유전 시험을 관련시킵니다. 그러나, 이러한 침습적 방법은 종양 돌연변이 레퍼토리의 후속 시험으로서 반복적으로 수행되기 어렵다. 액체 생검은 사용하기 쉽고 비 침습적 생검 접근법으로 종양 돌연변이를 검출하기위한 새롭고 새로운 기술입니다.

암세포는 급속하게 번식합니다. 동시에, 수많은 암세포는 세포멸을 겪습니다. 이 세포에서 파편은 종양 DNA 돌연변이를 전송하는 세포 없는 DNA (cfDNA) 단편에게 불린 섬세하게 단편화된 DNA 조각과 더불어 환자의 순환 계통으로 풀어 놓입니다. 따라서 액체 생검 기술을 사용하여 cfDNA 기반 바이오마커를 식별하기 위해 혈액 샘플을 암 환자로부터 수집하고 혈장 및 버피 코트의 분리가 뒤따릅니다. 다음으로, 혈장은 cfDNA의 분리를 위해 처리되고, 각각의 버피 코트는 환자의 게놈 DNA의 분리를 위해 처리된다. 두 핵산 샘플은 그 때 그들의 양과 질을 위해 검사됩니다; 차세대 염기서열분석(NGS) 기술을 이용한 돌연변이를 분석하였다.

이 원고에서는 혈액 수집, 혈장 및 버피 코트 분리, cfDNA 및 생식선 DNA 추출, cfDNA 또는 생식선 DNA의 정량화 및 cfDNA 단편 농축 분석을 포함한 액체 생검에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

서문

기술 발전은 암 게놈 과 전사^1의수백의 순서로 이끌어 냈습니다. 이것은 다른 암 모형^2에걸쳐 분자 변경의 풍경을 이해하는 데 기여했습니다. 이러한 경관에 대한 추가 연구는 암 또는 종양 진행에 관여하는 순차적인 체세포 변경 및 유전자 유전자 융합^3을 특징으로 하는 데 도움이 되었으며, 세포멸 경로^4를연속적으로 방해함으로써. 따라서, 체세포 돌연변이 및 유전자-유전자 융합은 특정 종양 유형^5에대한 개별 환자에서 바이오마커로 봉사하여 종양에 대한 정보를 제공할 수 있고, 기존의 1차 종양 예후^6을식별하고, 분자^변화에기초하여 이차 종양을 분류하고, 약물 종양^표적8을식별한다. 이러한 정보는 암 환자를 위한 개인화된 치료를 선택하고 양성 및 음성 치료 반응을 결정하는 데 용이하게 할 수 있습니다^9. 그러나, 종양 조직의 유전체 프로파일링을 식별하기 위한 종양 물질을 얻는 것은 침습적^{절차(10)이다.} 더욱이, 종양 생검은 이질성 종양의 작은 부분만을 포함합니다; 따라서 전체^{종양(11)의}분자 프로파일을 대표하지 않을 수 있다. 연쇄 모니터링 및 종양 지장화는 종양 조직의 반복된 수집을 필요로 하며, 이는 일반적으로 종양 생검 절차의 침습성 및 이러한 절차로부터 발생하는 안전 문제로 인해 실현 가능하지^않다(12).

반면에 액체 생검 기술은 지난 10년 동안 정밀 종양학에서^13,14로엄청난 주목을 받고 있습니다. 주로 이 기술의 비침습성, 그리고 여러 시간 지점에서 반복될 가능성으로 인해 질병^{과정(15,16)에}대한 사용하기 쉽고 안전한 모니터링 기술을 가능하게 한다. 액체 생검은 종양 세포가 급속하게 증식하는 현상에 근거하고, 동시에 그들 중 많은 사람들이 세포증과 괴사를 겪는다. 이것은 apoptosis¹⁷도중 정확한 크기로 절단되는 DNA 파편과 더불어 환자의 혈액으로 세포 파편의 방출로 이끌어 냅니다. 비암 세포의 세포 이물질의 방출은 또한 혈액으로 의 세포 파편의 방출로 이끌어 내고, 그러나, 이 세포에 있는 세포 세포 비율은 종양 세포¹⁸보다는 상대적으로 훨씬 낮습니다. 액체 생검 기술의 합리적은 혈액에서 지속적으로 순환하는 DNA, RNA, 단백질 및 종양 세포^14,19와 같은 종양 관련 분자를 포착하는 것입니다. 다양한^{기술(20)은} 차세대 시퀀싱(NGS), 디지털 물방울 폴리머라제 연쇄 반응(ddPCR), 실시간 PCR 및 효소-연결된 면역조산 분석(ELISA)을 포함하는 이들 분자의 분석에 사용될 수 있다. 액체 생검 기술은 종양 세포의 특징인 바이오마커를 식별할 수 있게 합니다. 이러한 바이오마커 분자는 종양의 특정 부위에서 방출되는 것이 아니라^{종양(21)의}모든 부분에서 방출된다. 따라서, 액체 생검에서 확인된 마커는 전체 이질성 종양의 분자 프로파일링을 나타내며, 신체의 다른 종양 이외에, 따라서 조직 생검 기반^{기술(22)에}비해 이점을 갖는다.

cfDNA는 몇 분에서 1-2 시간^23에이르는 순환 혈액에서 짧은 반감기 시간을 가지고 있습니다. 그러나 cfDNA의 짧은 반감기 시간은 치료 반응 및 동적 종양 평가를 평가하여 실시간 분석을 용이하게합니다. 종양 유래 cfDNA 수준은 cfDNA 수준과 생존 결과²⁴사이의 관계를 보여 준 여러 연구에 의해 입증 된 종양 단계 / 크기의 예후를 나타냅니다. 더욱이, 연구 결과는 cfDNA가 기존 종양 마커^25보다는더 나은 예측 능력을 가지고 있다는 것을 증명했습니다. cfDNA의 예후는 암 치료 후에 더욱 두드러지며, 치료 후 cfDNA의 높은 수준은 생존율이 감소되고 치료에 대한 저항과 잘 관련이 있습니다. 반면, cfDNA 다음 치료법의 낮은 수준은 일반적으로 양성 치료 반응에 해당합니다. 또한 cfDNA는 기존의 검출 방법보다 치료 반응의 조기 검출을 용이하게 합니다.

cfDNA는 암 관련 돌연변이의 조기 발견 가능성을 증가시킵니다: 초기 단계 질병¹⁵도중, 현상의 개시²⁶ 및 2 년 까지 암 진단 의 앞에^{2년 27까지.} cfDNA는 다중 종양 영역 또는 초점으로부터 방출되기 때문에, 그 분석은^28을나타내는 종양 게놈의 포괄적인 보기를 제공한다. 따라서, cfDNA는 조직 견본^29에서놓쳤을 지도 모르다 체질 돌연변이를 검출할 수 있습니다. 종양 내 이질성 및 과열 돌연변이는 수천 개의 염기에 걸쳐 게놈 영역의 깊은 시퀀싱에 의해 검출될 수 있으므로, 따라서 cfDNA의 분석은 뚜렷한 게놈^{시그니처(13)를}가진 특정 분자 아류형을 발견할 수 있게 한다. 조직 샘플을 통해 유사한 수준의 정보를 얻으려면 많은 고체 생검이 필요했을 것입니다.

더욱이, 수술 치료 및/또는 화학요법 후 결장, 난소 및 폐암과 같은 국소질환 환자의 cfDNA 수준은 암 재발 및 치료 결과에 대한 강력한 예후 마커로^{입증되었다(20).} 더욱이, 결장, 유방 및 폐암환자에서, 혈액에서 cfDNA의 분석은 성공적으로 종양 특정 변경을 검출할 수 있었습니다, 이는 사전에 재발의 정확한 예측으로 이끌어^13. 더욱이, 항EGFR 요법을 받는 CRC 환자에서 KRAS 돌연변이와 같은 치료 저항^마커(30); 다양한 치료법으로 치료 후 유방암 환자에서 PIK3CA, MED1 또는 EGFR과 같은 유전자를 위한 VAFs(31); EGFR 표적^TKIs(32)로 치료된 폐암 환자에서 EGFR T790M 저항돌연변이도 cfDNA 분석에 의해 확인될 수 있다.

요약하자면, cfDNA 분석은 종양학^{13, 33의}분야에서 정확한 바이오마커를 식별하는 데 사용될 수 있다. 이 프로토콜에서, 3개의 신경교종 환자의 혈액 샘플 및 3개의 건강한 통제는 혈장에서 WbCs 및 cfDNA에게서 게놈 DNA를 얻기 위하여 처리되었습니다. 신경교암에서, IDH, TERT, ATRX, EGFR 및 TP53의 돌연변이는 신경교종 종양의 조기 진단에 도움이 될 수 있는 예후 마커뿐만 아니라 진단역할을 하며, 다른 유형의 신경교종 종양을 분류하고, 개별 환자를 위한 정확한 치료를 안내하고 치료 반응^34,35을이해한다. 이 유전자의 돌연변이 상태는 혈액 유래 cfDNA를 사용하여 확인할 수 있습니다. 본 원고에서는, 우리는 신경교종 암^(12)에있는 돌연변이 변경을 공부하기 위해 이용된 혈장 유래 cfDNA의 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 문서에서 설명된 이러한 cfDNA 기반 액체 생검 프로토콜은 다른 많은 유형의 암에서 돌연변이 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 최근 연구는 cfDNA 기지를 둔 액체 생검이 암^36의50의 다른 모형을 검출할 수 있다는 것을 보여주었습니다.

혈액 샘플 수집, 저장 및 선적은 이러한 단계 동안 제어되지 않은 온도가 WBC의 리시스를 일으켜 WBC에서 혈장으로 게놈 DNA를 방출하고 cfDNA 샘플의 오염을 유발하기 때문에 이 프로토콜에서 중요한 단계이며, 이는^{절차(37)의}나머지 부분에 영향을 미친다. 제어되지 않은 온도로 인한 혈류용액은 PCR^{단계(38)와}같은 cfDNA의 하류 시료 준비 과정을 손상시킬 수 있다. 혈청은 혈장보다는 생식선 cfDNA의 높은 비율을 포함하지만 종양 관련 cfDNA^39에대한 큰 배경 잡음이 나타난다. 따라서 종양 관련 cfDNA를 분리하기 위해 혈장은 적합한^{샘플(39)이다.} 혈액 수집 튜브를 포함하는 항 응고제에서 그려진 혈액은 플라즈마를 분리하고 cfDNA 오염을 피하기 위해 즉시 또는 최대 2 시간 이내에 원심 분리되어야합니다. 이 프로토콜에서, 전용 상용 cfDNA 보존 혈액 수집 튜브가 사용됩니다 (재료의 표참조), 이는 혈액 수집 튜브를 포함하는 항응고제에 대한 대안이다. 이러한 전용 혈액 수집 튜브는 cfDNA 및 cfRNA를 보존하고, 주변 온도에서 최대 30일, 최대 8일 동안 37°C에서 WbC의 용액을 방지합니다. 이를 통해 혈액 샘플 선적 시 및 플라즈마 및 WBC가 분리될 때까지 적절한 온도를 유지할 수 있습니다^40.

현재 사용 가능한 cfDNA 추출 방법론에는 위상 격리, 실리콘 멤브레인 기반 스핀 컬럼 및 자기 비드 기반^{절연(41)의}세 가지 유형이 있습니다. 실리콘 멤브레인 기반 스핀 컬럼 방법은 다른 cfDNA 추출 방법에 비해 높은 무결성을 가진 높은 양의 cfDNA를^{산출하였다(42).}

DNA의 정량적 평가는 액체 생검의 근본적인 요구 사항이며, 쉽게 구현하고 광범위한 사용을 위해 간단하고 저렴하며 표준화 된 절차를 개발할 필요가 있습니다. cfDNA 정량화를 위해 일반적으로 사용되는 세 가지 방법은 분광광측정, 형광및 qPCR이다. 불소측정 방법은 정확도, 비용 및 전도의 용이성에 관한 다른 방법에 대해 더 잘^{입증된다(43)}.

cfDNA의 무결성과 순도는 아가로즈 전기포고증 또는 모세관 전기포에 의해 추정될 수 있다. 아가로스 전기 포근은 cfDNA의 낮은 농도에서 감도를 나타내지 않으며 cfDNA의 정확한 단편 크기를 표시하는 고해상도가 없습니다. 한편, 모세관 전기포는 관련 과제를 극복함으로써 아가로산 전기포에 비해 이점이 있으며, 따라서 연구원이 cfDNA 단편 크기 분석을 위해 널리 사용되고 있다. 이 프로토콜에서, 절연 된 cfDNA의 단편 크기 분포는 자동화 된 모세관 전기 포근 계측기를 사용하여 추정되었다 (재료의 표참조).

프로토콜

혈액 수집 전에 연구에 참여하는 과목의 정보에 입각한 동의가 필요하며 반드시 얻어야 합니다. 이 원고에 설명 된 연구는 라빈 의료 센터, 이스라엘 윤리위원회 (윤리 코드 : 0039-17-RMC)와 의학 교수 Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, 독일 윤리위원회 (윤리 코드: D 405/14)에 따라 수행되었다.

1. cfDNA 또는 cfRNA 방부제 관에 혈액 샘플 수집 및 저장

1. 보존 튜브에 적절하게 라벨을 부착
2. 아래설명과 같이 정맥류에 대한 표준 기관 프로토콜에 따라 혈액 수집 세트 및 홀더를 사용하여 cf-DNA 보존 튜브(재료 표참조)로 혈액의 8mL를 수집합니다.
   참고: 혈액 수집 세트를 사용하면 튜브에서 혈액의 가능한 역류를 방지 할 수 있습니다.
   1. 환자를 아래쪽 위치에서 팔과 정렬합니다.
   2. 튜브 내용이 캡이나 바늘 끝을 만지지 않도록하면서 캡이 위쪽으로 향하고 있는 튜브를 똑바로 잡습니다.
   3. 혈액이 튜브안으로 흐르기 시작하면 지혈대를 천천히 놓습니다.
3. 튜브가 혈액으로 채워진 직후 (최대 용량 : 8.4 mL의 전혈), 부드럽게 튜브를 반전 (튜브를 잡고있는 팔의 손목을 180 ° 하향 및 뒤로 돌리기) 샘플을 안정화시키기 위해 5 번.
   참고: 반전은 방부제가 샘플과 균일하게 혼합되도록 합니다. 그러나 플라즈마 제제 전에도 내용을 다시 흔들지 마십시오. 혈액 샘플과 방부제의 부족 한 혼합 내용물의 불안정과 마이크로 혈전 또는 혈동의 형성에 이르게. 이 단계에서, 프로토콜은 플라즈마 분리 또는 혈액 으로 채워진 튜브를 위해 즉시 계속될 수 있으며 주변 온도 (15-25 °C)에서 최대 30 일 동안 기다릴 수 있으며 37 °C에서 최대 8 일을 기다릴 수 있습니다.

2. 플라즈마 및 버피 코트 분리 및 보관

1. 혈장 분리를 위해 실온에서 20 분 동안 425 x g의 혈액 채워진 보존 튜브를 원심 분리합니다.
   참고: 단계 2.2 및 2.3은 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.
2. 하층층을 방해하지 않고 1mL 알리쿼트의 상플라즈마 층을 신선한 튜브로 조심스럽게 피펫합니다.
3. 버피 코트의 다음 층을 신선한 튜브(레이어가 RBC 펠릿 위의 링으로 표시됨)로 조심스럽게 옮기면서 하층의 RBC를 피합니다.
4. 플라즈마로 3단계로 진행하고 버피 코트로 4단계로 진행합니다. 필요한 경우 분리된 내용을 -80°C에 저장합니다.

3. 플라즈마 1mL에서 순환 cfDNA의 정화

참고: 이 단계는 상용 키트로 수행됩니다(재료 표참조). 모든 버퍼는 키트와 함께 제공됩니다.

1. 버퍼 및 시약 준비
   주의: 산성 솔루션이나 표백제를 시료 준비 폐기물에 직접 첨가하지 마십시오. 표백제 또는 산과 결합하면 리시스 완충제, 결합 완충제 및 세척 버퍼-1에 존재하는 Guanidine 염은 반응성이 높은 화합물을 생성할 수 있습니다.
   1. 바인딩 버퍼: 결합 버퍼 농축액 300mL을 100% 이소프로판올의 200mL로 혼합하여 500mL의 작업 바인딩 버퍼를 만듭니다. 실온에서 보관하십시오.
      참고: 결합 버퍼는 실리카 막에 순환 핵산의 최적의 결합을 허용합니다. 결합 버퍼의 500mL는 각각 1, 2, 3, 4 또는 5 mL의 1, 2, 3, 4 또는 5 mL의 276, 138, 92, 69 또는 55 샘플을 처리하기에 충분하며 실온에서 1 년 동안 안정적입니다.
   2. 워시 버퍼-1: 워시 버퍼-1 농축액 19mL을 96-100% 에탄올25mL로 혼합하여 44mL의 워시 버퍼-1을 만듭니다. 실온에서 보관하십시오.
      참고: 세척 버퍼-1은 실리카 멤브레인에 바인딩된 오염 물질을 제거합니다. 44mL의 워시 버퍼-1은 플라즈마 1/2/3/4/5 mL의 73개의 샘플을 처리하기에 충분하며 실온에서 1년 동안 안정적입니다.
   3. 워시 버퍼-2: 13mL 워시 버퍼-2 농축액을 96-100% 에탄올30mL로 잘 섞어 43mL의 워시 버퍼-2를 만듭니다. 실온에서 보관하십시오.
      참고: 세척 버퍼-2는 실리카 멤브레인에 바인딩된 오염 물질을 제거합니다. 43mL의 워시 버퍼-2는 플라즈마 1/2/3/4/5mL의 ~56개의 샘플을 처리하기에 충분하며 실온에서 1년 동안 안정적입니다.
   4. 310 μg lyophilized 캐리어 RNA를 포함하는 튜브에, 0.2 μg/μL의 캐리어 RNA 용액을 준비하기 위하여 1,550 μL의 용출 버퍼를 추가합니다. 담체 RNA를 철저히 용해한 후 용액을 적합한 알리쿼트로 나누고 -30°C에서 -15°C로 저장합니다. 이 알리코를 3번 이상 동결해동하지 마십시오. 표 S1에도시된 바와 같이, 리시스 버퍼에, 용출 완충제에 용해된 재구성된 담체 RNA를 추가한다.
      참고: 담체 RNA가 리시스 버퍼에 직접 용해되지 않기 때문에 용출 버퍼에서 먼저 용해된 다음 리시스 버퍼에 용해되어야 합니다. 첫째, 실리카 막-핵산 결합은 시료에 존재하는 표적 분자가 거의 없을 때 강화된다. 둘째, 다량의 담체 RNA의 존재로 인해 RNA 분해위험이 감소된다.
2. 격리를 시작하기 전에 컬럼과 샘플을 실온으로 가져와 필요한 경우 멸균 인산염 완충식식염(PBS)으로 샘플 볼륨을 1mL로 조정합니다. 50mL 원심분리기 튜브와 2mL 수집 튜브를 각각 60°C 및 56°C로 포함하는 2개의 수조 또는 가열 블록을 각각 가열합니다.
3. 50mL 원심분리기 튜브에, 100 μL의 Proteinase K, 1 mL 플라즈마 및 0.8 mL의 리시스 버퍼를 추가하여 담체 RNA의 1.0 μg를 함유한다(단계 3.1.4에서 제조). 원심분리관을 캡으로 닫고 30초 동안 펄스 소용돌이를 혼합하고 튜브에 보이는 소용돌이를 보장합니다. 내용물의 철저한 혼합은 효율적인 용해에 중요합니다.
   참고: 소용돌이 가 끝난 직후, 3.4단계로 진행하십시오.
4. 용액을 60°C에서 30분 동안 배양합니다.
5. 캡을 제거하고, 튜브에 바인딩 버퍼의 1.8 mL을 추가하고, 캡을 배치 한 후 15-30 초 펄스 소용돌이와 철저히 혼합하십시오.
6. 생성된 혼합물을 얼음에 5분 동안 배양하고 진공 펌프에 연결된 진공 장치에 실리카 멤브레인 컬럼을 삽입합니다. 그런 다음 20mL 튜브 익스텐더를 열린 컬럼에 단단히 삽입하여 샘플 누출을 방지합니다.
7. 컬럼의 튜브 익스텐더에 인큐베이션된 혼합물을 조심스럽게 붓고 진공 펌프를 켭니다. 모든 lysate 혼합물이 컬럼을 완전히 통과한 후 진공 펌프를 끄고 압력을 0mbar로 방출하고 튜브 익스텐더를 제거하고 버립니다.
   참고: 교차 오염을 방지하려면 튜브 익스텐더를 조심스럽게 폐기하여 인접한 기둥위로 확산되는 것을 방지해야 합니다.
8. 진공 장치에서 컬럼을 제거하고, 수집 튜브에 삽입하고, 원심분리기는 실온에서 30초 동안 11,000 x g로 삽입하여 잔류 용액을 제거합니다. 흐름을 삭제합니다.
9. 열에 600 μL의 워시 버퍼-1을 추가하고, 원심분리기는 실온에서 1분 동안 11,000 x g로, 유동을 폐기합니다.
10. 열에 750 μL의 워시 버퍼-2를 추가하고, 원심분리기는 실온에서 1분 동안 11,000 x g로 추가하고 유동을 폐기합니다.
11. 에탄올 750 μL 추가 (96-100%) 컬럼에 원심분리기는 실온에서 1분 동안 11,000 x g의 원심분리기를 제거하고 흐름을 폐기합니다.
12. 깨끗한 2mL 수집 튜브에 배치하여 3 분 동안 20,000 x g의 컬렉토리를 원심 분리합니다.
13. 뚜껑을 열고 10 분 동안 56 °C에서 배양하여 새로운 2 mL 수집 튜브에 배치하여 멤브레인 컬럼 조립을 완전히 건조하십시오.
14. 깨끗한 1.5mL 용출 튜브에 컬럼을 놓습니다. 컬럼 멤브레인의 중앙에 20-150 μL의 용출 버퍼를 적용하고 뚜껑을 닫고 3 분 동안 실온에서 배양하십시오.
    참고: 용해 버퍼가 실온과 평형되었는지 확인합니다. 50 μL 미만의 용출 버퍼를 사용하는 경우 멤브레인의 중앙에 신중하게 분배되도록 하십시오. 이것은 결합된 DNA의 완전한 용출에 도움이 됩니다. 그러나 용출 볼륨은 고정되지 않으며 다운스트림 응용 프로그램에 따라 변경할 수 있습니다. 회수된 용출은 최대 5μL일 수 있으며 컬럼에 적용된 용출 부피보다 확실히 적을 수 있습니다.
15. 원심분리기는 20,000 x g에서 미세원심분리기에서 회복된 용액을 1분 동안 1분 동안 유산하여 핵산을 엘로우우고 -20°C에 저장한다.

4. 버피 코트에서 게놈 DNA의 정화

참고: 이 프로토콜에 사용되는 상용 키트는 재료 표에언급됩니다. 아래 프로토콜에 언급된 버퍼 및 시약은 리시스 버퍼 A, 리시스 버퍼 B, 워시 버퍼 X, 워시 버퍼 Y, 프로틴타제 버퍼, 용출 버퍼 및 Proteinase K가 이 상용 키트의 일부입니다.

1. 버퍼 및 시약 준비
   주의: 산성 솔루션이나 표백제를 시료 준비 폐기물에 직접 첨가하지 마십시오. 표백제 또는 산과 결합될 때 리시스 버퍼 B 및 워시 버퍼 X에 존재하는 Guanidine 염은 반응성이 높은 화합물을 생성할 수 있습니다.
   1. 워시 버퍼 Y: 48mL 에탄올(96-100%)으로 워시 버퍼 Y 농축액 12mL을 잘 섞습니다. 실온에서 60mL의 작업 세척 버퍼 Y. 저장을 얻습니다.
      참고: 60mL의 워시 버퍼 Y는 100개의 버피 코트 샘플을 처리하기에 충분하며 1년 동안 안정적입니다.
   2. Proteinase K: 단백질제제 K 30 mg의 리오필화 된 단백질 을 1.35 mL의 Proteinase 버퍼로 용해하여 Proteinase K 용액을 준비하십시오.
      참고: Proteinase K의 총 작업 용액은 52개의 버피 코트 샘플을 처리하기에 충분합니다. Proteinase K 작업 용액은 -20 °C에서 적어도 6 개월 동안 저장할 수 있습니다.
2. 절차 개시 전 단계
   1. 버피 코트를 실온에 상평화합니다.
   2. 열 블록 또는 수조를 56 °C로 설정합니다.
3. 200 μL의 최종 부피를 얻기 위해 리시스 버퍼 A에서 버피 코트를 일시 중단합니다. 그런 다음 Proteinase K 용액의 25 μL, 그리고 200 μL의 리시스 버퍼 B. 10-15 분 동안 70 °C에서 소용돌이및 인큐베이션을 혼합합니다. 샘플이 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인합니다.
   참고: 일련의 시료를 처리하기 위해, Proteinase K 및 Lysis 버퍼 A는 시술 전에 10-15 분 전에 미리 혼합될 수 있지만, 더 이상 그 전에는 단백질아제 K자가 기판 없이 리시스 버퍼 A에서 자체 소화로 사용되지 않습니다.
4. 위의 혼합물에 96-100% 에탄올의 210 μL을 넣고 소용돌이를 적극적으로 넣습니다.
   참고: 에탄올을 첨가하면 끈적끈적한 침전을 형성할 수 있습니다. 그러나, 이것은 DNA 격리에 영향을 미치지 않을 것입니다. 다음 단계와 같이 열에 침전물도 로드해야 합니다.
5. 전체 샘플을 수집 튜브에 배치된 실리카 컬럼에 로드합니다. 원심분리기 11,000 x g에서1분 동안. 컬럼을 새 컬렉션 튜브에 놓고 흐름통과 함께 이전 튜브를 폐기합니다.
   참고: 샘플이 매트릭스를 통해 완전히 그려지지 않으면 원심 분리 단계를 반복합니다.
6. 워시 버퍼 X 500 μL, 원심분리기 는 11,000 x g에서 1분 동안 추가하고 흐름을 폐기합니다.
7. 컬럼을 수집 튜브에 넣고, 600 μL의 워시 버퍼 Y를 열에 넣고, 원심분리기는 11,000 x g에서 1분 동안 원심분리기를 추가하고 흐름을 폐기합니다.
8. 다시, 수집 튜브에 컬럼을 배치하고, 실리카 멤브레인을 건조하기 위해 20,000 x g에서 1 분 동안 컬럼을 원심 분리합니다.
9. 1 분 동안 실온에서 컬럼을 배양하고 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브에 넣은 다음 100 μL의 용출 버퍼를 추가합니다. 이어서, 11,000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 DNA를 엘테우고 -20°C에 보관한다.

5. 형광계를 사용하여 cfDNA 및 게놈 DNA의 정량화

1. 프로토콜을 시작하기 전에 다음 단계를 수행합니다.
   1. 초순수 뉴클레아제없는 물로 1:10 비율로 용출 된 게놈 DNA (4.9 단계에서)의 2 μL을 희석하십시오. 예상되는 낮은 농도로 인해 3.15 단계에서 cfDNA 샘플을 희석시키지 마십시오.
   2. 분석 표준 #1 및 분석 표준 #2 실온에 대해 평형화합니다.
2. 0.5mL 크기의 총 6개의 얇은 벽의 클리어 튜브를 준비합니다.
   참고: 제시된 프로토콜은 2cfDNA 및 2개의 게놈 DNA 견본의 정량화를 위한 것입니다, 그러므로, 4개의 견본을 위한 4 개의 관 및 이 분석은 2개의 기준이 필요합니다.
3. 튜브의 뚜껑에 라벨을 지정합니다.
   참고: 튜브 측면에 라벨을 부착하면 판독이 방해될 수 있습니다. 또한, 분석 표준 튜브는 형광계의 보정을 요구하므로 표준이 올바른 순서로 표시되기 때문에 신중하게 표시됩니다.
4. 분석 시약을 1:200에 분석 버퍼로 희석하여 작업 용액을 준비합니다. 4개의 샘플 및 2개의 표준에 대해, 분석 시약 6μL과 1,194μL의 분석 버퍼를 사용하여 작업 용액의 1,200 μL(각 튜브의 200 μL)을 만듭니다.
   참고: 유리 용기를 사용하지 말고 깨끗한 플라스틱 튜브를 사용하십시오. 각 튜브는 최종 부피의 약 200 μL을 포함해야 합니다(분석 표준 튜브는 작동 용액의 190 μL을 포함해야 하며, 샘플 튜브는 작업 용액의 180-199 μL을 포함해야 합니다). 모든 분석 표준 및 샘플을 수용할 수 있는 충분한 작업 솔루션을 준비해야 합니다.
5. 작동 분석 표준 튜브에서 190 μL의 작업 용액과 10 μL 분석 표준을 추가하고 2-3 s용으로 용해를 혼합합니다. 솔루션 내에서 거품의 형성을 피하십시오.
6. 샘플 튜브에서 198 μL 작업 용액과 cfDNA 또는 게놈 DNA의 2 μL을 추가합니다. 2-3초 동안 용액을 섞어 실온에서 2분 동안 배양하여 보관하십시오.
7. '홈'화면형 형광계 기기의 화면,'DNA'를누르고 'dsDNA 고감도 분석'을선택하여 '표준'화면을 표시한 다음 '예'를플루오로미터표준화면에서 표준으로 읽어보세요.
8. 샘플 챔버에서 분석 표준 #1 튜브를 삽입하고 뚜껑을 닫고'읽기'를누릅니다. 판독이 완료되면 튜브를 제거하고(약 3s) 표준 #2 대해 동일한 단계를 반복합니다.
9. 보정 프로세스가 완료된 후 샘플 화면이 표시되고 샘플 튜브를 삽입하고 '5.8'을 반복합니다. 그런 다음 "샘플 화면"은 샘플 튜브에서 희석 후 샘플의 농도에 해당하는 값을 표시합니다.
10. 각 샘플 반복 단계 '5.9'에 대해 모든 샘플을 읽을 때까지.
11. 다음 방정식을 사용하여 샘플의 실제 농도를 계산합니다.
    
    참고: 분석 값은 ng/mL에 있으며 분석 관에서 희석 후 농도에 해당합니다. 상기 단계 5.11에서 언급된 방정식5.11, QF 값은 플루오로미터 계측기에서 주어진 값이며, x는 분석관에 첨가된 시료의 마이크로리터의 개수이다. 방정식에 의해 생성된 QF 값의 단위는 형광계에서 제공하는 값과 유사합니다. 예를 들어, 형광계의 값이 ng/mL인 경우, 방정식에 의해 계산된 농도에 대한 단위는 ng/mL이다.

6. 단편 분석기에 의한 cfDNA의 DNA 단편 크기 분포

1. 절차를 시작하기 전에 단계 : 30 분 동안 실온에 DNA 염료 농축액 및 DNA 젤 매트릭스를 평형화.
2. 젤 염료 믹스의 준비
   주의: DMSO가 유기 분자를 조직에 유입시키는 것으로 알려져 있으므로 신중하게 솔루션을 처리하십시오.
   1. 10s의 DNA 염료 농축물 유리병을 피류하여 DMSO를 철저히 해동한다. 이 농축물의 15 μL을 DNA 젤 매트릭스 바이알로 피펫하고 어둠 속에서 4 °C에 보관하십시오.
   2. 다시 말하지만, 겔과 염료의 혼합이 시각화 될 때까지 10 s에 대한 덮인 유리병을 소용돌이.
   3. 스핀 필터에 믹스를 상단 리셉터클에 붓습니다.
   4. 2,240 x g의 스핀 필터를 실온에서 10분 동안 20% ± 마이크로센심분리합니다.
   5. 좋은 실험실 관행에 따라 준비된 젤 염료를 튜브에 라벨로 지정하고 필터를 폐기하십시오. 튜브에 라벨을 지정하고 준비 날짜를 기록합니다.
      참고: 좋은 실험실 관행에 따라 여과물을 폐기하십시오. 젤 염료 믹스는 5 가지 고감도 (HS) DNA 칩에 사용할 수 있습니다. 1h 이상 사용하지 않는 경우 4°C에 보관하십시오. 어둠 속에서 보관할 수 있는 최대 6주까지 가능합니다.
3. 젤 염료 믹스를 로드하려면 칩 프라이밍 스테이션의 베이스 플레이트의 위치를 확인하고 클립을 가장 낮은 위치에서 조정합니다.
   1. 젤 염료 믹스를 실온에 30분 간 상화하는 동시에 광 노출을 모니터링합니다.
   2. 밀봉된 가방에서 새로운 HS DNA 칩을 꺼내 칩 프라이밍 스테이션에 넣은 다음 젤 염료 믹스의 9.0 μL을 제거하고 'G'로 표시된 칩 의 바닥에 분배합니다.
      참고: 유리병 의 바닥에 축적 될 수있는 입자를 피하고, 젤 염료 믹스를 그립니다. 젤 염료 믹스를 HS DNA 칩에 잘 분배하는 동안 파이펫 끝을 완전히 삽입하여 큰 기포의 형성을 방지합니다. 또한, 우물의 가장자리에 파이펫을 만지면 결과가 좋지 않습니다.
   3. 플런저를 1mL로 배치하고 칩 프라이밍 스테이션을 닫습니다. 래치 클릭의 잠금을 확인하고 타이머를 60초로 설정한 다음 플런저를 클립에 보관할 때까지 아래로 누릅니다.
   4. 플런저가 적어도 0.3 mL 마크로 후퇴하면 5s를 기다린 다음 천천히 다시 1 mL 위치로 다시 끌어 당기고 칩 프라이밍 스테이션을 열고 다시 젤 염료 믹스의 9.0 μL을 제거하고 HS DNA 칩의 바닥에 분배하여 'G'로 표시합니다.
4. DNA 마커를 로드하려면 DNA 마커의 5 μL을 사다리 기호로 표시된 우물에 분배합니다. 모든 11 개의 샘플 우물에 대한 절차를 반복합니다.
5. 사다리와 샘플을 로드하려면, 잘 DNA 사다리의 1 μL을 분배하고 사다리 기호로 표시된 다음 모든 11 개의 샘플 우물에 1 μL (사용 된 우물) 또는 마커 1 μL (미사용 우물)을 추가합니다.
6. 어댑터에 칩을 수평으로 배치하여 2,400 rpm에서 60 s의 HS DNA 칩을 소용돌이시다. HS DNA 칩을 고정하는 팽창이 소용돌이 중에 손상되지 않았는지 확인합니다.
7. 파편 분석기 기기에 HS DNA 칩을 삽입하려면 뚜껑을 열고 전극 카트리지가 제대로 삽입되었는지 확인하고 칩 선택기는 단편 분석기 기기에서 'dsHigh 감도 DNA'에 배치됩니다.
8. HS DNA 칩을 한 방향으로만 맞는 리셉터클에 조심스럽게 장착한 다음 전극 카트리지가 HS DNA 칩의 우물에 정확히 맞도록 하여 뚜껑을 잃게 됩니다.
9. 조각 분석기 소프트웨어 화면의 디스플레이는 삽입된 HS DNA 칩과 닫힌 뚜껑을 화면 왼쪽 상단의 칩 아이콘을 통해 나타냅니다.
10. HS DNA 칩 실행을 시작하려면 기기 화면에서'분석'메뉴에서 dsDNA 고감도 분석기를 선택한 다음 샘플 이름 및 주석 과 같은 정보를 공급하여 샘플 이름 테이블을 적절히 채우고 화면 오른쪽 상단에 있는'시작' 버튼을 클릭하여 칩 실행을 시작합니다.
11. HS DNA 칩 실행 후 전극 청소: 즉시 사용 된 HS DNA 칩을 제거, 즉시 분석이 완료되자마자 좋은 실험실 관행에 따라 그것을 폐기. 이전 분석기의 잔여물 없이 전극이 깨끗해지도록 다음 절차를 수행합니다.
    1. 탈이온화된 분석급 물의 350μL을 전극 클리너 우물 중 하나에 천천히 채우고 뚜껑을 열고 뚜껑을 닫고 약 10s를 기다립니다.
    2. 뚜껑을 열어 전극 클리너를 제거하고 뚜껑을 닫기 전에 전극의 물이 증발할 때까지 10s를 기다립니다.

결과

플라즈마 분리
cfDNA 또는 cfRNA 방부제 관에서 채취한 8.5-9 mL 혈액은 부피에서 ~4mL 플라즈마 주위의 수율을 냅니다. EDTA 튜브에서 채취한 혈액으로부터 분리된 혈장의 양은 온도에 따라 달라질 수 있다. 37°C 이상의 온도에서 혈액을 함유하는 EDTA 튜브의 노출은 혈장 부피^{수율(44)을}감소시다.

불소계 분석 결과
각 신경교종 환자의 1mL...

토론

튜브, 선적 및 저장에 환자의 혈액의 수집은 액체 생검에 중요한 초기 단계입니다. 부적절한 취급은 플라즈마의 품질을 손상시킬 수 있으므로 액체^{생검(47)의}결과를 방해할 수 있다. 혈액 샘플이 EDTA 혈액 관에서 수집되는 경우, 혈장은 WbCs의 리시스를 피하고^{혈장(48)으로}게놈 DNA를 방출하기 위해 혈액 수집의 2 시간 이내에 분리되어야합니다. WbCs는 또한 더 긴 시...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C