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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce travail décrit l’utilisation de la technologie d’édition du génome CRISPR-Cas9 pour éliminer le gène endogène OsABCG15 suivi d’un protocole de transformation modifié sous médiation agrobactériepour produire une lignée stable mâle-stérile dans le riz.

Résumé

La stérilité masculine est un trait agronomique important pour la production de semences hybrides qui se caractérise habituellement par des défauts fonctionnels dans les organes reproducteurs mâles/gamètes. Les progrès récents de la technologie d’édition du génome CRISPR-Cas9 permettent une efficacité d’édition élevée et des mutations par KO de gènes candidats endogènes à des sites spécifiques. En outre, la transformation génétique du riz par agrobactérieest également une méthode clé pour la modification des gènes, qui a été largement adoptée par de nombreux laboratoires publics et privés. Dans cette étude, nous avons appliqué des outils d’édition du génome CRISPR-Cas9 et avons réussi à générer trois lignées mutantes stériles mâles par modification du génome ciblée d’OsABCG15 dans un cultivar japonica. Nous avons utilisé une méthode modifiée de transformation du riz sous médiation agrobactériequi pourrait fournir d’excellents moyens d’émasculation génétique pour la production de semences hybrides dans le riz. Les plantes transgéniques peuvent être obtenues dans un délai de 2 à 3 mois et les transformateurs homozygotes ont été examinés par génotypage à l’aide de l’amplification pcr et du séquençage sanger. La caractérisation phénotypique de base de la ligne mâle d’homozygote stérile a été exécutée par l’observation microscopique des organes reproducteurs mâles de riz, l’analyse de viabilité de pollen par l’iodure de potassium d’iode (I2-KI) tachetant semi-mince-sectionment de développement des anthers.

Introduction

Le riz est la culture alimentaire la plus importante, en particulier dans les pays en développement, et représente un aliment de base pour plus de la moitié de la population mondiale. Dans l’ensemble, la demande de céréales de riz augmente et devrait augmenter de 50 % d’ici 2030 et de 100 % d’ici 20501,2. Les améliorations futures du rendement du riz devront tirer parti de diverses ressources moléculaires et génétiques qui font du riz un excellent modèle pour la recherche sur les plantes monocotyledonous. Il s’agit notamment d’un système de transformation efficace, d’une carte moléculaire avancée et d’une base de données accessible au public des balises de séquence exprimées, qui ont été générées sur de nombreuses années3,4. Une stratégie pour améliorer le rendement des cultures est la production de semences hybrides5, dont un élément central est la capacité de manipuler la fertilité masculine. Comprendre le contrôle moléculaire de la fertilité masculine dans les cultures céréalières peut aider à traduire les connaissances clés en techniques pratiques pour améliorer la production de semences hybrides et améliorer la productivité des cultures6,7.

La transformation génétique est un outil clé pour la recherche fondamentale et l’agriculture commerciale, car elle permet l’introduction de gènes étrangers ou la manipulation de gènes endogènes dans les plantes cultivées, et entraîne la génération de lignées génétiquement modifiées. Un protocole de transformation approprié peut aider à accélérer les études de biologie génétique et moléculaire pour la compréhension fondamentale de la régulation des gènes8. Chez les bactéries, la transformation génétique a lieu naturellement; cependant, dans les plantes, il est effectué artificiellement en utilisant des techniques de biologie moléculaire9,10. Agrobacterium tumefaciens est une bactérie gramnégative transmise par le sol qui cause la maladie de la gale de la couronne chez les plantes en transférant t-ADN, une région de son Plasmide Ti, dans la cellule végétale via un système de sécrétion de type IV11,12. Chez les plantes, la transformation sous médiation A. tumefaciensest considérée comme une méthode répandue de modification génétique parce qu’elle conduit à l’intégration stable et faible du nombre de copies de l’ADN T dans le génome hôte13. Le riz transgénique a été généré pour la première fois par la transformation des gènes sous médiation Agrobacteriumau milieu des années 1990 dans le cultivarjaponica 14. À l’aide de ce protocole, plusieurs lignées transgéniques ont été obtenues en l’espace de 4 mois avec une efficacité de transformation de 10 à 30 %. L’étude a indiqué qu’il y a deux étapes critiques pour la transformation réussie : l’une est l’induction du callus embryogène des graines mûres et l’autre est l’addition de l’acétosyringone, un composé phénolique, à la culture bactérienne pendant la co-culture, qui permet une plus grande efficacité de transformation dans les plantes14,15. Ce protocole a été largement utilisé avec des modifications mineures dans japonica16,17,18,19 ainsi que d’autres cultivars tels que indica20,21,22,23 et tropical japonica24,25. En effet, plus de 80 % des articles décrivant la transformation du riz utilisent la transformation génétique d’Agrobacteriumcomme outil13. À ce jour, plusieurs protocoles de transformation génétique ont été développés en utilisant les semences de riz comme matériau de départ pour l’induction de callus16,17,18,19. Cependant, on sait très peu de choses sur l’inflorescence des jeunes comme explants pour la production de callus. Dans l’ensemble, il est important d’établir un protocole de transformation et de régénération des gènes rapide, reproductible et efficace pour la génomique fonctionnelle et les études sur l’amélioration des cultures.

Ces dernières années, l’avancement de la technologie CRISPR-Cas9 a abouti à un mécanisme précis d’édition du génome pour comprendre la fonction des gènes et apporter des améliorations agronomiquement importantes pour la sélection végétale26,27. CRISPR offre également des promesses considérables pour la manipulation du développement reproducteur masculin et de la production hybride. Dans cette étude, nous avons utilisé un système de knock-out de gène utilisant la technologie CRISPR-Cas9 et l’avons couplé à un protocole efficace de transformation de gène de riz utilisant de jeunes inflorescences comme explants, créant ainsi des lignes stériles mâles stables pour l’étude du développement reproducteur.

Protocole

1. construction vectorielle d’expression végétale sgRNA-CAS9 et transformation sous médiation Agrobacterium

  1. Cibler un gène stérile mâle OsABCG15 dans le riz selon la littérature publiée28.
  2. Conception sgRNA pour le site ciblé situé entre 106-125 pb dans le deuxième exon d’OsABCG15 (Figure 1).
  3. Utilisez la kinase de polynucléotide T4 pour synthétiser les oligos sgRNA (sgR-OsABCG15-F : 5'TGGCAAGCATCCACTCAAGGAT3' et 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGGATGTGCTT').
  4. Utilisez endonuclease BbsI pour digérer le vecteur de l’épine dorsale psgR-Cas929.
  5. Lier les oligos sgRNA synthétisés avec l’épine dorsale linéarisée de psgR-Cas9 utilisant la ligase T4 suivant le protocole du fabricant.
  6. À l’aide de HindIII/EcoRI, digèrent la cassette sgRNA de l’étape 1.5 et la subclone dans le site HindIII/EcoRI du vecteur binaire pCAMBIA1300 pour une transformation stable29.
  7. Confirmer le plasmide construit par digestion et séquençage enzymatiques. Plus tard, transformez la construction binaire en souche Agrobacterium tumefaciens EHA105 et cultivez-les sur des plaques de sélection Kan/Rif à 28 °C pendant 2–3 jours.

2. Transformation génétique du riz et culture des tissus végétaux

  1. Induction et régénération de Callus
    REMARQUE : Utilisez de jeunes inflorescences de riz frais comme matériau de départ pour induire le callus (figure 2).
    1. Recueillir les jeunes inflorescences du champ de paddy ou de la maison verte au stade de la méiose, déterminée par la longueur du fleuret de 1,6-4,8 mm (figure 2A)29. Assurez-vous que les inflorescences de riz sont recouvertes d’une gaine de feuilles. Essuyez chaque inflorescence avec un écouvillon de 70 % d’alcool et laissez-le sécher avant de couper.
    2. Porter l’inflorescence sur un banc stérile propre. Coupez-le en petits morceaux (le plus petit le mieux) avec des ciseaux stérilisés, puis transférez les boutures sur une plaque Petri contenant un milieu NBD2 (figure 2B, tableau 1).
    3. Incuber la plaque dans l’obscurité à 26 °C pendant environ 10-14 jours pour induire le callus (figure 3A).
      REMARQUE : Utilisez directement le callus nouvellement formé pour l’infiltration d’Agrobacterium (étape 2.2.7) directement ou reconditionnez une fois de plus dans un milieu neuf NBD2 pour obtenir plus de callus. Transférez le calus dans le nouveau support NBD2 tous les 8 à 10 jours.
  2. Transformation et co-culture
    1. Utilisez les bactéries A. tumefaciens contenant le plasmide binaire de l’étape 1.6 pour la transformation. Conserver les souches de A. tumefaciens dans le milieu YEB (tableau 1) avec 50 % de glycérol à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
    2. Streak A. umefaciens d’un stock de glycérol de -80 °C à un milieu agar YEB contenant des antibiotiques sélectifs (tableau 1) et se développer à 25–28 °C pendant 48–72 h, pour permettre aux colonies d’apparaître.
    3. Inoculer une seule colonie de la plaque YEB avec des antibiotiques sélectifs à 5 ml de milieu liquide YEB contenant les mêmes antibiotiques sélectifs (tableau 1), dans un tube à essai stérile conique de 50 mL. Agiter sur un shaker orbital à 250 x g,à 25–28 °C jusqu’à ce que les bactéries atteignent un OD600 de 0,5.
    4. Ajouter 1 ml de suspension bactérienne à 100 ml de milieu YEB (tableau 1) avec les mêmes antibiotiques sélectifs dans une fiole conique de 250 ml et secouer sur un shaker orbital à 250 x g,à 28 °C pendant 4 h.
    5. Centrifugeuse à 4 000 x g pendant 10 min à température ambiante pour recueillir les bactéries. Jetez le supernatant.
    6. Resuspendez la pastille bactérienne avec un milieu AAM-AS (tableau 1) et diluez la suspension à un OD600 = 0,4.
      REMARQUE : L’OD parfaite de suspension bactérienne est essentielle pour une transformation efficace. Il aide à éliminer la croissance bactérienne excessive sur le callus.
    7. Recueillir environ 150 calli embryonnaire fragiles jaune clair de croissance saine de l’étape 2.1.3 dans une fiole stérile de 150 mL. Ajouter la suspension de cellules bactériennes de 50 à 75 mL à partir de l’étape 2.2.6 dans la fiole stérile, puis ajoutez quelques 10 à 25 mL frais AAM-AS moyen pour immerger le calli pendant 10–20 min, en secouant de temps en temps.
    8. Versez soigneusement la suspension bactérienne de la fiole et séchez l’excès de suspension bactérienne du callus à l’aide de papier filtre stérile #1 ou de papier de soie. Placez ensuite sur une boîte de Pétri avec un support NBD-AS (Tableau 1) recouvert d’un papier filtre stérile #1. Incuber à 25–28 °C dans l’obscurité pendant 3 jours et vérifier la surcroissance bactérienne.
  3. Sélection pour les callus résistants
    1. Après 3 jours de co-culture, transférer le calli dans une boîte de Pétri stérile avec un papier filtre stérile.
    2. Sécher à l’air le calli pendant 2 h sur un banc propre. Assurez-vous que le callus n’est pas respecté au papier filtre.
    3. Transférer le calli uniformément à l’aide d’une pince stérile vers le milieu de sélection primaire NBD2 (avec 40 mg/L d’hygromycine et 250 mg/L timentin) (tableau 1). Culture calli pendant 2 semaines à 25–28 °C dans l’obscurité.
    4. Après 2 semaines, transférer le calli uniformément dans une nouvelle plaque contenant un nouveau milieu de sélection NBD2 (avec 40 mg/L d’hygromycine et 250 mg/L timentin) (Tableau 1). Culture le calli pour un autre 2 semaines à 25–28 °C dans l’obscurité.
  4. Différenciation de Callus
    1. Transférer le callus à la MS moyenne fraîche (avec 25 mg/L d’hygromycine et 150 mg/L timentin) (tableau 1). Culture sous la lumière à 25–28 °C pendant environ 2 semaines.
    2. Répétez l’étape 2.4.1 une fois de plus.
    3. Transférer les bourgeons de pousse vers le nouveau milieu de la SP (avec 10 mg/L d’hygromycine) pour proliférer plus de pousses.
  5. Induction de racine
    1. Transférer les nouvelles pousses dans 1/2 MS moyen (Tableau 1). Culture sous la lumière à 25 °C - 28 °C. Les plantes transformées produisent des racines en 2 semaines.
    2. Après 1 semaine, transférer les plantes pour nettoyer les pots couvrant la plante pour éviter la déshydratation.

3. Identification du génotype

  1. Recueillir de jeunes feuilles provenant de plantes nouvellement générées pour l’extraction totale de l’ADN à l’aide de la méthode31du bromure d’ammonium ctyltriméthylique (CTAB).
  2. En utilisant l’ADN génomique comme modèle, choisissez les amorces (Hygromycine-F: 5' GATGGGGCGCCTGTATT 3' et Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCNTGCTTCA 3' situé dans la région d’Hygromycine) pour effectuer la réaction de la chaîne de polymérase (PCR) pour valider l’intégration transgène et les fréquences (Figure 4). Conditions pcr suivantes: 94 °C pendant 5 min; 36 cycles (94 °C pour 30 s; 56 °C pour 30 s; 72 °C pendant 1 min); 72 °C pendant 7 min. Les réactions réussies de PCR donnent un amplicon de 604 bp.
  3. Effectuer un autre PCR pour amplifier la région génomique entourant les sites cibles CRISPR à l’aide d’amorces spécifiques (OsABG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCACTGTTTTCT 3' et OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTTAAAAAACTAT 3') pour identifier le génotype des transformateurs. Les conditions pcr sont les mêmes qu’à l’étape 3.2.
  4. Utilisez des fragments de PCR de l’étape 3.3 directement pour le séquençage sanger pour identifier les mutations.

4. Observez le phénotype de base du mutant

  1. Préparer la solution I2-KI: dissoudre 2 g de KI (iodure de potassium) dans 10 mL d’eau distillée, puis ajouter 0,2 g de I2 (iode resublimé) dedans. Après le mélange, porter le volume total à 100 mL avec de l’eau distillée.
  2. Préparer la solution FAA (63 % d’éthanol anhydre, 5 % d’acide acétique glaciaire, 5 % de formaldéhyde et 27 % d’eau) et mélanger avant d’utiliser.
  3. Préparer la solution de coloration bleue toluidine de 0,5 % : dissoudre 0,5 g de bleu toluidine dans 100 mL d’eau distillée.
  4. Effectuer l’observation phénotypique végétative, en imaginant les plantes entières avec un appareil photo numérique.
  5. Effectuer l’observation de phénotype de reproduction, enlever le palea et lemme du fleuret. Prenez des photos d’anths entiers sous un stéréomicroscope.
  6. Observez la viabilité du pollen par coloration à l’iode.
    1. Choisissez des pointes de riz matures avant l’anthèse de la fleur, retirez la palea et lemme pour libérer les anthères.
    2. Prenez 6 anthers et placez-les sur une lame de verre. Ajouter 1 goutte d’eau distillée, écraser l’anthère bien avec des pinces à épiler pour libérer les grains de pollen, puis ajouter 2 à 3 gouttes de solution I2-KI. Couvrir avec le couvercle.
    3. Observez sous un microscope à faible grossissement. Les grains de pollen teints en noir montrent une viabilité plus vigoureuse, aucune couleur ou teint jaune-brun sont rabougris ou dégénérés.
  7. Effectuer une section semi-mince d’anther de riz
    1. Fixer les fleurs de riz de différents stades de développement dans une solution FAA. Passer l’aspirateur à 4 °C (généralement 15 min) pour permettre au fixatif de pénétrer dans les tissus jusqu’à ce que le matériau coule au fond de la bouteille de collecte.
    2. Remplacez par une nouvelle solution FAA le lendemain. Une fois que le matériau descend vers le fond, remplacer par 70% d’éthanol et conserver à 4 °C pour une utilisation à long terme.
    3. Déshydrater les matériaux avec différents gradients d’éthanol (70%, 80%, 95% à chaque fois pendant 30 min, 100% éthanol pour 2 h, 100% éthanol contenant un peu de colorant Safranin pendant 2 h).
      REMARQUE : Ajoutez un peu de colorant Safranin dans le deuxième éthanol 100% pour colorer les anths pour faciliter la sectionnage par la suite.
    4. Effectuer l’incorporation en suivant les instructions du fabricant (Table des matériaux). Ensuite, cuire au four à 60 °C pendant 48 h avant de les sectionr.
    5. Sectionner l’échantillon à une épaisseur de 2 μm à l’aide d’un microtome. Ajouter une goutte d’eau sur la lame de verre. Ensuite, ramasser les fines sections contenant des blocs d’anthères par forceps et les mettre sur la surface de la goutte d’eau sur les toboggans.
    6. Placez les lames sur le bain d’eau à 50 °C pour étaler complètement les sections pour qu’elles adhèrent fermement à la glissière.
    7. Utilisez 0,5% de solution bleu toluidine tacher les lames pendant 30 min. Puis, rincer à l’eau et sécher dans le capot de fumée. Sceller avec de la colle d’arbre neutre. Placez délicatement un couvercle sur la glissière et séchez dans le capot de fumée.
    8. Observez et photographiez l’échantillon au microscope.

Résultats

Il est démontré ici l’utilisation de la technologie d’édition de gènes pour créer une ligne stérile masculine pour la recherche future par Agrobacterium-médié transformation génétique dans le riz. Pour créer la ligne stérile mâle d’osabcg15, la mutagenèse à médiation CRISPR-CAS9 a été utilisée pour la construction de vecteurs binaires. Le sgRNA a été piloté par le promoteur OsU3, tandis que la cassette d’expression de hSpCas9 a été entraînée par le double promoteur 35S,...

Discussion

Les mutants stériles mâles géniques artificiels sont traditionnellement générés par une mutagenèse physique, chimique ou biologique aléatoire. Bien qu’il s’agit de techniques puissantes, leur nature aléatoire ne parvient pas à tirer parti de la grande quantité de connaissances génomiques modernes qui a le potentiel d’apporter des améliorations sur mesure dans la reproduction moléculaire32. Le système CRISPR-Cas9 a été largement utilisé dans les plantes en raison de ses moye...

Déclarations de divulgation

Aucun.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Xiaofei Chen d’avoir fourni les jeunes inflorescences de riz et d’avoir aidé à faire de la culture des tissus de riz un milieu. Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (31900611).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Naphthaleneacetic acidSigma-AldrichN0640
2, 4-Dichlorophenoxyacetic AcidSigma-AldrichD7299
6-Benzylaminopurine (6-BA)Sigma-AldrichB3408
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
AgarSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000561
Ammonium sulfateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10002918
Aneurine hydrochlorideSigma-AldrichT4625
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218
Bacteriological peptoneSangon BiotechA100636
Beef extractSangon BiotechA600114
Boric acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004808
Calcium chloride dihydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd20011160
Casein acid hydrolysateBeijing XMJ Scientific Co., LtdC184
Cobalt(II) chloride hexahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10007216
Copper(II) sulfate pentahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10008218
D(+)-Glucose anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63005518
D-sorbitolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63011037
EDTA, Disodium Salt, DihydrateSigma-AldrichE5134
EOS Digital SLR and Compact System CamerasCanonEOS 700D
FormaldehydeSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010018
Fully Automated Rotary MicrotomeLeica BiosystemsLeica RM 2265
Glacial acetic acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000208
GlycineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62011516
HygromycinBeijing XMJ Scientific Co., LtdH370
InositolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63007738
IodineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10011517
Iron(II) sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012116
KanamycineBeijing XMJ Scientific Co., LtdK378
KinetinSigma-AldrichK0753
L-ArginineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004034
L-Aspartic acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004736
L-GlutamineBeijing XMJ Scientific Co., LtdG229
L-prolineBeijing XMJ Scientific Co., LtdP698
Magnesium sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013018
Manganese sulfate monohydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013418
MicroscopesNIKONEclipse 80i
MSPhytotechM519
Nicotinic acidSigma-AldrichN0765
PhytagelSigma-AldrichP8169
Potassium chlorideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016308
Potassium dihydrogen phosphateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017608
Potassium iodideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017160
Potassium nitrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001721933
Pyridoxine Hydrochloride (B6)Sigma-Aldrich47862
RifampicinBeijing XMJ Scientific Co., LtdR501
Sodium hydroxideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
Sodium molybdate dihydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019816
Stereo microscopesLeica MicrosystemsLeica M205 A
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10021418
Technovit embedding Kits 7100Heraeus Teknovi, Germany14653
TimentinBeijing XMJ Scientific Co., LtdT869
Toluidine Blue OSigma-AldrichT3260
Water bath for paraffin sectionsLeica BiosystemsLeica HI1210
Yeast extractSangon BiotechA515245
Zinc sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10024018

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Réimpressions et Autorisations

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