Nachweis zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten

Zusammenfassung

In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll für die nichtinvasive flüssige Biopsietechnik vor, einschließlich Blutentnahme, Plasma- und Buffy-Coat-Trennung, cfDNA- und Keimbahn-DNA-Extraktion, Quantifizierung von cfDNA- oder Keimbahn-DNA und cfDNA-Fragmentanreicherungsanalyse.

Zusammenfassung

Die Identifizierung von Mutationen in Tumoren von Krebspatienten ist ein sehr wichtiger Schritt im Krankheitsmanagement. Diese Mutationen dienen als Biomarker für die Tumordiagnose sowie für die Behandlungsauswahl und deren Reaktion bei Krebspatienten. Die aktuelle Goldstandardmethode zum Nachweis von Tumormutationen beinhaltet einen genetischen Test der Tumor-DNA mittels Tumorbiopsien. Diese invasive Methode ist jedoch nur schwer wiederholt als Folgetest des Tumormutationsrepertoires durchzuführen. Flüssigbiopsie ist eine neue und aufkommende Technik, um Tumormutationen als einfach zu bedienenden und nicht-invasiven Biopsieansatz zu erkennen.

Krebszellen vermehren sich schnell. Parallel dazu erkranken zahlreiche Krebszellen einer Apoptose. Trümmer dieser Zellen werden in das Kreislaufsystem eines Patienten freigesetzt, zusammen mit fein fragmentierten DNA-Stücken, sogenannten zellfreien DNA-Fragmenten (cfDNA), die Tumor-DNA-Mutationen tragen. Daher werden zur Identifizierung von cfDNA-basierten Biomarkern mit flüssiger Biopsietechnik Blutproben von den Krebspatienten entnommen, gefolgt von der Trennung von Plasma und buffy Coat. Als nächstes wird Plasma zur Isolierung von cfDNA und das jeweilige Buffy-Mantel zur Isolierung der genomischen DNA eines Patienten verarbeitet. Beide Nukleinsäureproben werden dann auf ihre Menge und Qualität überprüft; und auf Mutationen mit NGS-Techniken der nächsten Generation analysiert.

In diesem Manuskript stellen wir ein detailliertes Protokoll für die flüssige Biopsie vor, einschließlich Blutentnahme, Plasma- und Buffy-Coat-Trennung, cfDNA- und Keimbahn-DNA-Extraktion, Quantifizierung von cfDNA- oder Keimbahn-DNA und cfDNA-Fragmentanreicherungsanalyse.

Einleitung

Technologische Fortschritte haben zur Sequenzierung von Hunderten von Krebsgenomen und Transkriptomen¹geführt. Dies hat dazu beigetragen, Landschaften molekularer Veränderungen über verschiedene Krebsarten hinweg zu verstehen². Weitere Studien zu diesen Landschaften haben dazu beigetragen, die sequenziellen somatischen Veränderungen und Gen-Gen-Fusionen³ zu charakterisieren, die an Krebs oder Tumorprogression beteiligt sind, indem sie die Apoptosewege seriell stören⁴. Daher können somatische Mutationen und Gen-Gen-Fusionen Informationen über Tumore liefern, indem sie als Biomarker bei einzelnen Patienten für einen bestimmten Tumortyp⁵dienen, bestehende Primärtumoren-Prognose⁶identifizieren, sekundäre Tumoren auf der Grundlage molekularer Veränderungen kategorisieren⁷, und medikamentöse Tumorziele^{identifizieren 8}. Solche Informationen können bei der Auswahl einer personalisierten Behandlung für Krebspatienten und bei der Bestimmung positiver und negativer Behandlungsreaktionen^{erleichtern 9}. Die Gewinnung von Tumormaterial zur Identifizierung der genomischen Profilierung von Tumorgewebe ist jedoch ein invasives Verfahren¹⁰. Darüber hinaus umfasst eine Tumorbiopsie nur einen kleinen Teil eines heterogenen Tumors; und darf daher nicht repräsentativ für das molekulare Profil des gesamten Tumors¹¹sein. Serielle Überwachung und Tumor-Genotypisierung erfordern eine wiederholte Sammlung von Tumorgeweben, was in der Regel aufgrund der Invasivität des Tumorbiopsieverfahrens und der Sicherheitsprobleme, die sich aus solchen Verfahren ergeben, nicht machbar ist¹².

Die flüssige Biopsie-Technik hingegen hat in den letzten zehn Jahren enorme Aufmerksamkeit in der Präzisions-Onkologie erlangt^13,14. Es ist vor allem aufgrund der Nicht-Invasivität dieser Technik, und die Möglichkeit, dass es an mehreren Zeitpunkten wiederholt werden, wodurch eine einfach zu bedienende und sichere Überwachungstechnik für die Krankheitskurse^15,16ermöglicht wird. Die Flüssigbiopsie basiert auf einem Phänomen, dass sich Tumorzellen schnell vermehren und gleichzeitig viele von ihnen apoptosis und nekrose leiden. Dies führt zur Freisetzung von apoptotischen Zellablagerungen in das Blut der Patienten, zusammen mit den DNA-Fragmenten, die bei Apoptose¹⁷in präzisen Größen geschnitten werden. Die Apoptose von nicht-kanzerösen Zellen führt auch zur Freisetzung ihrer zellulären Ablagerungen in das Blut, jedoch ist die Apoptoserate in diesen Zellen relativ viel niedriger als die tumorzellen¹⁸. Der Grund der flüssigen Biopsietechnik besteht darin, tumorassoziierte Moleküle wie DNA, RNA, Proteine und Tumorzellen^14,19 zu erfassen, die kontinuierlich im Blut zirkulieren. Für die Analyse dieser Moleküle können verschiedene Techniken²⁰ verwendet werden, darunter Next-Generation Sequencing (NGS), digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (ddPCR), Echtzeit-PCR und enzymgebundener Immunsorbent-Assay (ELISA). Die Flüssigbiopsietechnik ermöglicht die Identifizierung von Biomarkern, die Merkmale von Tumorzellen sind. Diese Biomarkermoleküle werden nicht nur aus bestimmten Teilen eines Tumors freigesetzt, sondern aus allen Teilen des Tumors²¹. Daher stellen marker, die in der flüssigen Biopsie identifiziert werden, die molekulare Profilierung eines gesamten heterogenen Tumors dar, zusätzlich zu anderen Tumoren im Körper, also Vorteile gegenüber der Gewebebiopsie-basierten Technik²².

Die cfDNA hat eine kurze Halbwertszeit im zirkulierenden Blut von wenigen Minuten bis 1-2 Stunden²³. Die kurze Halbwertszeit von cfDNA ermöglicht jedoch Echtzeitanalysen durch die Bewertung der Behandlungsreaktionen und dynamischen Tumorbewertungen. Die tumorabgeleiteten cfDNA-Spiegel zeigen eine Prognose des Tumorstadiums/der Tumorgröße, die durch mehrere Studien belegt wurde, die einen Zusammenhang zwischen cfDNA-Spiegeln und den Überlebensergebnissen²⁴zeigten. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass die cfDNA eine bessere Vorhersagekapazität als bestehende Tumormarker^{hat 25}. Die Prognose von cfDNA ist nach der Krebsbehandlung noch ausgeprägter, höhere cfDNA-Konzentrationen nach der Behandlung korrelieren gut mit einer reduzierten Überlebensrate und Resistenz gegen die Behandlung. Während niedrigere cfDNA-Werte nach der Therapie im Allgemeinen mit einem positiven Behandlungsverhalten korrespondiert. Darüber hinaus erleichtert die cfDNA die Früherkennung des Behandlungsreaktionens als die herkömmlichen Nachweismethoden.

Die cfDNA erhöht die Möglichkeit der Früherkennung von krebsassoziierten Mutationen: während der Frühstadium-Krankheit¹⁵, das Auftreten der Symptome²⁶ und vor der Krebsdiagnose bis zu 2 Jahre²⁷. Da cfDNA aus mehreren Tumorregionen oder Brennpunkten freigesetzt wird, bietet seine Analyse einen umfassenden Überblick über das Tumorgenom, das²⁸darstellt. Daher ermöglicht die cfDNA, somatische Mutationen zu erkennen, die in den Gewebeproben übersehen worden sein könnten²⁹. Da intratumorliche Heterogenität und subklonale Mutationen durch tiefe Sequenzierung genomischer Regionen, die sich über Tausende von Basen erstrecken, nachgewiesen werden können, ermöglicht die Analyse der cfDNA die Aufdeckung spezifischer molekularer Subtypen mit deutlichen genomischen Signaturen¹³. Um ein ähnliches Maß an Informationen durch Gewebeproben zu erhalten, wären viele feste Biopsien erforderlich gewesen.

Darüber hinaus erwiesen sich die cfDNA-Spiegel bei Patienten mit einer lokalisierten Erkrankung wie Dickdarm-, Eierstock- und Lungenkrebs nach einer chirurgischen Behandlung und/oder Chemotherapie als ein starker prognostischer Marker für das Wiederauftreten von Krebs und die Behandlungsergebnisse²⁰. Darüber hinaus konnten bei Patienten mit Dickdarm-, Brust- und Lungenkrebs Analysen der cfDNA aus dem Blut die tumorspezifischen Veränderungen erfolgreich erkennen, was zur genauen Vorhersage eines Rezidivs mehrere Monate im Voraus¹³führte. Darüber hinaus sind die Behandlungsresistenzmarker, wie KRAS-Mutationen bei Patienten mit CRC, die eine Anti-EGFR-Therapie^{erhalten, 30}; VAFs für Gene wie PIK3CA, MED1 oder EGFR bei Patientinnen mit Brustkrebs nach der Behandlung mit verschiedenen Therapien³¹; und EGFR T790M Resistenzmutation bei Lungenkrebspatienten, die mit EGFR-gezielten TKIs³² behandelt wurden, können auch durch cfDNA-Analyse identifiziert werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die cfDNA-Analyse verwendet werden kann, um präzise Biomarker im Bereich der Onkologie^13,33zu identifizieren. In diesem Protokoll wurden Blutproben von 3 Gliom-Patienten und 3 gesunde Kontrollen verarbeitet, um genomische DNA aus WBCs und cfDNA aus dem Plasma zu erhalten. Bei Gliomkrebs dienen Mutationen bei IDH, TERT, ATRX, EGFR und TP53 als diagnostische sowie prognostische Marker, die bei der Frühdiagnose von Gliomtumoren helfen können, verschiedene Arten von Gliomtumoren zu klassifizieren, die genaue Behandlung für den einzelnen Patienten zu leiten und das Behandlungsverhalten zu verstehen^34,35. Der Mutationsstatus dieser Gene kann mit blutabgeleiteter cfDNA identifiziert werden. In diesem Manuskript stellen wir ein detailliertes Protokoll der plasmaabgeleiteten cfDNA vor, das zur Untersuchung von Mutationsveränderungen bei Gliomkrebs verwendet wurde¹². Ein solches cfDNA-basiertes Flüssigbiopsieprotokoll, das in diesem Artikel erläutert wird, kann zur Untersuchung von Mutationsveränderungen bei vielen anderen Krebsarten verwendet werden. Darüber hinaus hat eine aktuelle Studie gezeigt, dass cfDNA-basierte Flüssigbiopsie 50 verschiedene Krebsarten erkennen kann³⁶.

Die Entnahme, Lagerung und Verbringung von Blutproben sind entscheidende Schritte in diesem Protokoll, da die unkontrollierte Temperatur während dieser Schritte eine Lyse von WBCs verursacht, die zur Freisetzung genomischer DNA aus dem WBC in das Plasma führt und eine Kontamination der cfDNA-Probe verursacht, die den Rest des Verfahrens betrifft³⁷. Hämolyse aufgrund unkontrollierter Temperatur kann nachgeschaltete Probenvorbereitungsprozesse von cfDNA beeinträchtigen, wie z. B. die PCR-Schritte³⁸. Das Serum enthält einen hohen Anteil an Keimbahn cfDNA anstelle von Plasma, obwohl es ein großes Hintergrundrauschen für tumorassoziierte cfDNA³⁹darstellt. Daher ist Plasma zur Isolierung tumorassoziierter cfDNA eine geeignete Probe³⁹. Blut, das in einem mit Blutentnahmeröhrchen haltigen Antikoagulans entnommen wird, sollte sofort oder innerhalb von bis zu zwei Stunden zentrifugiert werden, um das Plasma zu trennen und eine cfDNA-Kontamination zu vermeiden. In diesem Protokoll werden spezielle kommerzielle cfDNA-Konservierungsblutentnahmeröhrchen verwendet (siehe Tabelle der Materialien), die eine Alternative zu gerinnungshemmenden Blutentnahmeröhrchen darstellen. Diese speziellen Blutentnahmeröhrchen bewahren cfDNA und cfRNA und verhindern eine Lyse von WBCs für bis zu 30 Tage bei Umgebungstemperatur und bis zu 8 Tage bei 37 °C. Dies erleichtert die Aufrechterhaltung der entsprechenden Temperatur während einer Blutprobensendung und bis plasma- und WBC-Trennung⁴⁰.

Derzeit gibt es drei Arten von cfDNA-Extraktionsmethoden: Phasenisolierung, Siliziummembran-basierte Spin-Säule und magnetische Perlen-basierte Isolierung⁴¹. Das Siliziummembran-basierte Spinsäulenverfahren lieferte eine hohe Menge an cfDNA mit hoher Integrität im Vergleich zu anderen cfDNA-Extraktionsmethoden⁴².

Die quantitative Auswertung von DNA ist eine grundlegende Anforderung in der flüssigen Biopsie, es besteht die Notwendigkeit, ein einfaches, erschwingliches und standardisiertes Verfahren für ihre einfache Umsetzung und breite Nutzung zu entwickeln. Drei häufig verwendete Methoden zur cfDNA-Quantifizierung sind spektrophotometrische, fluorimetrische und qPCR. Die fluorimetrische Methode ist besser als die anderen Methoden in Bezug auf die Genauigkeit, Kosten und Leichtigkeit der Leitung⁴³.

Die Integrität und Reinheit der cfDNA kann entweder durch Agaroseelektrophorese oder Kapillarelektrophorese geschätzt werden. Die Agarose-Elektrophorese zeigt weder eine Empfindlichkeit bei geringer CfDNA-Konzentration noch hat sie eine hohe Auflösung, um eine genaue Fragmentgröße von cfDNA zu zeigen. Andererseits hat die Kapillarelektrophorese einen Vorteil gegenüber der Agaroseelektrophorese, indem sie die damit verbundenen Herausforderungen überwindet und daher von den Forschern für die cfDNA-Fragmentgrößenanalyse weit verbreitet ist. In diesem Protokoll wurde die Fragmentgrößenverteilung isolierter cfDNA mit einem automatisierten Kapillarelektrophorese-Instrument geschätzt (siehe Tabelle der Materialien).

Protokoll

Vor der Blutentnahme ist die informierte Zustimmung der an der Forschung beteiligten Personen erforderlich und muss eingeholt werden. Die in diesem Manuskript beschriebene Forschung wurde in Übereinstimmung mit dem Rabin Medical Center, dem israelischen Ethikkomitee (Ethikkodex: 0039-17-RMC) und der Medizinischen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Deutschland, durchgeführt (Ethikkodex: D 405/14).

1. Blutprobenentnahme und -speicherung in cfDNA- oder cfRNA-Konservierungsröhrchen

1. Beschriften Sie die Konservierungsrohre richtig
2. Sammeln Sie 8 ml Blut in die cf-DNA-Konservierungsröhre (siehe Tabelle der Materialien),mit einem Blutentnahmeset und einem Halter, wie nach dem unten beschriebenen Standard-institutionellen Protokoll für Venenpunktion.
   HINWEIS: Die Verwendung eines Blutentnahmesets kann einen möglichen Rückfluss des Blutes aus der Röhre verhindern.
   1. Richten Sie den Patienten mit dem Arm in einer abwärts gerichteten Position aus.
   2. Halten Sie die Röhre aufrecht, mit der Kappe nach oben, während Sie sicherstellen, dass der Rohrinhalt die Kappe oder Nadelspitze nicht berührt.
   3. Wenn Blut in die Röhre zu fließen beginnt, lassen Sie das Tourniquet langsam los.
3. Unmittelbar nachdem das Rohr mit Blut gefüllt ist (maximale Kapazität: 8,4 ml Vollblut), das Rohr vorsichtig umkehren (das Handgelenk des Arms, der das Rohr um 180° nach unten und hinten hält) 5 Mal umdrehen, um die Probe zu stabilisieren.
   HINWEIS: Inversion stellt sicher, dass das Konservierungsmittel gleichmäßig mit der Probe gemischt wird. Schütteln Sie den Inhalt jedoch nicht noch einmal, auch nicht vor der Plasmazubereitung. Unzureichende Vermischung von Konservierungsstoffen mit der Blutprobe führt zu einer Destabilisierung des Inhalts und der Bildung von Mikrogerinnseln oder Hämolyse. In diesem Stadium kann das Protokoll sofort für die Plasmatrennung fortgesetzt werden oder blutgefüllte Röhren können bis zu 30 Tage bei Umgebungstemperatur (15-25 °C) und bis zu 8 Tage bei 37 °C warten.

2. Plasma- und Buffy-Mantel-Trennung und -Lagerung

1. Zentrifugieren Sie das blutgefüllte Konservierungsrohr bei 425 x g für 20 min bei Raumtemperatur, um Plasma zu trennen.
   HINWEIS: Die Schritte 2.2 und 2.3 sollten in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden.
2. Die obere Plasmaschicht vorsichtig in 1 ml Aliquots in ein frisches Rohr auslagern, ohne die unteren Schichten zu stören.
3. Übertragen Sie vorsichtig die nächste Schicht buffy Mantel auf ein frisches Rohr (die Schicht erscheint als Ring über den RBC-Pellets), während RBCs in der unteren Schicht zu vermeiden.
4. Fahren Sie mit Schritt 3 mit Plasma und Schritt 4 mit dem buffy Mantel fort. Bei Bedarf den getrennten Inhalt bei -80 °C lagern.

3. Reinigung der zirkulierenden cfDNA aus 1 ml Plasma

HINWEIS: Dieser Schritt wird mit einem kommerziellen Kit durchgeführt (siehe Tabelle der Materialien). Alle Puffer werden mit dem Kit geliefert.

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien
   VORSICHT: Fügen Sie dem Probenvorbereitungsabfall keine sauren Lösungen oder Bleichmittel direkt hinzu. Guanidinsalze, die in Lysispuffer, Bindungspuffer und Waschpuffer-1 in Kombination mit Bleichmittel oder Säuren enthalten sind, können hochreaktive Verbindungen produzieren.
   1. Bindungspuffer: Mischen Sie 300 ml Bindungspufferkonzentrat mit 200 ml 100% Isopropanol, um 500 ml funktionierenden Bindungspuffer zu bilden. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
      HINWEIS: Der Bindungspuffer ermöglicht die optimale Bindung der zirkulierenden Nukleinsäuren an die Kieselsäuremembran. 500 ml des Bindungspuffers reichen für die Verarbeitung von 276, 138, 92, 69 oder 55 Proben von 1, 2, 3, 4 oder 5 ml Plasma aus und sind für 1 Jahr bei Raumtemperatur stabil.
   2. Waschpuffer-1: Mischen Sie 19 ml Wash Buffer-1 Konzentrat mit 25 ml 96–100% Ethanol, um 44 ml arbeitsfähigen Wash Buffer-1 herzustellen. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
      HINWEIS: Wash Buffer-1 eliminiert die an die Kieselsäuremembran gebundenen Verunreinigungen. 44 ml Arbeitswaschpuffer-1 ist ausreichend für die Verarbeitung von 73 Proben von 1/2/3/4/5 ml Plasma und ist stabil für 1 Jahr bei Raumtemperatur.
   3. Wash Buffer-2: Mischen Sie gut 13 ml Wash Buffer-2 Konzentrat mit 30 ml 96–100% Ethanol, um 43 ml arbeitsfähigen Wash Buffer-2 zu machen. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
      HINWEIS: Wash Buffer-2 eliminiert die an die Kieselsäuremembran gebundenen Verunreinigungen. 43 ml Arbeitswaschpuffer-2 reichen für die Verarbeitung von 56 Proben von 1/2/3/4/5 ml Plasma aus und sind für 1 Jahr bei Raumtemperatur stabil.
   4. In ein Rohr, das 310 g lyophilisierte Träger-RNA enthält, fügen Sie 1.550 l Elutionspuffer hinzu, um eine Träger-RNA-Lösung von 0,2 g/l vorzubereiten. Nach gründlicher Auflösung der Träger-RNA die Lösung auf geeignete Aliquots aufteilen und bei -30 °C bis -15 °C lagern. Diese Aliquots nicht mehr als 3 Mal einfrieren. Zum Lysispuffer fügen Sie, wie in Tabelle S1dargestellt, die rekonstituierte Träger-RNA, die im Elution-Puffer gelöst ist, hinzu.
      HINWEIS: Da sich träger-RNA nicht direkt im Lysispuffer auflöst, muss sie zuerst in einem Elutionspuffer und dann in Lysis Buffer aufgelöst werden. Erstens wird die Bindung von Kieselsäure-Nukleinsäuren verstärkt, wenn nur sehr wenige Zielmoleküle in der Probe vorhanden sind. Zweitens wird das Risiko eines RNA-Abbaus durch das Vorhandensein großer Mengen von Träger-RNA reduziert.
2. Bevor Sie mit der Isolierung beginnen, bringen Sie die Säulen und Proben auf Raumtemperatur und passen Sie die Probenvolumina bei Bedarf auf 1 ml mit steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) an. 2 Wasserbäder oder Heizblöcke vorheizen, die 50 ml Zentrifugenrohre und 2 ml Sammelrohre auf 60 °C bzw. 56 °C enthalten.
3. Zu einem 50 ml Zentrifugenrohr 100 l Proteinase K, 1 ml Plasma und 0,8 ml Lysispuffer mit 1,0 g Träger-RNA (in Schritt 3.1.4) hinzufügen. Schließen Sie das Zentrifugenrohr mit einer Kappe und mischen Sie den Inhalt durch Pulswirbelung für 30 s, während Sie einen sichtbaren Wirbel in der Röhre gewährleisten. Eine gründliche Vermischung der Inhalte ist wichtig für eine effiziente Lyse.
   HINWEIS: Fahren Sie unmittelbar nach dem Wirbeln unverzüglich mit Schritt 3.4 fort.
4. Inkubieren Sie die Lösung bei 60 °C für 30 min.
5. Entfernen Sie die Kappe, fügen Sie 1,8 ml des Bindungspuffers in das Rohr ein, und mischen Sie sie nach dem Platzieren der Kappe gründlich mit Pulswirbelung für 15–30 s.
6. Inkubieren Sie das resultierende Gemisch für 5 min auf Eis und legen Sie die Kieselsäure-Membransäule in das Vakuumgerät ein, das mit der Vakuumpumpe verbunden ist. Setzen Sie dann einen 20 ml Rohrverlängerer fest in die offene Säule ein, um ein Leck in der Probe zu verhindern.
7. Gießen Sie das inkubierte Gemisch vorsichtig in den Rohrverlängerer der Säule und schalten Sie die Vakuumpumpe ein. Schließlich läuft das Lysatgemisch vollständig durch die Säulen, schaltet die Vakuumpumpe aus, gibt den Druck auf 0 mbar ab und entfernt und entsorgt den Rohrverlängerer.
   HINWEIS: Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, sollte der Rohrverlängerer sorgfältig entsorgt werden, um zu verhindern, dass er sich über benachbarte Säulen ausbreitet.
8. Entfernen Sie die Säule aus dem Vakuumgerät, legen Sie sie in das Sammelrohr ein und zentrieren Sie bei 11.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um Restlysat zu entfernen. Entsorgen Sie den Durchfluss.
9. Fügen Sie 600 l Waschpuffer-1 in die Säule, Zentrifuge bei 11.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur, entsorgen Sie den Durchfluss.
10. Fügen Sie der Säule 750 l Waschpuffer-2, Zentrifuge bei 11.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur, und entsorgen Sie den Durchfluss.
11. Fügen Sie 750 l Ethanol hinzu (96–100%) zur Säule zentrifugieren Sie bei 11.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Durchfluss.
12. Zentrifugieren Sie die Säule bei 20.000 x g für 3 min, indem Sie sie in ein sauberes 2 ml Sammelrohr legen.
13. Trocknen Sie die Membransäulenbaugruppe vollständig, indem Sie sie in ein neues 2 ml Sammelrohr legen, wobei der Deckel geöffnet ist und bei 56 °C für 10 min inkubiert wird.
14. Legen Sie die Säule in ein sauberes 1,5 ml Elutionsrohr. In der Mitte der Säulenmembran 20–150 l Elutionspuffer auftragen und bei Raumtemperatur 3 min mit geschlossenem Deckel inkubieren.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Elution-Puffer der Raumtemperatur gleicht. Bei Verwendung des Elutionspuffers unter 50 l stellen Sie sicher, dass er sorgfältig auf die Mitte der Membran abgegeben wird. Dies hilft bei der vollständigen Elution der gebundenen DNA. Das Elutionsvolumen ist jedoch nicht fixiert und kann gemäß den nachgelagerten Anwendungen geändert werden. Das zurückgewonnene Eluat kann bis zu 5 l und sicherlich kleiner sein als das auf die Säule aufgebrachte Elutionsvolumen.
15. Zentrifugieren Sie das zurückgewonnene Eluat in einer Mikrozentrifuge bei 20.000 x g für 1 min, um die Nukleinsäuren zu elute, und lagern Sie bei -20 °C.

4. Reinigung der genomischen DNA aus buffy Mantel

HINWEIS: Das in diesem Protokoll verwendete kommerzielle Kit wird in der Tabelle der Materialienerwähnt. Puffer und Reagenzien, die im folgenden Protokoll erwähnt werden, z. B. Lysispuffer A, Lysispuffer B, Waschpuffer X, Waschpuffer Y, Proteinasebuffer, Elutionspuffer und Proteinase K sind Teil dieses kommerziellen Kits.

1. Herstellung der Puffer und Reagenzien
   VORSICHT: Fügen Sie dem Probenvorbereitungsabfall keine sauren Lösungen oder Bleichmittel direkt hinzu. Guanidinsalze, die in Lysispuffer B und Waschpuffer X in Kombination mit Bleichmittel oder Säuren enthalten sind, können hochreaktive Verbindungen produzieren.
   1. Waschpuffer Y: 12 ml Wash Buffer Y Konzentrat mit 48 ml Ethanol (96–100%) gut mischen um 60 ml Arbeitspuffer Y. bei Raumtemperatur aufbewahren zu können.
      HINWEIS: 60 ml Arbeitswaschpuffer Y ist ausreichend für die Verarbeitung von 100 buffy Fellproben und ist stabil für 1 Jahr.
   2. Proteinase K: Bereiten Sie die Proteinase-K-Lösung vor, indem Sie 30 mg lyophilisierte Proteinase K in 1,35 ml Proteinase-Puffer auflösen.
      HINWEIS: Die Gesamtarbeitslösung von Proteinase K ist ausreichend für die Verarbeitung von 52 buffy Coat Proben. Die Arbeitslösung Proteinase K kann mindestens 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.
2. Schritte vor Einleitung des Verfahrens
   1. Den büffelnden Mantel auf Raumtemperatur ausdemieren.
   2. Stellen Sie den Wärmeblock oder das Wasserbad auf 56 °C ein.
3. Suspendbuffy Mantel in Lysis Puffer A, um ein Endvolumen von 200 l zu erhalten. Dann fügen Sie 25 l Proteinase-K-Lösung und 200 l Lysispuffer B hinzu. Mischen Sie sie durch Wirbeln und inkubieren Sie bei 70 °C für 10–15 min. Stellen Sie sicher, dass die Proben vollständig mit der Lyselösung abgedeckt sind.
   HINWEIS: Für die Verarbeitung von Probenreihen können Proteinase K und Lysispuffer A 10 bis 15 Minuten vor dem Eingriff vorgemischt werden, aber nicht mehr davor, da Proteinase K selbstverdaut in Lysispuffer A ohne Substrat.
4. Fügen Sie 210 l 96–100% Ethanol in das obige Gemisch und Wirbel kräftig.
   ANMERKUNG: Die Zugabe von Ethanol kann einen Stringy-Ausscheider bilden; Dies hat jedoch keinen Einfluss auf die DNA-Isolierung. Achten Sie darauf, den Niederschlag auch auf die Spalte zu laden, wie in den folgenden Schritten gezeigt.
5. Laden Sie die gesamte Probe auf die Kieselsäuresäule, die in einem Sammelrohr platziert ist. Zentrifuge für 1 min bei 11.000 x g. Platzieren Sie die Spalte in einem neuen Sammelrohr, und entsorgen Sie das vorherige Rohr zusammen mit dem Durchfluss.
   HINWEIS: Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt, wenn die Probe nicht vollständig durch die Matrix gezogen wird.
6. Fügen Sie 500 l Waschpuffer X, Zentrifuge für 1 min bei 11.000 x g hinzu, und entsorgen Sie den Durchfluss.
7. Legen Sie die Spalte in das Sammelrohr, fügen Sie 600 l Waschpuffer Y auf die Säule, Zentrifuge für 1 min bei 11.000 x g, und entsorgen Sie den Durchfluss.
8. Legen Sie die Säule erneut in das Sammelrohr und zentrieren Sie die Säule für 1 min bei 20.000 x g, um die Kieselsäuremembran zu trocknen.
9. Inkubieren Sie die Säule bei Raumtemperatur für 1 min, in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr gelegt, und fügen Sie dann 100 l Elutionspuffer hinzu. Dann die DNA durch Zentrifugieren für 1 min bei 11.000 x g elute und bei -20 °C lagern.

5. Quantifizierung von cfDNA und genomischer DNA mittels Fluorometer

1. Führen Sie vor dem Starten des Protokolls die folgenden Schritte aus.
   1. Verdünnen Sie 2 l eluierte genomische DNA (ab Schritt 4.9) in 1:10 Proportionen mit ultrareinem Nuklease-freiem Wasser. Aufgrund der zu erwartenden geringen Konzentrationen cfDNA-Proben aus Schritt 3.15 nicht verdünnen.
   2. Equilibrate the assay Standard #1 und assay Standard #2 auf Raumtemperatur.
2. Bereiten Sie insgesamt 6 dünnwandige Klarrohre von 0,5 ml Größe vor.
   ANMERKUNG: Das vorgelegte Protokoll dient der Quantifizierung von 2 cfDNA- und 2 genomischen DNA-Proben, daher 4 Tuben für 4 Proben, und dieser Test erfordert 2 Standards.
3. Beschriften Sie die Deckel des Rohres.
   HINWEIS: Die Beschriftung an der Seite des Rohres könnte die Messung beeinträchtigen. Darüber hinaus werden die Assay-Standardröhren sorgfältig beschriftet, da die Kalibrierung des Fluorometers erfordert, dass die Standards in der richtigen Reihenfolge sind.
4. Verdünnen Sie das Assay-Reagenz in 1:200 mit dem Assay-Puffer, um die Arbeitslösung vorzubereiten. Für 4 Proben und 2 Standards verwenden Sie 6 l Assay-Reagenz plus 1.194 l Assay-Puffer, um 1.200 l (200 l in jedem Rohr) arbeitslösung herzustellen.
   HINWEIS: Verwenden Sie keinen Glasbehälter, sondern ein sauberes Kunststoffrohr. Jedes Rohr muss ca. 200 l des Endvolumens enthalten (ein Assay-Standardrohr muss 190 l der Arbeitslösung enthalten, und das Probenrohr muss 180–199 l der Arbeitslösung enthalten). Es muss eine ausreichende Arbeitslösung für alle Assay-Standards und Proben vorbereitet werden.
5. Fügen Sie in den Arbeitsassay-Standardröhren 190 L Arbeitslösung und 10 L Assay-Standard hinzu und mischen Sie die Lösung durch Wirbeln für 2–3 s. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen innerhalb der Lösung.
6. In den Probenröhrchen fügen Sie 198 L Arbeitslösung und 2 L cfDNA oder genomische DNA hinzu. Mischen Sie die Lösung, indem Sie 2-3 s wirbeln, und halten Sie sie bei Raumtemperatur für 2 min inkubiert.
7. Drücken Sie im 'Home'Bildschirm des Fluorometer-Instruments 'DNA' und wählen Sie 'dsDNA High Sensitivity Assay', um den 'Standards' Bildschirm anzuzeigen, und drücken Sie dann 'Ja' auf dem Fluorometer 'Standards' Bildschirm, um die Standards zu lesen.
8. Legen Sie in die Probenkammer den Assay Standard #1 Rohr ein, schließen Sie den Deckel, und drücken Sie 'Lesen'. Entfernen Sie das Rohr, sobald der Messwert abgeschlossen ist (ca. 3 s), und wiederholen Sie den gleichen Schritt für Standard #2.
9. Nach Abschluss des Kalibrierungsprozesses wird ein Probenbildschirm angezeigt, dann ein Probenröhrchen ein- und wiederholungsschritt5.8. Der "Probenbildschirm" zeigt dann einen Wert an, der der Konzentration der Probe nach Verdünnung im Probenröhrchen entspricht.
10. Für jeden Beispielwiederholungsschritt '5.9', bis alle Proben gelesen werden.
11. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die tatsächliche Konzentration der Probe zu berechnen.
    
    HINWEIS: Die Assaywerte sind in ng/mL und entsprechen der Konzentration nach Verdünnung im Assayrohr. Gleichung, die in Schritt 5.11 erwähnt wird, QF-Wert ist der Wert, der vom Fluorometer-Instrument angegeben wird, und x ist die Anzahl der Mikroliter der Probe, die dem Assay-Röhrchen zugesetzt wurde. Die Einheiten für QF-Werte, die durch die Gleichung generiert werden, ähneln dem vom Fluorometer bereitgestellten Wert. Wenn sich der Wert des Fluorometers beispielsweise in ng/mL befindet, sind die Einheiten für die durch die Gleichung berechnete Konzentration ng/mL.

6. DNA-Fragmentgrößenverteilung von cfDNA durch Fragmentanalysator

1. Der Schritt vor der Initiierung des Verfahrens: Equilibrate das DNA-Farbstoffkonzentrat und DNA-Gel-Matrix auf Raumtemperatur für 30 min.
2. Zubereitung der Gel-Dye-Mischung
   VORSICHT: Behandeln Sie Lösungen mit Vorsicht, da DMSO dafür bekannt ist, den Eintritt organischer Moleküle in Gewebe zu erleichtern.
   1. Das DMSO gründlich auftauen, indem man die DNA-Farbstoffkonzentrat-Durchstechflasche für 10 s auftauen lässt. 15 L dieses Konzentrats in eine DNA-Gelmatrix-Durchstechflasche herausbringen und bei 4 °C im Dunkeln lagern.
   2. Auch hier wirbelt die gekappte Durchstechflasche für 10 s, bis das Mischen von Gel und Farbstoff visualisiert wird.
   3. Gießen Sie die Mischung auf einem Spin-Filter an die obere Buchse.
   4. Mikrozentrifugieren Sie den Spinfilter bei 2.240 x g ± 20% für 10 min bei Raumtemperatur.
   5. Beschriften Sie den vorbereiteten Gelfarbstoff in der Röhre und entsorgen Sie den Filter gemäß guten Laborpraktiken. Beschriften Sie die Röhre und notieren Sie das Herstellungsdatum.
      HINWEIS: Entsorgen Sie das Filtrat gemäß guten Laborpraktiken. Der Gel-Dye-Mix kann für 5 HIGH Sensitivity (HS) DNA-Chips verwendet werden. Wenn sie mehr als 1 h unbenutzt sind, bei 4 °C lagern. Die Lagerung im Dunkeln ist bis zu 6 Wochen möglich.
3. Um den Gel-Farbstoff-Mix zu laden, stellen Sie die Position der Grundplatte der Span-Grundierstation sicher und stellen Sie den Clip an der niedrigsten Position ein.
   1. Den Gel-Farbstoff-Mix auf Raumtemperatur für 30 min ausstatten und gleichzeitig die Lichteinstrahlung überwachen.
   2. Nehmen Sie einen neuen HS-DNA-Chip aus einem versiegelten Beutel und legen Sie ihn auf die Span-Grundierstation, entfernen Sie dann 9,0 l des Gel-Farbstoff-Mixes und geben Sie ihn an der Unterseite des Chips gut, markiert als "G".
      HINWEIS: Zeichnen Sie die Gel-Farbstoff-Mischung, um Partikel zu vermeiden, die sich am Boden der Durchstechflasche ansammeln können. Während Sie den Gel-Farbstoff-Mix gut in den HS-DNA-Chip geben, legen Sie die Spitze der Pipette vollständig ein, um die Bildung großer Luftblasen zu verhindern. Darüber hinaus führt das Berühren der Pipette an den Rändern des Brunnens zu schlechten Ergebnissen.
   3. Positionieren Sie den Kolben auf 1 ml und schließen Sie die Span-Grundierstation. Stellen Sie sicher, dass die Verriegelung klickt und stellen Sie den Timer auf 60 s ein, drücken Sie dann den Kolben nach unten, bis er vom Clip gehalten wird, und lassen Sie den Kolben genau nach 60 s mit dem Clip-Release-Mechanismus los.
   4. Wenn sich der Kolben mindestens auf die 0,3 ml-Marke zurückzieht, warten Sie 5 s und ziehen Sie dann langsam zurück in die 1 ml-Position, öffnen Sie dann die Span-Grundierstation und entfernen Sie erneut 9,0 l des Gel-Farbstoff-Mixes und geben Sie an der Unterseite des HS-DNA-Chips gut, markiert als "G", ab.
4. Um den DNA-Marker zu laden, geben Sie 5 l des DNA-Markers in den Brunnen, der mit dem Leitersymbol markiert ist. Wiederholen Sie den Vorgang für alle 11 Probenbohrungen.
5. Um die Leiter und die Proben zu laden, geben Sie 1 l der DNA-Leiter in den Brunnen, mit dem Leitersymbol markiert und fügen Sie dann 1 l Probe (verwendete Brunnen) oder 1 l Marker (ungenutzte Brunnen) in allen 11 Probenbrunnen hinzu.
6. Wirbeln Sie den HS-DNA-Chip für 60 s bei 2.400 Rpm, indem Sie den Chip horizontal in den Adapter legen. Stellen Sie sicher, dass die Wölbung, die den HS-DNA-Chip fixiert, während des Wirbelns nicht beschädigt wird.
7. Um den HS-DNA-Chip in das Fragmentanalysator-Instrument einzufügen, öffnen Sie den Deckel und stellen Sie sicher, dass die Elektrodenpatrone richtig eingesetzt ist und der Chip-Selektor auf "dsHigh Sensitivity DNA" im Fragmentanalysator-Instrument positioniert ist.
8. Montieren Sie den HS-DNA-Chip vorsichtig in den Behälter, der nur in eine Richtung passt, und verlieren Sie dann den Deckel, indem Sie sicherstellen, dass die Elektrodenpatrone genau in die Brunnen des HS-DNA-Chips passt.
9. Das Display auf dem Bildschirm der Fragmentanalysezeigt zeigt den eingelegten HS-DNA-Chip und den geschlossenen Deckel durch das Chip-Symbol oben links auf dem Bildschirm an.
10. Um den HS-DNA-Chiplauf zu initiieren, wählen Sie den dsDNA High Sensitivity Assay aus dem Menü 'Assay' auf dem Instrumentenbildschirm aus, füllen Sie dann die Tabelle der Beispielnamen ordnungsgemäß aus, indem Sie Informationen wie Beispielnamen und Kommentare einspeisen und den Chip lauf starten, indem Sie auf die Schaltfläche"Start" oben rechts auf dem Bildschirm klicken.
11. Elektrodenreinigung nach einem HS-DNA-Chiplauf: Entfernen Sie sofort den verwendeten HS-DNA-Chip, sobald der Test abgeschlossen ist, und entsorgen Sie ihn nach guten Laborpraktiken. Führen Sie das folgende Verfahren durch, um sicherzustellen, dass die Elektroden sauber sind, ohne Rückstände aus dem vorherigen Test.
    1. Füllen Sie langsam 350 l entionisiertes Analysewasser in einen der Elektrodenreinigerbrunnen und legen Sie den Elektrodenreiniger in das Fragmentanalysator-Instrument, indem Sie den Deckel öffnen und dann den Deckel schließen und etwa 10 s warten.
    2. Entfernen Sie den Elektrodenreiniger, indem Sie den Deckel öffnen und warten Sie weitere 10 s, bis das Wasser auf den Elektroden verdunstet, bevor Sie den Deckel schließen.

Ergebnisse

Plasma-Trennung
8,5-9 ml Blut, das in cfDNA- oder cfRNA-Konservierungsröhrchen gesammelt wird, ergibt ein Volumen von ca. 4 ml Plasma. Das Volumen des Plasmas, das von blutgebundenen Blutinues in EDTA-Röhren getrennt ist, kann je nach Temperatur variieren. Die Exposition von EDTA-Röhren, die Blut bei einer Temperatur von mehr als 37 °C enthalten, führt zu einer verringerten Plasmavolumenausbeute⁴⁴.

Fluorometer-Assay-Ergebnisse

Diskussion

Die Entnahme des Blutes eines Patienten in einer Röhre, der Versand und die Lagerung sind entscheidende erste Schritte in der flüssigen Biopsie. Unsachgemäße Handhabung kann die Qualität des Plasmas beeinträchtigen und daher die Ergebnisse der flüssigen Biopsie^{stören 47}. Wenn eine Blutprobe in einem EDTA-Blutröhrchen entnommen wird, muss das Plasma innerhalb von zwei Stunden nach der Blutentnahme getrennt werden, um eine Lyse von WBCs und die Freisetzung seiner genomischen DNA in das Plas...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C