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Resumen

Este trabajo describe el uso de la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9 para eliminar el gen endógeno OsABCG15 seguido de un protocolo de transformación mediado por Agrobacteriummodificado para producir una línea estable de color masculino-estéril en el arroz.

Resumen

La esterilidad masculina es un rasgo agronómico importante para la producción de semillas híbridas que generalmente se caracteriza por defectos funcionales en órganos reproductores/gametos masculinos. Los avances recientes en la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9 permiten una alta eficacia de edición y mutaciones eliminatorias de los genes candidatos endógenos en sitios específicos. Además, la transformación genética mediada por Agrobacteriumdel arroz es también un método clave para la modificación de genes, que ha sido ampliamente adoptado por muchos laboratorios públicos y privados. En este estudio, aplicamos las herramientas de edición del genoma CRISPR-Cas9 y generamos con éxito tres líneas mutantes estériles masculinas mediante la edición específica del genoma de OsABCG15 en un cultivar de japonica. Utilizamos un método modificado de transformación de arroz mediado por Agrobacteriumque podría proporcionar excelentes medios de emasculación genética para la producción de semillas híbridas en el arroz. Las plantas transgénicas se pueden obtener en un plazo de 2 a 3 meses y los transformantes homocigotos se examinaron mediante el genotipado mediante amplificación de PCR y secuenciación de Sanger. La caracterización fenotípica básica de la línea homocigota estéril masculina se realizó mediante observación microscópica de los órganos reproductores masculinos de arroz, análisis de viabilidad del polen por yoduro de potasio yodo (I2-KI)tinción semi-delgada sección transversal de los anteras en desarrollo.

Introducción

El arroz es el cultivo alimentario más importante, particularmente en los países en desarrollo, y representa un alimento básico para más de la mitad de la población mundial. En general, la demanda de grano de arroz está creciendo y se prevé que aumente un 50% para 2030 y un 100% para 20501,2. Las futuras mejoras en el rendimiento del arroz tendrán que capitalizar diversos recursos moleculares y genéticos que hacen del arroz un modelo excelente para la investigación monocoqueledonosa de las plantas. Estos incluyen un sistema de transformación eficiente, mapa molecular avanzado y base de datos accesible al público de etiquetas de secuencia expresadas, que se han generado a lo largo de muchos años3,,4. Una estrategia para mejorar el rendimiento de los cultivos es la producción de semillas híbridas5,cuyo elemento central es la capacidad de manipular la fertilidad masculina. Comprender el control molecular de la fertilidad masculina en los cultivos de cereales puede ayudar a traducir los conocimientos clave en técnicas prácticas para mejorar la producción de semillas híbridas y mejorar la productividad de los cultivos6,,7.

La transformación genética es una herramienta clave para la investigación básica y la agricultura comercial, ya que permite la introducción de genes extraños o la manipulación de genes endógenos en las plantas de cultivo, y resulta en la generación de líneas modificadas genéticamente. Un protocolo de transformación adecuado puede ayudar a acelerar los estudios de biología genética y molecular para la comprensión fundamental de la regulación genética8. En las bacterias, la transformación genética tiene lugar de forma natural; sin embargo, en las plantas, se realiza artificialmente utilizando técnicas de biología molecular9,,10. Agrobacterium tumefaciens es una bacteria Gram-negativa transmitida por el suelo que causa la enfermedad de la agalla de la corona en las plantas mediante la transferencia de ADN-T, una región de su plásmido Ti, a la célula vegetal a través de un sistema de secreción tipo IV11,12. En las plantas, la transformación mediada por A. tumefaciensse considera un método generalizado para la modificación del gen, ya que conduce a la integración estable y bajo del número de copia del ADN-T en el genoma del huésped13. El arroz transgénico se generó por primera vez a través de la transformación genética mediada por Agrobacteriuma mediados de la década de 1990 en el cultivarjaponica 14. Usando este protocolo, se obtuvieron varias líneas transgénicas en un período de 4 meses con una eficiencia de transformación del 10%-30%. El estudio indicó que hay dos pasos críticos para la transformación exitosa: uno es la inducción del callo embrionario a partir de semillas maduras y otro es la adición de acetosyringona, un compuesto fenólico, al cultivo bacteriano durante el cultivo, que permite una mayor eficiencia de transformación en plantas14,,15. Este protocolo ha sido ampliamente utilizado con alteraciones menores en japonica16,17,18,19 así como otros cultivares como indica20,,21,22,23 y tropical japonica24,25. De hecho, más del 80% de los artículos que describen la transformación del arroz utilizan la transformación genética mediada por Agrobacteriumcomo herramienta13. Hasta la fecha, se han desarrollado varios protocolos de transformación genética utilizando semillas de arroz como material de partida para la inducción de callos16,17,18,19. Sin embargo, se sabe muy poco sobre la inflorescencia joven como explantas para la producción de callos. En general, es importante establecer un protocolo rápido, reproducible y eficiente de transformación y regeneración genética para la genómica funcional y estudios sobre la mejora de los cultivos.

En los últimos años, el avance de la tecnología CRISPR-Cas9 ha dado lugar a un mecanismo preciso de edición del genoma para comprender la función génica y ofrecer mejoras agronómicamente importantes para la cría de plantas26,,27. CRISPR también ofrece una considerable promesa para la manipulación del desarrollo reproductivo masculino y la producción híbrida. En este estudio, utilizamos un sistema de eliminación de genes utilizando la tecnología CRISPR-Cas9 y lo acoplamos a un protocolo eficiente de transformación del gen del arroz utilizando inflorescencias jóvenes como explantas, creando así líneas estériles masculinas estables para el estudio del desarrollo reproductivo.

Protocolo

1. construcción de vectores de expresión vegetal sgRNA-CAS9 y transformación mediada por Agrobacterium

  1. Dirigirse a un gen estéril macho OsABCG15 en arroz según la literatura publicada28.
  2. Diseñe sgRNA para el sitio de destino ubicado entre 106-125 bp en el segundo exón de OsABCG15 (Figura 1).
  3. Utilice T4 polinucleótidos quinasa para sintetizar los oligos de sgRNA (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' y 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCTTGAGGTGATGCTT').
  4. Utilice endonucleasa BbsI para digerir el vector de estructura básica psgR-Cas929.
  5. Ligar los oligos de sgRNA sintetizados con la columna vertebral linealizada psgR-Cas9 utilizando ligasa T4 siguiendo el protocolo del fabricante.
  6. Usando HindIII/EcoRI, digiere el casete sgRNA del paso 1.5 y el subclón en el sitio HindIII/EcoRI del vector binario pCAMBIA1300 para una transformación estable29.
  7. Confirmar el plásmido construido por digestión enzimática y secuenciación. Más tarde, transformar la construcción binaria en la cepa Agrobacterium tumefaciens EHA105 y cultivarlas en placas de selección Kan/Rif a 28 oC durante 2-3 días.

2. Transformación genética del arroz y cultivo de tejidos vegetales

  1. Inducción y regeneración del callo
    NOTA: Utilice inflorescencias de arroz joven fresco como material de partida para inducir callo (Figura 2).
    1. Recoger las inflorescencias jóvenes del arrozal o casa verde en la etapa de meiosis, determinada por la longitud del florete de 1,6-4,8 mm (Figura 2A)29. Asegúrese de que las inflorescencias de arroz estén cubiertas con vaina de hoja. Limpie cada inflorescencia con un hisopo de alcohol al 70% y déjelo secar antes de cortar.
    2. Lleve la inflorescencia a un banco estéril limpio. Cortarlo en trozos pequeños (cuanto más pequeño mejor) con tijeras esterilizadas y luego transferir esquejes a una placa Petri que contenga el medio NBD2 (Figura 2B, Tabla 1).
    3. Incubar la placa en la oscuridad a 26oC durante unos 10-14 días para inducir callo (Figura 3A).
      NOTA: Utilice el callo recién formado para la infiltración de Agrobacterium (paso 2.2.7) directamente o vuelva a condicionar una vez más en medio NBD2 fresco para obtener más callos. Transfiera el callo al nuevo medio NBD2 cada 8-10 días.
  2. Transformación y co-cultivo
    1. Utilice la bacteria A. tumefaciens que contiene el plásmido binario del paso 1.6 para la transformación. Conservar las cepas de A. tumefaciens en el medio YEB(Tabla 1) con 50% de glicerol a -80 oC para su uso posterior.
    2. Racha A. tumefaciens de una población de glicerol de -80 oC hasta un medio de agar YEB que contiene antibióticos selectivos(Tabla 1) y crece a 25–28 oC durante 48-72 h, para permitir que aparezcan colonias.
    3. Inocular una sola colonia de la placa YEB con antibióticos selectivos a 5 ml de medio líquido YEB que contenga los mismos antibióticos selectivos (Tabla 1), en un tubo de ensayo estéril cónico de 50 ml. Agitar en un agitador orbital a 250 x g,a 25–28 oC hasta que las bacterias crezcan a un OD600 de 0,5.
    4. Añadir 1 ml de suspensión bacteriana a 100 ml de medio YEB(Tabla 1) con los mismos antibióticos selectivos en un matraz cónico de 250 ml y agitar en un agitador orbital a 250 x g,a 28 oC durante 4 h.
    5. Centrifugar a 4.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para recoger bacterias. Deseche el sobrenadante.
    6. Resuspender el pellet bacteriano con medio AAM-AS(Tabla 1) y diluir la suspensión a un OD600 a 0,4.
      NOTA: El OD perfecto de la suspensión bacteriana es fundamental para una transformación eficiente. Ayuda a eliminar el crecimiento bacteriano excesivo en el callo.
    7. Recoger alrededor de 150 calli embriogénicos frágiles de color amarillo claro sano del paso 2.1.3 en un matraz estéril de 150 ml. Añadir 50–75 ml de suspensión de células bacterianas del paso 2.2.6 en el matraz estéril, y luego añadir unos 10–25 ml de medio AAM-AS fresco para sumergir la cali durante 10-20 minutos, temblando ocasionalmente.
    8. Vierta cuidadosamente la suspensión bacteriana del matraz y seque el exceso de suspensión bacteriana del callo utilizando papel de filtro estéril #1 o papel tisú. A continuación, colóquelos en un plato de Petri con medio NBD-AS (Tabla 1) cubierto con un papel de filtro estéril #1. Incubar a 25–28 oC en la oscuridad durante 3 días y comprobar si hay crecimiento excesivo bacteriano.
  3. Selección para callos resistentes
    1. Después de 3 días de co-cultivo, transfiera el callo a un plato estéril de Petri con un papel de filtro estéril.
    2. Secar al aire la calla durante 2 horas en un banco limpio. Asegúrese de que el callo no esté adherido al papel de filtro.
    3. Transfiera las pinzas uniformemente utilizando pinza estéril al medio de selección primario NBD2 (con 40 mg/L de higromicina y 250 mg/L de cronotina)(Tabla 1). Calli de la cultura durante 2 semanas a 25-28 oC en la oscuridad.
    4. Después de 2 semanas, transfiera las callos de forma uniforme a una placa nueva que contenga un medio de selección fresco NBD2 (con 40 mg/L de higromicina y 250 mg/L de tiempo) (Tabla 1). Cultivar el calli durante otras 2 semanas a 25-28 oC en la oscuridad.
  4. Diferenciación de Callus
    1. Transfiera el callo al medio MS fresco (con 25 mg/L de higromicina y 150 mg/L de tiempo) (Tabla 1). Cultura bajo la luz a 25-28 oC durante alrededor de 2 semanas.
    2. Repita el paso 2.4.1 una vez más.
    3. Transfiera los brotes al nuevo medio de LA MS (con 10 mg/L de higromicina) para proliferar más brotes.
  5. Inducción de raíz
    1. Transfiera los nuevos brotes a un medio MS de 1/2 (Tabla 1). Cultivo bajo la luz a 25oC - 28oC. Las plantas transformadas producen raíces en 2 semanas.
    2. Después de 1 semana, transferir las plantas a macetas limpias que cubren la planta para evitar la deshidratación.

3. Identificación genotipo

  1. Recoger hojas jóvenes de plantas de nueva generación para la extracción total de ADN utilizando el método de bromuro de amonio de cepiltrimetil (CTAB)31.
  2. Utilizando el ADN genómico como plantilla, elija las imprimaciones (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGTATT 3' e Higromicina-R: 5' CGAAGAATCTCGTGCTTTCA 3' ubicadas en la región de Higromicina) para realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para validar la integración y frecuencias de transgén(Figura 4). Las siguientes condiciones de PCR: 94 oC durante 5 min; 36 ciclos (94oC para 30 s; 56oC para 30 s; 72oC durante 1 min); 72oC durante 7 min. Las reacciones PCR exitosas producen un amplicon de 604 bp.
  3. Realizar otro PCR para amplificar la región genómica que rodea los sitios de destino CRISPR utilizando imprimaciones específicas (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTCTCAACAGTTTCT 3' y OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTAAATTACATTGCTAT 3') para identificar el genotipo de los transformadores. Las condiciones PCR son las mismas que en el paso 3.2.
  4. Utilice fragmentos de PCR del paso 3.3 directamente para la secuenciación de Sanger para identificar mutaciones.

4. Observar el fenotipo básico del mutante

  1. Preparar la solución I2-KI: disolver 2 g de KI (yoduro de potasio) en 10 ml de agua destilada y luego añadir 0,2 g de I2 (yodo resublimed) en él. Después de mezclar, llevar el volumen total a 100 ml con agua destilada.
  2. Preparar la solución FAA (63% etanol anhidro, 5% ácido acético glacial, 5% formaldehído y 27% agua) y mezclar antes de usar.
  3. Preparar la solución de tinción azul toluidina al 0,5%: disolver 0,5 g de azul toluidina en 100 ml de agua destilada.
  4. Realizar la observación fenotípica vegetativa, mediante la toma de imágenes de todas las plantas con una cámara digital.
  5. Realizar la observación del fenotipo reproductivo, eliminar la palea y el lema del florete. Tome fotos de las dedos enteros bajo un estereomicroscopio.
  6. Observe la viabilidad del polen por tinción de yodo.
    1. Escoge espiguillas de arroz maduros antes de la antítesis de la flor, retira la palea y el lema para liberar las anteras.
    2. Tome 6 anras y colóquelas en un portaobjetos de vidrio. Añadir 1 gota de agua destilada, aplastar bien la antera con pinzas para liberar los granos de polen, y luego añadir 2-3 gotas de I2-KI solución. Cubra con el cubreobjetos.
    3. Observar bajo un microscopio de bajo aumento. Los granos de polen teñidos de negro muestran una viabilidad más vigorosa, ningún color o amarillo-marrón teñido se atrofian o degeneran.
  7. Realizar una sección semifina de arroz anther
    1. Fije las flores de arroz de diferentes etapas del desarrollo en una solución de la FAA. Vacíe los materiales a 4oC (generalmente 15 min) para permitir que el fijador penetre en los tejidos hasta que el material se hunda hasta el fondo de la botella de recogida.
    2. Reemplace con una nueva solución FAA al día siguiente. Una vez que el material se hunda hasta el fondo, sustituir con 70% de etanol y almacenar a 4 oC para uso a largo plazo.
    3. Deshidratar los materiales con diferentes gradientes de etanol (70%, 80%, 95% cada vez durante 30 min, 100% etanol para 2 h, 100% etanol que contiene un poco de tinte Safranin durante 2 h).
      NOTA: Agregue un poco de tinte de Safranin en el segundo etanol 100% para colorear las anteras para seccionarlas más fácilmente después.
    4. Realice la incrustación siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales). A continuación, hornee en un horno a 60oC durante 48 horas antes de seccionar.
    5. Secise la muestra a un espesor de 2 m utilizando un microtoma. Agregue una gota de agua en el tobogán de vidrio. A continuación, recoger las secciones delgadas que contienen bloques de antera por fórceps y ponerlos en la superficie de la gota de agua en los portaobjetos.
    6. Coloque los portaobjetos en el baño de agua a 50 oC para esparcir completamente las secciones y dejar que se adhiera firmemente al tobogán.
    7. Utilice una solución azul toluidina al 0,5% para manchar los portaobjetos durante 30 min. A continuación, enjuague con agua y séquelo en la campana de humos. Sellar con pegamento de árbol neutro. Coloque suavemente un cubreobjetos en el portaobjetos y séquelo en la campana de humos.
    8. Observar y fotografiar la muestra bajo un microscopio.

Resultados

Aquí se demuestra el uso de la tecnología de edición de genes para crear una línea estéril masculina para futuras investigaciones por Agrobacterium-transformación genética mediada en el arroz. Para crear la línea estéril masculina de osabcg15,se utilizó mutagénesis mediada por CRISPR-CAS9 para la construcción de vectores binarios. El sgRNA fue impulsado por el promotor OsU3, mientras que el casete de expresión de hSpCas9 fue impulsado por el promotor 35S doble, y el vector medio fue ensambl...

Discusión

Los mutantes estériles masculinos artificiales son generados tradicionalmente por mutagénesis física, química o biológica aleatoria. Aunque se trata de técnicas poderosas, su naturaleza aleatoria no capitaliza la gran cantidad de conocimiento genómico moderno que tiene el potencial de ofrecer mejoras personalizadas en la cría molecular32. El sistema CRISPR-Cas9 ha sido ampliamente utilizado en plantas debido a sus medios simples y asequibles para manipular y editar ADN29,...

Divulgaciones

Ninguno.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer a Xiaofei Chen por proporcionar las inflorescencias de arroz joven y la asistencia en la elaboración del medio de cultivo del tejido de arroz. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31900611).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Naphthaleneacetic acidSigma-AldrichN0640
2，4-Dichlorophenoxyacetic AcidSigma-AldrichD7299
6-Benzylaminopurine (6-BA)Sigma-AldrichB3408
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
AgarSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000561
Ammonium sulfateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10002918
Aneurine hydrochlorideSigma-AldrichT4625
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218
Bacteriological peptoneSangon BiotechA100636
Beef extractSangon BiotechA600114
Boric acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004808
Calcium chloride dihydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd20011160
Casein acid hydrolysateBeijing XMJ Scientific Co., LtdC184
Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10007216
Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10008218
D(+)-Glucose anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63005518
D-sorbitolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63011037
EDTA, Disodium Salt, DihydrateSigma-AldrichE5134
EOS Digital SLR and Compact System CamerasCanonEOS 700D
FormaldehydeSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010018
Fully Automated Rotary MicrotomeLeica BiosystemsLeica RM 2265
Glacial acetic acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000208
GlycineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62011516
HygromycinBeijing XMJ Scientific Co., LtdH370
InositolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63007738
IodineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10011517
Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012116
KanamycineBeijing XMJ Scientific Co., LtdK378
KinetinSigma-AldrichK0753
L-ArginineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004034
L-Aspartic acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004736
L-GlutamineBeijing XMJ Scientific Co., LtdG229
L-prolineBeijing XMJ Scientific Co., LtdP698
Magnesium sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013018
Manganese sulfate monohydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013418
MicroscopesNIKONEclipse 80i
MSPhytotechM519
Nicotinic acidSigma-AldrichN0765
PhytagelSigma-AldrichP8169
Potassium chlorideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016308
Potassium dihydrogen phosphateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017608
Potassium iodideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017160
Potassium nitrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001721933
Pyridoxine Hydrochloride (B6)Sigma-Aldrich47862
RifampicinBeijing XMJ Scientific Co., LtdR501
Sodium hydroxideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
Sodium molybdate dihydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019816
Stereo microscopesLeica MicrosystemsLeica M205 A
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10021418
Technovit embedding Kits 7100Heraeus Teknovi, Germany14653
TimentinBeijing XMJ Scientific Co., LtdT869
Toluidine Blue OSigma-AldrichT3260
Water bath for paraffin sectionsLeica BiosystemsLeica HI1210
Yeast extractSangon BiotechA515245
Zinc sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10024018

Referencias

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