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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo lavoro descrive l'uso della tecnologia di editing del genoma CRISPR-Cas9 per knockout gene endogeno OsABCG15 seguita da un protocollo di trasformazione mediato Agrobacterium modificatoper produrre una linea stabile maschio-sterile nel riso.

Abstract

La sterilità maschile è un importante tratto agronomico per la produzione di semi ibridi che di solito è caratterizzata da difetti funzionali negli organi riproduttivi maschili/gameti. I recenti progressi nella tecnologia di editing del genoma CRISPR-Cas9 consentono un'elevata efficacia di editing e mutazioni di knockout per il salvataggio dei tempi di geni candidati endogeni in siti specifici. Inoltre, la trasformazione genetica mediata dall'Agrobacteriumdel riso è anche un metodo chiave per la modificazione genica, che è stato ampiamente adottato da molti laboratori pubblici e privati. In questo studio, abbiamo applicato gli strumenti di editing del genoma crispR-Cas9 e generato con successo tre linee mutanti sterili maschili dall'editing mirato del genoma di OsABCG15 in una cultivar japonica. Abbiamo utilizzato un metodo modificato di trasformazione del riso mediato da Agrobacteriumche potrebbe fornire ottimi mezzi di emasculazione genetica per la produzione ibrida di semi nel riso. Le piante transgeniche possono essere ottenute entro 2-3 mesi e i trasformatori omozigoti sono stati schermati dalla genotipazione utilizzando l'amplificazione PCR e il sequenziamento Diger. La caratterizzazione fenotipica di base della linea omozigosa sterile maschile è stata eseguita mediante l'osservazione microscopica degli organi riproduttivi maschili di riso, l'analisi della vitalità del polline mediante iodio di iodio (I2-KI) macchiando la sezione trasversale semisegnare degli anteri.

Introduzione

Il riso è la più importante coltura alimentare, in particolare nei paesi in via di sviluppo, e rappresenta un alimento base per oltre la metà della popolazione mondiale. Complessivamente, la domanda di grano di riso è in crescita e si prevede un aumento del 50% entro il 2030 e del 100% entro il 20501,2. I futuri miglioramenti nella resa del riso dovranno capitalizzare su diverse risorse molecolari e genetiche che rendono il riso un modello eccellente per la ricerca sulle piante monocotyledonose. Questi includono un sistema di trasformazione efficiente, una mappa molecolare avanzata e un database accessibile al pubblico di tag di sequenza espressi, che sono stati generati nel corso dimolti anni 3,4. Una strategia per migliorare la resa delle colture è la produzione ibridadi sementi 5, un elemento centrale del quale è la capacità di manipolare la fertilità maschile. Comprendere il controllo molecolare della fertilità maschile nelle colture cerealicole può contribuire a tradurre le conoscenze chiave in tecniche pratiche per migliorare la produzione di sementi ibride e migliorare la produttivitàdelle colture 6,7.

La trasformazione genetica è uno strumento chiave per la ricerca di base e l'agricoltura commerciale in quanto consente l'introduzione di geni estranei o la manipolazione di geni endogeni nelle piante da coltura e si traduce nella generazione di linee geneticamente modificate. Un protocollo di trasformazione appropriato può contribuire ad accelerare gli studi di biologia genetica e molecolare per la comprensione fondamentale della regolazionegenica 8. Nei batteri, la trasformazione genetica avviene naturalmente; tuttavia, nelle piante, viene eseguita artificialmente utilizzando tecniche di biologia molecolare9,10. L'Agrobacterium tumefaciens è un batterio Gram-negativo trasmesso dal suolo che causa la malattia del gallo corona nelle piante trasferendo T-DNA, una regione del suo plasmide Ti, nella cellula vegetale attraverso un sistema di secrezione di tipo IV11,12. Nelle piante, la trasformazione mediata da A. tumefaciensè considerata un metodo diffuso per la modificazione genica perché porta all'integrazione stabile e a basso numero di copie del T-DNA nel genoma dell'ospite13. Il riso transgenico è stato generato per la prima volta attraverso la trasformazione genica mediata dall'Agrobacteriuma metà degli anni '90 nella cultivar japonica14. Utilizzando questo protocollo, sono state ottenute diverse linee transgeniche in un periodo di 4 mesi con un'efficienza di trasformazione del 10%-30%. Lo studio ha indicato che ci sono due fasi critiche per la trasformazione di successo: una è l'induzione del callo embrionale da semi maturi e un'altra è l'aggiunta di acetosyringone, un composto fenolico, alla coltura batterica durante la co-coltivazione, che consente una maggiore trasformazione dell'efficienza nellepiante 14,15. Questo protocollo è stato ampiamente utilizzato con piccole modifiche in japonica16,17,18,19 così come altre cultivar come indica20,21,22,23 e tropical japonica24,25. Infatti, oltre l'80% degli articoli che descrivono la trasformazione del riso utilizzano la trasformazione genica mediata dall'Agrobacteriumcome strumento13. Ad oggi, sono stati sviluppati diversi protocolli di trasformazione genetica utilizzando semi di riso come materiale di partenza per l'induzione callus16,17,18,19. Tuttavia, si sa molto poco sui giovani infiorescenza come esplicativi per la produzione di callus. Nel complesso, è importante stabilire un protocollo di trasformazione e rigenerazione genica rapido, riproducibile ed efficiente per la genomica funzionale e gli studi sul miglioramento delle colture.

Negli ultimi anni, il progresso della tecnologia CRISPR-Cas9 ha portato a un preciso meccanismo di editing del genoma per comprendere la funzione genica e fornire miglioramenti agronomiamente importanti perl'allevamento delle piante 26,27. CRISPR offre anche notevoli promesse per la manipolazione dello sviluppo riproduttivo maschile e della produzione ibrida. In questo studio, abbiamo utilizzato un sistema di knockout genico utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9 e lo abbiamo accoppiato a un protocollo efficiente di trasformazione genica del riso utilizzando le giovani infiorescenze come espiantamenti, creando così linee sterili maschili stabili per lo studio dello sviluppo riproduttivo.

Protocollo

1. costruzione vettoriale di espressione dell'impianto sgRNA-CAS9 e trasformazione mediata da Agrobacterium

  1. Mirare a un gene sterile maschio OsABCG15 nel riso secondo la letteratura pubblicata28.
  2. Progettare sgRNA per il sito di destinazione situato tra 106-125 bp nel secondo exon di OsABCG15 (Figura 1).
  3. Utilizzare la chinasi T4 polinucleotide per sintetizzare gli oligos sgRNA (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' e 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGGGTGATGCTT').
  4. Utilizzare endonuclease BbsI per digerire il vettore backbone psgR-Cas929.
  5. Ligate gli oligos sgRNA sintetizzati con spina dorsale psgR-Cas9 linearizzata utilizzando T4 ligase seguendo il protocollo del produttore.
  6. Utilizzando HindIII/EcoRI, digerire la cassetta sgRNA dal passaggio 1.5 e subclone nel sito HindIII/EcoRI del vettore binario pCAMBIA1300 per una trasformazione stabile29.
  7. Confermare il plasmide costruito dalla digestione e del sequenziamento degli enzimi. Successivamente, trasformare il costrutto binario nel ceppo Agrobacterium tumefaciens EHA105 e farli crescere su piastre di selezione Kan/Rif a 28 gradi centigradi per 2-3 giorni.

2. Trasformazione genetica del riso e coltura dei tessuti vegetali

  1. Induzione e rigenerazione del callo
    NOTA: utilizzare le infiorescenze di riso giovane fresco come materiale di partenza per indurre il callo (Figura 2).
    1. Raccogliere le giovani infiorescenze dal campo di risaia o casa verde in fase di meiosi, determinato dalla lunghezza del fioretto di 1,6-4,8 mm (Figura 2A)29. Assicurarsi che le infiorescenza di riso siano ricoperte di sheath foglia. Pulire ogni inflorescenza con un tampone alcolico del 70% e lasciarlo asciugare prima di tagliare.
    2. Portare l'infiorescenza in una panca sterile pulita. Tagliarlo a piccoli pezzi (più piccolo è meglio) con forbici sterilizzate e quindi trasferire i tagli in una piastra Petri contenente il mezzo NBD2(Figura 2B, Tabella 1).
    3. Incubare la piastra al buio a 26 gradi centigradi per circa 10-14 giorni per indurre callo (Figura 3A).
      NOTA: Utilizzare direttamente il callus appena formato per l'infiltrazione dell'Agrobacterium (passaggio 2.2.7) o ricondizionare ancora una volta nel nuovo supporto NBD2 per ottenere più callo. Trasferire il callo nel nuovo supporto NBD2 ogni 8-10 giorni.
  2. Trasformazione e co-coltivazione
    1. Utilizzare I batteri A. tumefaciens contenenti il plasmide binario del passaggio 1.6 per la trasformazione. Conservare i ceppi di A. tumefaciens nel mezzo YEB(Tabella 1) con 50% glicerolo a -80 gradi centigradi per un ulteriore utilizzo.
    2. Streak A. tumefaciens da uno stock di glicerolo di -80 gradi centigradi a mezzo di agar YEB contenente antibiotici selettivi(Tabella 1) e crescere a 25-28 gradi centigradi per 48-72 h, per consentire alle colonie di apparire.
    3. Inoculare una singola colonia dalla piastra YEB con antibiotici selettivi a 5 mL di mezzo YEB liquido contenente gli stessi antibiotici selettivi(Tabella 1), in una provetta sterile conica da 50 mL. Agitare su uno shaker orbitale a 250 x g, a 25-28 gradi centigradi fino a quando i batteri non crescono fino a raggiungere un OD600 di 0,5.
    4. Aggiungere 1 mL di sospensione batterica a 100 mL di mezzo YEB(Tabella 1) con gli stessi antibiotici selettivi in un pallone conico da 250 mL e agitare su uno shaker orbitale a 250 x g, a 28 gradi centigradi per 4 h.
    5. Centrifuga a 4.000 x g per 10 min a temperatura ambiente per raccogliere i batteri. Scarta il supernatant.
    6. Risundere il pellet batterico con mezzo AAM-AS(Tabella 1) e diluire la sospensione in un OD600 a 0,4.
      NOTA: L'OD perfetto delle sospensioni batteriche è fondamentale per una trasformazione efficiente. Aiuta ad eliminare la crescita batterica in eccesso sul callo.
    7. Raccogliere circa 150 calli embrionali fragili giallo chiaro in crescita dal punto 2.1.3 in una fiaschetta sterile da 150 mL. Aggiungere la sospensione delle cellule batteriche da 50-75 mL dal punto 2.2.6 nella fiaschetta sterile, quindi aggiungere circa 10-25 mL di mezzo AAM-AS fresco per immergere il calli per 10-20 min, agitando di tanto in tanto.
    8. Versare con attenzione le sospensioni batteriche dal pallone e asciugare le sospensioni batteriche in eccesso dal callo utilizzando carta da filtro sterile #1 carta vessurica. Quindi metterli su un piatto Petri con mezzo NBD-AS (Tabella 1) coperto con una carta da filtro sterile #1. Incubare a 25-28 gradi al buio per 3 giorni e verificare la presenza di crescita batterica.
  3. Selezione per callus resistente
    1. Dopo 3 giorni di co-coltivazione, trasferire il calli in un piatto Petri sterile con una carta da filtro sterile.
    2. Asciugare l'aria il calli per 2 h su una panca pulita. Assicurarsi che il callo non sia conforme alla carta da filtro.
    3. Trasferire il calli in modo uniforme utilizzando un tweezer sterile al mezzo di selezione primaria NBD2 (con 40 mg/L di igromicina e 250 mg/L timentin)(Tabella 1). Cultura calli per 2 settimane a 25-28 gradi centigradi al buio.
    4. Dopo 2 settimane, trasferire calli uniformemente in una nuova piastra contenente fresco mezzo di selezione NBD2 (con 40 mg/L di igromicina e 250 mg/L timentin)(Tabella 1). Cultura il calli per altre 2 settimane a 25-28 gradi centigradi al buio.
  4. Differenziazione callo
    1. Trasferire il callo al nuovo MS Medium (con 25 mg/L di igromicina e 150 mg/L timentin)(tabella 1). Cultura sotto la luce a 25-28 gradi centigradi per circa 2 settimane.
    2. Ripetere il passaggio 2.4.1 ancora una volta.
    3. Trasferire le gemme di tiro al nuovo mezzo MS (con 10 mg/L di igromicina) per proliferare più germogli.
  5. Induzione della radice
    1. Trasferire i nuovi germogli in un supporto di 1/2 MS(Tabella 1). Cultura sotto la luce a 25 gradi centigradi - 28 gradi centigradi. Le piante trasformate producono radici entro 2 settimane.
    2. Dopo 1 settimana, trasferire le piante per pulire i vasi che coprono la pianta per prevenire la disidratazione.

3. Identificazione genotipo

  1. Raccogliere le foglie giovani dalle piante appena generate per l'estrazione totale del DNA utilizzando il metodo cetiltrimetilo bromuro di ammonio (CTAB)metodo 31.
  2. Utilizzando il DNA genomico come modello, scegliere i primer (Hygromycin-F: 5' GATGTTCGACCTCGTATT 3' e Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCGTGCTTTCA 3' situato nella regione di Hygromycin) per eseguire la reazione a catena polimerasi (PCR) per convalidare l'integrazione e le frequenze del transgene(Figura 4). Le seguenti condizioni di PCR: 94 gradi centigradi per 5 min; 36 cicli (94 gradi centigradi per 30 s; 56 gradi centigradi per 30 s; 72 gradi centigradi per 1 min ); 72 gradi centigradi per 7 min. Le reazioni PCR di successo producono un amplificatore da 604 pb.
  3. Eseguire un'altra PCR per amplificare la regione genomica che circonda i siti di destinazione CRISPR utilizzando primer specifici (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCACACAGTTTCT 3' e OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTTTAAACATTGCTAT 3') per identificare il genotipo dei trasformatori. Le condizioni PCR sono le stesse del punto 3.2.
  4. Utilizzare i frammenti PCR del punto 3.3 direttamente per il sequenziamento di Sanger per identificare le mutazioni.

4. Osservare il fenotipo di base del mutante

  1. Preparare la soluzione I2-KI: sciogliere 2 g di KI (ioduro di potassio) in 10 mL di acqua distillata e quindi aggiungere 0,2 g di I2 (iodio reinsediato) in esso. Dopo la miscelazione, portare il volume totale a 100 mL con acqua distillata.
  2. Preparare la soluzione FAA (63% etanolo anidroso, 5% acido acetico glaciale, 5% di formaldeide e 27% di acqua) e mescolare prima dell'uso.
  3. Preparare la soluzione di colorazione blu Toluidine dello 0,5%: sciogliere 0,5 g di toluidina blu in 100 mL di acqua distillata.
  4. Eseguire l'osservazione fenotipico vegetativa, immaginando l'intera pianta con una fotocamera digitale.
  5. Eseguire l'osservazione del fenotipo riproduttivo, rimuovere la palea e lemma dal fioretto. Scatta foto di interi anteni sotto uno stereomicroscopio.
  6. Osservare la vitalità del polline colorando lo iodio.
    1. Raccogliere punte di riso mature prima dell'atesi del fiore, rimuovere la palea e il lemma per rilasciare le anthers.
    2. Prendere 6 anthers e metterli su uno scivolo di vetro. Aggiungere 1 goccia di acqua distillata, schiacciare l'anther con una pinzetta per rilasciare i grani di polline, quindi aggiungere 2–3 gocce di soluzione I2-KI. Coprire con la copertina.
    3. Osservare sotto un microscopio a basso ingrandimento. I grani di polline tinti di nero mostrano una vitalità più vigorosa, nessun colore o colore-marrone tinto sono stentati o degenerati.
  7. Eseguire una sezione semi-sottile di antea di riso
    1. Fissare i fiori di riso da diverse fasi di sviluppo in una soluzione FAA. Aspirare i materiali a 4 gradi centigradi (generalmente 15 min) per consentire al fissativo di penetrare nei tessuti fino a quando il materiale non affonda sul fondo della bottiglia di raccolta.
    2. Sostituire con una nuova soluzione FAA il giorno successivo. Una volta che il materiale affonda sul fondo, sostituire con 70% etanolo e conservare a 4 gradi centigradi per uso a lungo termine.
    3. Disidratare i materiali con diversi gradienti di etanolo (70%, 80%, 95% ogni volta per 30 min, 100% etanolo per 2 h, 100% etanolo contenente un po 'di colorante Safranin per 2 h).
      NOTA: Aggiungere un po 'di colorante Safranin nel secondo 100% etanolo per colorare le antere per una sezione più facile in seguito.
    4. Eseguire l'incorporamento seguendo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). Quindi, cuocere in forno a 60 gradi centigradi per 48 h prima della sezionazione.
    5. Sezionare il campione ad uno spessore di 2 m utilizzando un microtomo. Aggiungere una goccia d'acqua sullo scivolo di vetro. Quindi, raccogliere le sezioni sottili contenenti altri blocchi da parte di alcune e metterli sulla superficie della goccia d'acqua sui vetrini.
    6. Posizionare i vetrini sul bagno d'acqua a 50 gradi centigradi per stendere completamente le sezioni per lasciarle aderire saldamente allo scivolo.
    7. Utilizzare 0.5% toluidine soluzione blu macchiare le diapositive per 30 min. Quindi, risciacquare con acqua e asciugare nel cappuccio di fumi. Sigillare con colla neutra. Posizionare delicatamente un coperture sul scivolo e asciugare nel cofano di fumi.
    8. Osservare e fotografare il campione al microscopio.

Risultati

Dimostrato qui è l'uso della tecnologia di editing genico per creare una linea sterile maschile per la ricerca futura da Agrobacterium-mediato trasformazione genetica nel riso. Per creare la linea sterile maschile di osabcg15, èstata utilizzata la mutagenesi mediata CRISPR-CAS9 per la costruzione di vettori binari. Lo sgRNA è stato guidato dal promotore OsU3, mentre la cassetta di espressione di hSpCas9 è stata guidata dal doppio promotore 35S, e il vettore intermedio è stato assemblato in un unico...

Discussione

I mutanti sterili maschili artificiali sono tradizionalmente generati da mutagenesi fisica, chimica o biologica casuale. Anche se si tratta di tecniche potenti, la loro natura casuale non riesce a capitalizzare la grande quantità di conoscenze genomiche moderne che ha il potenziale per fornire miglioramenti su misura nell'allevamentomolecolare 32. Il sistema CRISPR-Cas9 è stato ampiamente utilizzato nelle piante grazie ai suoi mezzi semplici e convenienti per manipolare e modificare il DNA

Divulgazioni

Nessuno.

Riconoscimenti

Gli autori vorrebbero riconoscere Xiaofei Chen per aver fornito le giovani infiorescenze di riso e l'assistenza nel rendere la coltura del tessuto di riso mezzo. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (31900611).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Naphthaleneacetic acidSigma-AldrichN0640
2，4-Dichlorophenoxyacetic AcidSigma-AldrichD7299
6-Benzylaminopurine (6-BA)Sigma-AldrichB3408
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
AgarSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000561
Ammonium sulfateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10002918
Aneurine hydrochlorideSigma-AldrichT4625
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218
Bacteriological peptoneSangon BiotechA100636
Beef extractSangon BiotechA600114
Boric acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004808
Calcium chloride dihydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd20011160
Casein acid hydrolysateBeijing XMJ Scientific Co., LtdC184
Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10007216
Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10008218
D(+)-Glucose anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63005518
D-sorbitolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63011037
EDTA, Disodium Salt, DihydrateSigma-AldrichE5134
EOS Digital SLR and Compact System CamerasCanonEOS 700D
FormaldehydeSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010018
Fully Automated Rotary MicrotomeLeica BiosystemsLeica RM 2265
Glacial acetic acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000208
GlycineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62011516
HygromycinBeijing XMJ Scientific Co., LtdH370
InositolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63007738
IodineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10011517
Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012116
KanamycineBeijing XMJ Scientific Co., LtdK378
KinetinSigma-AldrichK0753
L-ArginineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004034
L-Aspartic acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004736
L-GlutamineBeijing XMJ Scientific Co., LtdG229
L-prolineBeijing XMJ Scientific Co., LtdP698
Magnesium sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013018
Manganese sulfate monohydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013418
MicroscopesNIKONEclipse 80i
MSPhytotechM519
Nicotinic acidSigma-AldrichN0765
PhytagelSigma-AldrichP8169
Potassium chlorideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016308
Potassium dihydrogen phosphateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017608
Potassium iodideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017160
Potassium nitrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001721933
Pyridoxine Hydrochloride (B6)Sigma-Aldrich47862
RifampicinBeijing XMJ Scientific Co., LtdR501
Sodium hydroxideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
Sodium molybdate dihydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019816
Stereo microscopesLeica MicrosystemsLeica M205 A
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10021418
Technovit embedding Kits 7100Heraeus Teknovi, Germany14653
TimentinBeijing XMJ Scientific Co., LtdT869
Toluidine Blue OSigma-AldrichT3260
Water bath for paraffin sectionsLeica BiosystemsLeica HI1210
Yeast extractSangon BiotechA515245
Zinc sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10024018

Riferimenti

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