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요약

이 작품은 CRISPR-Cas9 게놈 편집 기술을 사용하여 내인성 유전자 OsABCG15를 녹아웃한 다음 수정된 Agrobacterium-매개변환 프로토콜을 사용하여 쌀에서 안정적인 남성 멸균 라인을 생성합니다.

초록

남성 멸균은 일반적으로 남성 생식 기관/게임테의 기능적 결함을 특징으로 하는 하이브리드 종자 생산을 위한 중요한 농업 특성입니다. CRISPR-Cas9 게놈 편집 기술의 최근 발전은 특정 사이트에서 내인성 후보 유전자의 높은 편집 효능 및 시간 절약 녹아웃 돌연변이를 허용합니다. 또한, 쌀의 아그로박테리움-중재된유전적 변화는 또한 많은 공공 및 민간 실험실에서 널리 채택된 유전자 변형을 위한 중요한 방법입니다. 이 연구에서는 CRISPR-Cas9 게놈 편집 도구를 적용하고 japonica 품종에서 OsABCG15의 표적 게놈 편집을 통해 3개의 남성 멸균 돌연변이 라인을 성공적으로 생성했습니다. 우리는 쌀에서 하이브리드 종자 생산을위한 유전 방출의 우수한 수단을 제공 할 수있는 수정 된 Agrobacterium-매개 쌀 변환 방법을 사용했다. 형질전환 식물은 2-3개월 이내에 얻을 수 있으며, 동종변성 변압제는 PCR 증폭 및 Sanger 시퀀싱을 사용하여 유전자를 사용하여 스크리닝하여 스크리닝하였다. 남성 멸균 균성 라인의 기본 피노티픽 특성화는 쌀 남성 생식 기관의 현미경 관찰에 의해 수행되었으며, 요오드 칼륨 요오드 (I2-KI)에 의한 꽃가루 생존 가능성 분석에 의해 개발 중인 멸균의 반 박형 단면화를 염색하였다.

서문

쌀은 특히 개발도상국에서 가장 중요한 식품 작물이며, 전 세계 인구의 절반 이상을 위한 주식 식품입니다. 전체적으로 쌀알에 대한 수요가 증가하고 있으며 2030년까지 50%, 2050년1,2에100% 증가할 것으로 예상됩니다.1 쌀 수율의 향후 개선은 쌀을 단장 식물 연구를위한 훌륭한 모델로 만드는 다양한 분자 및 유전 자원을 활용해야합니다. 여기에는 효율적인 변환 시스템, 고급 분자 맵 및 표현된 시퀀스 태그의 공개적으로 액세스할 수 있는 데이터베이스가 포함되며, 이는 수년 동안 생성된3,,4. 작물 수확량을 개선하기 위한 한 가지 전략은 하이브리드 종자 생산5이며,그 중 핵심 요소는 남성 다산을 조작하는 기능입니다. 시리얼 작물에서 남성 다산의 분자 제어를 이해 하이브리드 종자 생산을 개선 하 고 작물 생산성 향상 을 위해 실용적인 기술로 주요 지식을 번역 하는 데 도움이 될 수 있습니다6,,7.

유전자 변환은 작물 식물에 있는 외국 유전자의 소개 또는 내인성 유전자의 조작을 가능하게 하고, 유전자 변형 선의 생성귀착되기 때문에 기본적인 연구 및 상업적 농업을 위한 중요한 공구입니다. 적절한 변형 프로토콜은 유전자 조절8의근본적인 이해를 위한 유전 및 분자 생물학 연구를 가속화하는 데 도움이 될 수 있다. 박테리아에서, 유전 변환은 자연적으로 일어난다; 그러나, 식물에서는 분자 생물학 기법9,,10을사용하여 인위적으로 수행된다. Agrobacterium tumefaciens는 T-DNA를 전송하여 식물에 크라운 담즙 질환을 일으키는 토양 매개, 그램 음성 박테리아, T-DNA의 영역, 유형 IV 분비 시스템을 통해 식물 세포로11,,12. 식물에서, A. tumefaciens-매개변환은 숙주 게놈(13)으로 T-DNA의 안정적이고 낮은 복사13수 통합으로 유도되기 때문에 유전자 변형을 위한 광범위한 방법으로 간주됩니다. 트랜스제닉 쌀은 1990년대 중반 자포니카 품종14에서 아그로박테리움-중재유전자변환을 통해 처음 생성되었다. 이 프로토콜을 사용하여 변환 효율이 10%-30%인 4개월 이내에 여러 트랜스제닉 라인을 획득했습니다. 연구 결과는 성공적인 변환을 위한 2개의 중요한 단계가 있다는 것을 표시했습니다: 하나는 성숙한 씨앗에서 배아 원소의 유도이고 다른 하나는 식물14,,15에서더 높은 변환 효율성을 허용하는 공동 재배 도중 세균 문화에 아세토시링곤, 페놀 화합물의 추가입니다. 이 프로토콜은 japonica16,17,,,18,,19뿐만 아니라 인디카,20,21,22, 23및 열대 japonica23 ,24,,25와같은 다른 품종에서 사소한 변경으로 광범위하게 사용되었습니다., 실제로, 쌀 변환을 설명하는 기사의 80% 이상이 Agrobacterium-매개유전자 변환을 도구로사용한다(13). 현재까지, 여러 유전자 변형 프로토콜은,쌀 씨를 서두유도16,17,,18,19의시작 재료로 사용하여 개발되었다., 그러나, 거의 콜러스 생산을위한 흥분으로 젊은 꽃에 대해 알려져있다. 전반적으로 기능성 유전체학 및 작물 개선에 대한 연구를 위한 신속하고 재현 가능하며 효율적인 유전자 변환 및 재생 프로토콜을 확립하는 것이 중요합니다.

최근 몇 년 동안 CRISPR-Cas9 기술의 발전은 유전자 기능을 이해하고 식물 사육26,,27에대한 농업적으로 중요한 개선을 제공하는 정밀한 게놈 편집 메커니즘을 초래했다. CRISPR은 또한 남성 생식 개발 및 하이브리드 생산의 조작에 대한 상당한 약속을 제공합니다. 이 연구에서는 CRISPR-Cas9 기술을 이용한 유전자 녹아웃 시스템을 활용하여 젊은 꽃식물을 사용하여 효율적인 쌀 유전자 변형 프로토콜에 결합하여 생식 발달 연구를 위한 안정적인 남성 멸균 선을 생성했습니다.

프로토콜

1. sgRNA-CAS9 플랜트 발현 벡터 시공 및 아그로박테리움-중재된변환

  1. 발표된문헌(28)에따라 쌀에 남성 멸균 유전자 OsABCG15를 표적으로 한다.
  2. OsABCG15의 두 번째 엑소에서 106-125 bp 사이에 위치한 표적 부위에 대한 sgRNA설계(그림 1).
  3. T4 폴리뉴클레오티드 키나아제는 sgRNA 올리고(sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGAT3' 및 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGATGTGCTT')를 합성합니다.
  4. endonuclease BbsI를 사용하여 psgR-Cas9 백본벡터(29)를소화한다.
  5. 제조업체의 프로토콜에 따라 T4 리구아제를 사용하여 선형화된 psgR-Cas9 백본으로 합성된 sgRNA 올리고를 리게이트합니다.
  6. 힌드III/에코리를 사용하여, sgRNA 카세트를 1단계에서 1.5단계로부터 소화하고 pCAMBIA1300 바이너리 벡터의 힌드III/에코리 부위로 서브클론을 소화하여 안정적인변환(29)을한다.
  7. 효소 소화 및 염열에 의해 생성된 플라스미드를 확인합니다. 나중에, 이진 구조를 Agrobacterium tumefaciens 균주 EHA105로 변환하고 2-3 일 동안 28 °C에서 칸 / 리프 선택 플레이트에 성장한다.

2. 쌀 유전 적 변형 및 식물 조직 배양

  1. 캘러스 유도 및 재생
    참고: 신선한 젊은 쌀 꽃집을 시동재료로 사용하여 캘러스(그림2)를유도합니다.
    1. 1.6-4.8 mm(그림 2A)29의꽃 길이에 의해 결정 된 meiosis 단계에서 논 또는 녹색 집에서 젊은 꽃집을 수집합니다. 쌀 꽃피는 잎 칼집으로 덮여 있는지 확인합니다. 70% 알코올 면봉으로 각 꽃집을 닦고 절단하기 전에 건조하게 하십시오.
    2. 깨끗한 멸균 벤치에 꽃을 가져옵니다. 살균 된 가위로 작은 조각 (더 작은 것)으로 자른 다음 절단을 NBD2 배지(그림 2B, 표 1)가함유 된 페트리 플레이트로 옮겨넣습니다.
    3. 약 10-14일 동안 26°C에서 어둠 속에서 플레이트를 배양하여 캘러스(도3A)를유도한다.
      참고: 새로 형성된 콜러스를 Agrobacterium 침투(단계 2.2.7)에 직접 사용하거나 신선한 NBD2 배지에서 한 번 더 재조정하여 더 많은 callus를 얻습니다. 8-10일마다 캘러스를 새로운 NBD2 매체로 전송합니다.
  2. 변환 및 공동 재배
    1. 변형을 위해 1.6 단계에서 이진 플라스미드를 함유한 A. tumefaciens 박테리아를 사용한다. A. tumefaciens 균주를 YEB배지(표 1)에저장하여 -80°C에서 글리세롤을 50% 저장합니다.
    2. -80°C 글리세롤 스톡에서 선택적항생제(표 1)를함유한 YEB 천 배지로 줄무늬 A. 투메파시엔스는 48-72h에 대해 25-28°C로 성장하여 식민지가 나타날 수 있도록 한다.
    3. 50mL 원추형 멸균 시험관에서 동일한 선택적항생제(표 1)를함유하는 액체 YEB 배지의 5mL에 선택적 항생제를 가진 YEB 플레이트로부터 단일 콜로니를 접종한다. 박테리아가 0.5의 OD 600으로 성장할 때까지 250 x g에서600 궤도 셰이커를 흔들어 25-28 °C에서 흔들어주세요.
    4. 250mL 원추형 플라스크에서 동일한 선택적 항생제를 가진 YEB배지(표 1)의100mL에 세균현탁액 1mL을 넣고 250 x g에서궤도 셰이커를 흔들어 4h에 28°C로 흔들어 줍니다.
    5. 심열기4,000 x g에서 10 분 동안 실온에서 박테리아를 수집합니다. 상부체를 폐기합니다.
    6. AAM-AS배지(표 1)로세균펠릿을 재연하고 현탁액을 OD600 = 0.4로 희석한다.
      참고: 세균 현탁액의 완벽한 OD는 효율적인 변환에 매우 중요합니다. 그것은 callus에 과잉 세균성 성장을 제거에 도움이.
    7. 약 150mL 멸균 플라스크로 단계 2.1.3에서 약 150 건강한 성장하는 밝은 노란색 연약한 배아 성 칼리를 수집합니다. 50-75mL 세균세포 현탁액을 멸균 플라스크에 2.6단계부터 추가한 다음, 10-25mL의 신선한 AAM-AS 배지를 추가하여 10-20분 동안 칼리를 담그고 가끔 흔들어 줍니다.
    8. 플라스크에서 세균 현탁액을 조심스럽게 붓고 멸균 필터 용지 #1 또는 티슈 페이퍼를 사용하여 캘러스에서 과도한 세균 현탁액을 건조시라. 그런 다음 멸균 필터 종이로 덮인 NBD-AS매체(표 1)로페트리 접시에 #1 놓습니다. 3 일 동안 어둠 속에서 25-28 °C에서 배양하고 세균 성 과성장을 확인합니다.
  3. 내성 콜러스 선택
    1. 3일간의 공동 재배 후, 멸균 필터 용지를 사용하여 멸균 페트리 접시에 칼리를 옮기.
    2. 깨끗한 벤치에서 2 시간 동안 칼리를 공기 건조시하십시오. 캘러스가 필터 용지에 부착되지 않았는지 확인합니다.
    3. 1차 선택 매체 NBD2(40 mg/L hygromycin 및 250 mg/L timentin)(표1)로멸균 트위저를 사용하여 캘리를 균등하게 전송한다. 어둠 속에서 25-28 °C에서 2 주 동안 컬쳐 칼리.
    4. 후 2 주, 신선한 선택 매체 NBD2를 포함하는 새로운 플레이트에 고르게 전송 캘리 (와 40 mg/L hygromycin 및 250 mg/L timentin)(표 1). 어둠 속에서 25-28 °C에서 또 다른 2 주 동안 칼리를 문화합니다.
  4. 캘러스 차별화
    1. 신선한 MS 매체로 캘러스를 전송 (와 25 mg/L hygromycin 및 150 mg/L timentin)(표 1). 약 2 주 동안 25-28 °C에서 빛 아래 배양.
    2. 2.4.1 단계를 한 번 더 반복합니다.
    3. 촬영 싹을 새로운 MS 매체(10 mg/L hygromycin)로 전송하여 더 많은 촬영을 증식합니다.
  5. 루트 유도
    1. 새로운 촬영은 1/2 MS매체(표 1)로전송합니다. 25 °C - 28 °C에서 빛 아래 배양. 변형 된 식물은 2 주 이내에 뿌리를 생산합니다.
    2. 1 주 후, 탈수 방지하기 위해 식물을 덮고 깨끗한 냄비에 식물을 전송합니다.

3. 유전자형 식별

  1. 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB) 방법을 이용하여 총 DNA 추출을 위해 새로 생성된 식물로부터 어린 잎을채집한다(31)
  2. 유전체 DNA를 템플릿으로 사용하여, 프라이머(Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGTATTATT 3' 및 히그로마이신-R: 5' CGAAGAATCTCGTGCTCA 3' 하이그로마이신 지역에 위치) 중합체 연쇄 반응(PCR)을Figure 4선택하여 중합체 연쇄 반응(PCR)을 수행하여 4가지 유전자 통합을 검증한다. 다음 PCR 조건: 5 분 동안 94 °C; 36 사이클 (30 s에 대 한 94°C; 30 s에 대 한 56°C; 1 분 동안 72°C); 72 °C7 분. 성공적인 PCR 반응은 604 bp 앰플리턴을 생성합니다.
  3. 특정 프라이머(OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAACAGTTTCT 3'와 OsABCGG15-ID-R: 5'TTGGTGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACATTGCTAT 3')를 사용하여 CRISPR 표적 사이트를 둘러싼 게놈 영역을 증폭시키기 위해 다른 PCR을 수행합니다. PCR 조건은 3.2단계와 동일합니다.
  4. Sanger 시퀀싱을 위해 3.3 단계에서 PCR 단편을 사용하여 돌연변이를 식별합니다.

4. 돌연변이의 기본 표현형을 준수

  1. I2-KI용액 준비: 10mL의 증류수에 KI(요오드 칼륨)를 2g을 녹인 다음 I 2(재서브요오드)의 0.2 g를 추가합니다.2 혼합 후 총 부피를 증류수와 함께 100mL로 가져옵니다.
  2. FAA 용액(63% 무수성 에탄올, 빙하 아세트산 5%, 포름알데히드 5%, 물 27%)을 준비하고 사용하기 전에 섞는다.
  3. 0.5% Toluidine 블루 스테인닝 솔루션을 준비: 100mL의 증류수에 톨루이딘 블루 0.5g을 녹입니다.
  4. 디지털 카메라로 전체 식물을 이미징하여 식물학적 현상 관찰을 수행합니다.
  5. 생식 표현형 관찰을 수행하고, 꽃에서 팔레아와 뢰마를 제거합니다. 스테레오 현미경으로 전체 anthers의 사진을 찍습니다.
  6. 요오드 염색에 의해 꽃가루 생존가능성을 관찰하십시오.
    1. 꽃 무신 전에 성숙한 쌀 스파이크를 선택하고, 팔레아와 뢰마를 제거하여 마취자를 방출합니다.
    2. 6 개의 anther를 가져 와서 유리 슬라이드에 놓습니다. 증류수 1방울을 넣고 핀셋으로 앤터를 잘 부수고 꽃가루 곡물을 방출한 다음 I2-KI용액2-3방울을 추가합니다. 커버 슬립으로 덮습니다.
    3. 낮은 배율 현미경에서 관찰하십시오. 검은 색으로 염색된 꽃가루 곡물은 더 활발한 생존력을 나타내며, 염색된 색상이나 황갈색은 기절하거나 퇴화되지 않습니다.
  7. 쌀 앤서의 반 박면 부분을 수행
    1. 다양한 개발 단계의 쌀 꽃을 FAA 솔루션으로 수정합니다. 재료가 수집 병의 바닥으로 가라 앉을 때까지 고정이 조직에 침투 할 수 있도록 4 ° C (일반적으로 15 분)에서 재료를 진공 청소기.
    2. 다음 날 새로운 FAA 솔루션으로 교체하십시오. 재료가 바닥에 가라앉으면 70 % 에탄올로 교체하고 4 °C에서 저장하여 장기간 사용하십시오.
    3. 에탄올의 다른 그라데이션으로 재료를 탈수 (70%, 80%, 95% 30 분 동안 매번, 2 h에 대한 100 % 에탄올, 2 h에 대한 사프란 염료의 조금을 포함하는 100 % 에탄올).
      참고: 두 번째 100% 에탄올에 사프란 염료를 약간 추가하여 마취제에 색상을 추가하여 나중에 쉽게 단면할 수 있습니다.
    4. 제조업체의 지시(재료 표)를 따라 포함 작업을 수행합니다. 그런 다음 단면화 하기 전에 48 시간 동안 60 °C에서 오븐에서 구우습니다.
    5. 마이크로토메를 사용하여 샘플을 2 μm두께로 섹션화합니다. 유리 슬라이드에 물 한 방울을 추가합니다. 그런 다음, 집게에 의해 개미 블록을 포함하는 얇은 섹션을 선택하고 슬라이드에 물 방울의 표면에 넣어.
    6. 슬라이드를 50°C의 수조에 놓고 단면을 완전히 분산하여 슬라이드에 단단히 부착합니다.
    7. 0.5% toluidine 블루 용액을 사용하여 슬라이드를 30 분 동안 얼룩지게하십시오. 그런 다음 물로 헹구고 연기 후드에서 건조시다. 중립 나무 접착제로 밀봉하십시오. 슬라이드에 커버슬립을 부드럽게 놓고 연기 후드에 건조시다.
    8. 현미경으로 샘플을 관찰하고 촬영합니다.

결과

여기에 입증 된 유전자 편집 기술은 쌀에 있는 Agrobacterium-매개 유전 변환에 의하여 미래 연구를 위한 남성 멸균 선을 만드는 것입니다. osabcg15의남성 멸균 라인을 생성하기 위해 CRISPR-CAS9 매개 돌연변이 발생은 이진 벡터 구조에 사용되었다. sgRNA는 OsU3 프로모터에 의해 구동된 반면, hSpCas9의 발현 카세트는 이중 35S 프로모터에 의해 구동되었고, 중간 벡터는 아그로박테리움을위?...

토론

인공 유전자 남성 멸균 돌연변이는 전통적으로 무작위 물리적, 화학적, 또는 생물학적 돌연변이발생에 의해 생성됩니다. 이들은 강력한 기술이지만, 그들의 무작위 자연은 분자사육32에있는 맞춤형 개선을 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있는 현대 유전체 지식의 광대 한 양을 활용하지 못합니다. CRISPR-Cas9 시스템은 DNA29,,33을조작하?...

공개

없음.

감사의 말

저자는 샤오페이 첸이 쌀 조직 배양 배지를 만드는 데 있어 젊은 쌀 꽃가루와 도움을 제공한 것에 대해 인정하고 자합니다. 이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (31900611)에 의해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Naphthaleneacetic acidSigma-AldrichN0640
2, 4-Dichlorophenoxyacetic AcidSigma-AldrichD7299
6-Benzylaminopurine (6-BA)Sigma-AldrichB3408
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
AgarSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000561
Ammonium sulfateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10002918
Aneurine hydrochlorideSigma-AldrichT4625
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218
Bacteriological peptoneSangon BiotechA100636
Beef extractSangon BiotechA600114
Boric acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004808
Calcium chloride dihydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd20011160
Casein acid hydrolysateBeijing XMJ Scientific Co., LtdC184
Cobalt(II) chloride hexahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10007216
Copper(II) sulfate pentahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10008218
D(+)-Glucose anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63005518
D-sorbitolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63011037
EDTA, Disodium Salt, DihydrateSigma-AldrichE5134
EOS Digital SLR and Compact System CamerasCanonEOS 700D
FormaldehydeSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010018
Fully Automated Rotary MicrotomeLeica BiosystemsLeica RM 2265
Glacial acetic acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000208
GlycineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62011516
HygromycinBeijing XMJ Scientific Co., LtdH370
InositolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63007738
IodineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10011517
Iron(II) sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012116
KanamycineBeijing XMJ Scientific Co., LtdK378
KinetinSigma-AldrichK0753
L-ArginineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004034
L-Aspartic acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004736
L-GlutamineBeijing XMJ Scientific Co., LtdG229
L-prolineBeijing XMJ Scientific Co., LtdP698
Magnesium sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013018
Manganese sulfate monohydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013418
MicroscopesNIKONEclipse 80i
MSPhytotechM519
Nicotinic acidSigma-AldrichN0765
PhytagelSigma-AldrichP8169
Potassium chlorideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016308
Potassium dihydrogen phosphateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017608
Potassium iodideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017160
Potassium nitrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001721933
Pyridoxine Hydrochloride (B6)Sigma-Aldrich47862
RifampicinBeijing XMJ Scientific Co., LtdR501
Sodium hydroxideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
Sodium molybdate dihydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019816
Stereo microscopesLeica MicrosystemsLeica M205 A
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10021418
Technovit embedding Kits 7100Heraeus Teknovi, Germany14653
TimentinBeijing XMJ Scientific Co., LtdT869
Toluidine Blue OSigma-AldrichT3260
Water bath for paraffin sectionsLeica BiosystemsLeica HI1210
Yeast extractSangon BiotechA515245
Zinc sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10024018

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