A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
עבודה זו מתארת את השימוש בטכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR-Cas9 כדי נוקאאוט גן אנדוגני OsABCG15 ואחריו Agrobacterium שונה-פרוטוקול טרנספורמציה בתיווך לייצר קו זכר סטרילי יציב באורז.
עקירת הזכר היא תכונה אגרונומית חשובה לייצור זרעים היברידיים המאופיינת בדרך כלל על ידי פגמים פונקציונליים באיברי רבייה/גימטים גבריים. ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR-Cas9 מאפשרות יעילות עריכה גבוהה ומוטציות נוקאאוט מצילות זמן של גנים של מועמדים אנדוגניים באתרים ספציפיים. בנוסף, אגרובקטריום-מתווכים טרנספורמציה גנטית של אורז היא גם שיטת מפתח לשינוי גנים, אשר אומצה באופן נרחב על ידי מעבדות ציבוריות ופרטית רבות. במחקר זה, יישם CRISPR-Cas9 כלי עריכת הגנום ויצרנו בהצלחה שלושה קווי מוטציה סטרילי זכר על ידי עריכת גנום ממוקד של OsABCG15 ב cultivar japonica. השתמשנו בשיטת שינוי אגרובקטריום-מתווכת אורז שיכול לספק אמצעים מצוינים של סירוס גנטי לייצור זרעים היברידיים באורז. צמחים טרנסגניים ניתן להשיג בתוך 2-3 חודשים וטרנספורמטורים הומוזיגים הוקרן על ידי genotyping באמצעות ההגדלה PCR ו רצף סנגר. אפיון פנוטיפי בסיסי של קו הומוזיגוס סטרילי זכר בוצע על ידי תצפית מיקרוסקופית של איברי הרבייה זכר האורז, ניתוח קיימות אבקה על ידי יוד אשלגן יודיד (I2-KI) מכתים חצי דק חתך של anthers מתפתח.
אורז הוא יבול המזון החשוב ביותר, במיוחד במדינות מתפתחות, ומייצג מזון בסיסי עבור יותר ממחצית מאוכלוסיית העולם. בסך הכל, הביקוש לדגן אורז גדל והוא צפוי לגדול ב-50% עד 2030 ו-100% עד 20501,,2. שיפורים עתידיים בתפוקת אורז יצטרכו לנצל משאבים מולקולריים וגנטיים מגוונים ש הופכים את האורז למודל מצוין למחקר צמחים מונוקוטלדונים. אלה כוללים מערכת טרנספורמציה יעילה, מפה מולקולרית מתקדמת, ומסד נתונים נגיש לציבור של תגי רצף מבוטאים, אשר נוצרובמשך שנים רבות 3,4. אסטרטגיה אחת לשיפור תפוקת היבול היא ייצורזרעים היברידיים 5, מרכיב מרכזי שבו היא היכולת לתמרן את הפוריות הגברית. הבנת השליטה המולקולרית של פוריות הגבר בגידולי דגנים יכולה לעזור לתרגם ידע מפתח לטכניקות מעשיות כדי לשפר את ייצור הזרעים היברידיים ולשפראת פרודוקטיביות היבול 6,7.
טרנספורמציה גנטית היא כלי מפתח למחקר בסיסי וחקלאות מסחרית שכן היא מאפשרת הכנסת גנים זרים או מניפולציה של גנים אנדוגניים בצמחי יבול, ותוצאות יצירת קווים מהונדסים גנטית. פרוטוקול טרנספורמציה מתאים יכול לעזור להאיץ מחקרים גנטיים ומולקולריים ביולוגיה להבנה בסיסית של ויסותגנים 8. בחיידקים, טרנספורמציה גנטית מתרחשת באופן טבעי; עם זאת, בצמחים, הוא מבוצע באופן מלאכותי באמצעות טכניקות ביולוגיהמולקולרית 9,10. אגרובקטריום tumefaciens הוא קרקע נישאת, חיידק גראם שלילי הגורמים למחלת מרה הכתר בצמחים על ידי העברת T-DNA, אזור של Ti plasmid שלה, לתוך תא הצמח באמצעות מערכת הפרשת סוגIV 11,12. בצמחים, A. tumefaciens-תווך טרנספורמציה נחשבת שיטה נפוצה לשינוי גנים כי זה מוביל יציב ושילוב מספר עותק נמוך של T-DNA לתוך הגנוםהמארח 13. אורז טרנסגני נוצר לראשונה באמצעות טרנספורמציהגנטית מתווכת אגרובקטריום באמצע שנות ה־90 של המאה ה־20, ב־japonica cultivar14. באמצעות פרוטוקול זה, מספר קווים טרנסגניים הושגו בתוך תקופה של 4 חודשים עם יעילות טרנספורמציה של 10%-30%. המחקר הצביע על כך שיש שני צעדים קריטיים לטרנספורמציה המוצלחת: האחד הוא אינדוקציה של תרכובת עוברית מזרעים בוגרים והשנייה היא תוספת של acetosyringone, תרכובת פנולית, לתרבות החיידקית במהלך טיפוח שותף, המאפשר יעילות טרנספורמציה גבוהה יותר בצמחים14,15. פרוטוקול זה שימש בהרחבה עם שינויים קלים japonica16,17,,18,19, כמו גם cultivars אחרים כגון indica20,21,22,,23 ו japonica טרופי,24,25. ואכן, מעל 80% מהמאמרים המתארים את טרנספורמציה אורז להשתמש אגרובקטריום-מתווכים שינוי גן ככלי13. עד כה פותחו מספר פרוטוקולי טרנספורמציה גנטית באמצעות זרעי אורז כחומר התחלתי לאינדוקציה16,,17,,18,,19. עם זאת, מעט מאוד ידוע על תפרה צעירה כמו explants לייצור יבלות. בסך הכל, חשוב להקים פרוטוקול מהיר, לשחזור ויעיל של שינוי גנים והתחדשות עבור גנומיקה תפקודית ומחקרים על שיפור היבול.
בשנים האחרונות, ההתקדמות של טכנולוגיית CRISPR-Cas9 הביאה מנגנון עריכה גנומי מדויק כדי להבין את תפקוד הגנים ולספק שיפורים חשובים אגרונומית לגידולצמחים 26,27. CRISPR מציע גם הבטחה ניכרת למניפולציה של התפתחות הרבייה הגברית וייצור היברידי. במחקר זה, השתמשנו במערכת נוקאאוט גנים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9 והכנסנו אותה לפרוטוקול יעיל של שינוי גן אורז באמצעות תפלות צעירות כהסברים, ובכך יצרנו קווים סטריליים יציבים לחקר התפתחות הרבייה.
1. sgRNA-CAS9 צמח ביטוי וקטור בנייה וקטורית אגרובקטריום-תיווך טרנספורמציה
2. טרנספורמציה גנטית אורז ותרבות רקמת הצמח
3. זיהוי גנוטיפ
4. שים לב לפנוטיפ הבסיסי של המוטנט
הוכח כאן הוא השימוש בטכנולוגיית עריכת גנים כדי ליצור קו סטרילי זכר למחקר עתידי על ידי אגרובקטריום-מתווכים טרנספורמציה גנטית באורז. כדי ליצור את הקו הסטרילי הגברי של osabcg15, CRISPR-CAS9-בתיווך mutagenesis שימש לבנייה וקטורית בינארית. SgRNA היה מונע על ידי היזם OsU3, בעוד קלטת הביטוי של hSpCas9 היה מונ?...
מוטנטים סטריליים גבריים מלאכותיים נוצרים באופן מסורתי על ידי מוטגנזה פיזית, כימית או ביולוגית אקראית. למרות שאותם טכניקות רבות עוצמה, טבעם האקראי לא מצליח לנצל את הכמות העצומה של ידע גנומי מודרני בעל פוטנציאל לספק שיפורים מותאמים אישית ברבייה מולקולרית32. מערכת CRISPR-Cas9 שימשה ב...
ללא.
המחברים רוצים להכיר Xiaofei חן למתן תפלות אורז צעיר וסיוע בהפיכה את תרבות רקמת האורז בינוני. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31900611).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
MS | Phytotech | M519 | |
Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved