JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

עבודה זו מתארת את השימוש בטכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR-Cas9 כדי נוקאאוט גן אנדוגני OsABCG15 ואחריו Agrobacterium שונה-פרוטוקול טרנספורמציה בתיווך לייצר קו זכר סטרילי יציב באורז.

Abstract

עקירת הזכר היא תכונה אגרונומית חשובה לייצור זרעים היברידיים המאופיינת בדרך כלל על ידי פגמים פונקציונליים באיברי רבייה/גימטים גבריים. ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיית עריכת הגנום CRISPR-Cas9 מאפשרות יעילות עריכה גבוהה ומוטציות נוקאאוט מצילות זמן של גנים של מועמדים אנדוגניים באתרים ספציפיים. בנוסף, אגרובקטריום-מתווכים טרנספורמציה גנטית של אורז היא גם שיטת מפתח לשינוי גנים, אשר אומצה באופן נרחב על ידי מעבדות ציבוריות ופרטית רבות. במחקר זה, יישם CRISPR-Cas9 כלי עריכת הגנום ויצרנו בהצלחה שלושה קווי מוטציה סטרילי זכר על ידי עריכת גנום ממוקד של OsABCG15 ב cultivar japonica. השתמשנו בשיטת שינוי אגרובקטריום-מתווכת אורז שיכול לספק אמצעים מצוינים של סירוס גנטי לייצור זרעים היברידיים באורז. צמחים טרנסגניים ניתן להשיג בתוך 2-3 חודשים וטרנספורמטורים הומוזיגים הוקרן על ידי genotyping באמצעות ההגדלה PCR ו רצף סנגר. אפיון פנוטיפי בסיסי של קו הומוזיגוס סטרילי זכר בוצע על ידי תצפית מיקרוסקופית של איברי הרבייה זכר האורז, ניתוח קיימות אבקה על ידי יוד אשלגן יודיד (I2-KI) מכתים חצי דק חתך של anthers מתפתח.

Introduction

אורז הוא יבול המזון החשוב ביותר, במיוחד במדינות מתפתחות, ומייצג מזון בסיסי עבור יותר ממחצית מאוכלוסיית העולם. בסך הכל, הביקוש לדגן אורז גדל והוא צפוי לגדול ב-50% עד 2030 ו-100% עד 20501,,2. שיפורים עתידיים בתפוקת אורז יצטרכו לנצל משאבים מולקולריים וגנטיים מגוונים ש הופכים את האורז למודל מצוין למחקר צמחים מונוקוטלדונים. אלה כוללים מערכת טרנספורמציה יעילה, מפה מולקולרית מתקדמת, ומסד נתונים נגיש לציבור של תגי רצף מבוטאים, אשר נוצרובמשך שנים רבות 3,4. אסטרטגיה אחת לשיפור תפוקת היבול היא ייצורזרעים היברידיים 5, מרכיב מרכזי שבו היא היכולת לתמרן את הפוריות הגברית. הבנת השליטה המולקולרית של פוריות הגבר בגידולי דגנים יכולה לעזור לתרגם ידע מפתח לטכניקות מעשיות כדי לשפר את ייצור הזרעים היברידיים ולשפראת פרודוקטיביות היבול 6,7.

טרנספורמציה גנטית היא כלי מפתח למחקר בסיסי וחקלאות מסחרית שכן היא מאפשרת הכנסת גנים זרים או מניפולציה של גנים אנדוגניים בצמחי יבול, ותוצאות יצירת קווים מהונדסים גנטית. פרוטוקול טרנספורמציה מתאים יכול לעזור להאיץ מחקרים גנטיים ומולקולריים ביולוגיה להבנה בסיסית של ויסותגנים 8. בחיידקים, טרנספורמציה גנטית מתרחשת באופן טבעי; עם זאת, בצמחים, הוא מבוצע באופן מלאכותי באמצעות טכניקות ביולוגיהמולקולרית 9,10. אגרובקטריום tumefaciens הוא קרקע נישאת, חיידק גראם שלילי הגורמים למחלת מרה הכתר בצמחים על ידי העברת T-DNA, אזור של Ti plasmid שלה, לתוך תא הצמח באמצעות מערכת הפרשת סוגIV 11,12. בצמחים, A. tumefaciens-תווך טרנספורמציה נחשבת שיטה נפוצה לשינוי גנים כי זה מוביל יציב ושילוב מספר עותק נמוך של T-DNA לתוך הגנוםהמארח 13. אורז טרנסגני נוצר לראשונה באמצעות טרנספורמציהגנטית מתווכת אגרובקטריום באמצע שנות ה־90 של המאה ה־20, ב־japonica cultivar14. באמצעות פרוטוקול זה, מספר קווים טרנסגניים הושגו בתוך תקופה של 4 חודשים עם יעילות טרנספורמציה של 10%-30%. המחקר הצביע על כך שיש שני צעדים קריטיים לטרנספורמציה המוצלחת: האחד הוא אינדוקציה של תרכובת עוברית מזרעים בוגרים והשנייה היא תוספת של acetosyringone, תרכובת פנולית, לתרבות החיידקית במהלך טיפוח שותף, המאפשר יעילות טרנספורמציה גבוהה יותר בצמחים14,15. פרוטוקול זה שימש בהרחבה עם שינויים קלים japonica16,17,,18,19, כמו גם cultivars אחרים כגון indica20,21,22,,23 ו japonica טרופי,24,25. ואכן, מעל 80% מהמאמרים המתארים את טרנספורמציה אורז להשתמש אגרובקטריום-מתווכים שינוי גן ככלי13. עד כה פותחו מספר פרוטוקולי טרנספורמציה גנטית באמצעות זרעי אורז כחומר התחלתי לאינדוקציה16,,17,,18,,19. עם זאת, מעט מאוד ידוע על תפרה צעירה כמו explants לייצור יבלות. בסך הכל, חשוב להקים פרוטוקול מהיר, לשחזור ויעיל של שינוי גנים והתחדשות עבור גנומיקה תפקודית ומחקרים על שיפור היבול.

בשנים האחרונות, ההתקדמות של טכנולוגיית CRISPR-Cas9 הביאה מנגנון עריכה גנומי מדויק כדי להבין את תפקוד הגנים ולספק שיפורים חשובים אגרונומית לגידולצמחים 26,27. CRISPR מציע גם הבטחה ניכרת למניפולציה של התפתחות הרבייה הגברית וייצור היברידי. במחקר זה, השתמשנו במערכת נוקאאוט גנים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9 והכנסנו אותה לפרוטוקול יעיל של שינוי גן אורז באמצעות תפלות צעירות כהסברים, ובכך יצרנו קווים סטריליים יציבים לחקר התפתחות הרבייה.

Protocol

1. sgRNA-CAS9 צמח ביטוי וקטור בנייה וקטורית אגרובקטריום-תיווך טרנספורמציה

  1. היעד גן סטרילי זכר OsABCG15 באורז על פי הספרות שפורסמה28.
  2. עיצוב sgRNA עבור האתר המיועד הממוקם בין 106-125 bp ב exon השני של OsABCG15 (איור 1).
  3. השתמש T4 פולינוקלאוטיד קינאז כדי לסנתז את האוליגוס sgRNA (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' ו 5 sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGAGAGGTGCTT').
  4. השתמש אנדונוקלאז BbsI לעכל את וקטור עמוד השדרה psgR-Cas929.
  5. לדגדג את האוליגוס sgRNA מסונתז עם עמוד השדרה של PSGR-Cas9 ליניארי באמצעות ליגאז T4 בעקבות פרוטוקול היצרן.
  6. באמצעות HindIII /EcoRI, לעכל את קלטת sgRNA מ שלב 1.5 ואת subclone לתוך האתר הינדי /EcoRI של וקטור בינארי pCAMBIA1300 עבורטרנספורמציה יציבה 29.
  7. אשר את הפלסמיד הבנוי על ידי עיכול אנזימים ודיון. מאוחר יותר, להפוך את המבנה הבינארי לתוך tumefaciens אגרובקטריום זן EHA105 ולגדל אותם על לוחות בחירה Kan / Rif ב 28 ° C במשך 2-3 ימים.

2. טרנספורמציה גנטית אורז ותרבות רקמת הצמח

  1. אינדוקציה והתחדשות קוס
    הערה: השתמשו בתפלות אורז צעירות טריות כחומר ההתחלתי כדי לגרום לטלוס (איור 2).
    1. לאסוף את התפלות הצעירות מתוך שדה האורז או הבית הירוק בשלב meiosis, נקבע על ידי אורך floret של 1.6-4.8 מ"מ(איור 2A)29. ודא כי תפלת האורז מכוסה בפנס עלה. מנגבים כל תסיסה עם 70% דגימת אלכוהול ולתת לו להתייבש לפני החיתוך.
    2. הביאו את התסיסה לספסל סטרילי נקי. חותכים אותו לחתיכות קטנות (קטן יותר טוב) עם מספריים עיקור ולאחר מכן להעביר חתכים לצלחת פטרי המכיל NBD2 בינוני(איור 2B, טבלה 1).
    3. דגירה את הצלחת בחושך ב 26 ° C במשך כ 10-14 ימים כדי לגרום מנוסה (איור 3A).
      הערה: השתמש בטלוס החדש שנוצר עבור חדירת אגרובקטריום (שלב 2.2.7) ישירות או recondition פעם נוספת במדיום NBD2 טרי כדי להשיג תבלות יותר. מעבירים את ההתקשרות למדיום NBD2 החדש כל 8-10 ימים.
  2. טרנספורמציה וטיפוח-שותף
    1. השתמש בחיידקים של א. tumefaciens המכילים את הפלסמיד הבינארי מ- 1.6 לטרנספורמציה. אחסן את הזנים A. tumefaciens במדיום YEB (טבלה 1) עם 50% גליטרול ב -80 °C לשימוש נוסף.
    2. פס A. tumefaciens מ -80 ° C גליצטרול מלאי לYEB אגר בינוני המכיל אנטיביוטיקה סלקטיבית(טבלה 1) ולגדולב 25-28 ° C עבור 48-72 שעות, כדי לאפשר למושבות להופיע.
    3. לחסן מושבה אחת מצלחת YEB עם אנטיביוטיקה סלקטיבית 5 מ"ל של נוזל YEB בינוני המכילאת אותה אנטיביוטיקה סלקטיבית (טבלה 1),ב 50 מ"ל צינור סטרילי חוטי. לנער על שייקר מסלולית ב 250 x g g, ב 25-28 ° C עד חיידקים לגדול OD600 של 0.5.
    4. להוסיף 1 מ"ל של מתלים חיידקיים 100 מ"ל של YEB בינוני (שולחן 1) עם אותו אנטיביוטיקה סלקטיבית בקבוקון חוטי 250 מ"ל ולנער על שייקר מסלולית ב 250 x גרם, ב 28 מעלות צלזיוס עבור 4 שעות.
    5. צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף חיידקים. זרוק את הסופרנטנט.
    6. תוסתה מחדש את הגלולה החיידקית עם AAM-AS בינוני(טבלה 1) ודללאת המתלים ל- OD600 = 0.4.
      הערה: מנת ה-OD המושלמת של מתלים חיידקיים היא קריטית לשינוי יעיל. זה עוזר בחיסול עודף צמיחה חיידקים על ההתפתלויות.
    7. לאסוף סביב 150 בריא גדל בהיר צהוב בהיר שביר קלי עוברי מ שלב 2.1.3 לתוך בקבוק סטרילי 150 מ"ל. מוסיפים 50-75 מ"ל מתלי תאים חיידקיים מ-2.2.6 לבקבוק הסטרילי, ולאחר מכן מוסיפים כ-10-25 מ"ל בינוני AAM-AS טרי כדי לטבול את הקלי במשך 10-20 דקות, רועד מדי פעם.
    8. לשפוך את המתלים חיידקים מהבקבוקון בזהירות לייבש את המתלים חיידקים עודף מן הקלווס באמצעות נייר סינון סטרילי #1 נייר טישו. לאחר מכן מניחים אותם על צלחת פטרי עם NBD-AS בינוני(שולחן 1)מכוסה נייר סינון סטרילי #1. דגירה ב 25-28 ° C בחושך במשך 3 ימים ולבדוק אם חיידקים overgrowth.
  3. בחירה עבור תלת עמידים
    1. לאחר 3 ימים של טיפוח-שותף, מעבירים את הקלי לצלחת פטרי סטרילית עם נייר סינון סטרילי.
    2. ייבש את ה-calli במשך 2 שעות על ספסל נקי. ודא שההתקשרות אינה דבקה בנייר המסנן.
    3. להעביר את הקלי באופן שווה באמצעות פינצטה סטרילית לבחירה העיקרית בינוני NBD2 (עם 40 מ"ג / L hygromycin ו 250 מ"ג / L טזמן)(טבלה 1). תרבות קאלי במשך 2 שבועות ב 25-28 ° C בחושך.
    4. לאחר 2 שבועות, להעביר calli באופן שווה לצלחת חדשה המכילה בחירה טרי בינוני NBD2 (עם 40 מ"ג / L hygromycin ו 250 מ"ג / L timentin)(טבלה 1). תרבות ה-calli לעוד שבועיים ב 25-28 מעלות צלזיוס בחושך.
  4. בדיל ים
    1. להעביר כבלים בינוני MS טרי (עם 25 מ"ג / L hygromycin ו 150 מ"ג / L טזמן)(שולחן 1). תרבות תחת האור ב 25-28 מעלות צלזיוס במשך כ 2 שבועות.
    2. חזור על שלב 2.4.1 פעם נוספת.
    3. להעביר את ניצני לירות למדיום MS החדש (עם 10 מ"ג / L hygromycin) כדי להתרבות יורה יותר.
  5. אינדוקציה שורש
    1. להעביר את הצילומים החדשים לתוך 1/2 MS מדיום(טבלה 1). תרבות תחת האור ב 25 ° C - 28 °C. הצמחים שהשתנו מייצרים שורשים בתוך שבועיים.
    2. לאחר שבוע, להעביר את הצמחים סירים נקיים המכסים את הצמח כדי למנוע התייבשות.

3. זיהוי גנוטיפ

  1. לאסוף עלים צעירים מצמחים חדשים שנוצרו עבור הפקת DNA הכולל באמצעות צטילטרימתיל אמוניום ברומיד (CTAB)שיטה 31.
  2. באמצעות ה-DNA הגנומי כתבנית, בחר את פריימרים (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGCGTATT 3' והיגרומיצין-R: 5' CGAAGACTCTCGTCTCTCTCA 3' הממוקם באזור Hygromycin) כדי לבצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי לאמת את האינטגרציה הטרנסיתותדרים (איור 4). תנאי ה-PCR הבאים: 94 °C למשך 5 דקות; 36 מחזורים (94°C ל-30 שניות; 56°C ל-30 שניות; 72°C למשך דקה אחת); 72°C ל-7 דקות. תגובות PCR מוצלחות מניבות 604 bp amplicon.
  3. בצע PCR אחר כדי להגביר את האזור הגנומי המקיף את אתרי היעד CRISPR באמצעות פריימרים ספציפיים (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCTCTCTCTCAACAGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT 3' ו- OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTTATTAACATTGCTAT 3') כדי לזהות את הגנוטיפ של הטרנספורמטורים. תנאי ה- PCR זהים לתנאים בשלב 3.2.
  4. השתמש בשברי PCR ממדרגה 3.3 ישירות ל-Sanger כדי לזהות מוטציות.

4. שים לב לפנוטיפ הבסיסי של המוטנט

  1. להכין את פתרון I2-KI: להמיס 2 גרם של KI (אשלגן יודיד) ב 10 מ"ל של מים מזוקקים ולאחר מכן להוסיף 0.2 גרם של I2 (יוד resublimed) בזה. לאחר ערבוב, להביא את הנפח הכולל 100 מ"ל עם מים מזוקקים.
  2. הכינו את פתרון ה-FAA (63% אתנול אנידרי, 5% חומצה אצטית קרחונית, 5% פורמלדהיד ו-27% מים) ומערבבים לפני השימוש.
  3. הכינו את תמיסת הכתמים הכחולה טולואידין 0.5% : להמיס 0.5 גרם של טולואידין כחול ב 100 מ"ל של מים מזוקקים.
  4. לבצע תצפית פנוטיפית צמחית, על ידי הדמיה צמחים שלמים עם מצלמה דיגיטלית.
  5. לבצע תצפית פנוטיפ רבייה, להסיר את הפלאה והלמה מן floret. צלם תמונות של אנשים שלמים תחת סטריאומיקרוק.
  6. שים לב לכדאיות האבקה על ידי כתמי יוד.
    1. לקטוף קוצים אורז בוגרים לפני אנתזה פרח, להסיר את הפלאה והלמה כדי לשחרר את anthers.
    2. קח 6 anthers ולמקם אותם על מגלשת זכוכית. מוסיפים טיפה אחת של מים מזוקקים, מועצים את באר האנתר עם פינצטה כדי לשחרר את גרגרי האבקה, ולאחר מכן מוסיפים 2-3טיפות של תמיסתI 2 -KI. תכסה עם כיסוי.
    3. שים לב תחת מיקרוסקופ הגדלה נמוכה. גרגרי אבקה צבועים בשחור להראות קתנות נמרצת יותר, אין צבע או צהוב חום צבועים מעוכב או מנוון.
  7. ביצוע קטע דק למחצה של את'ר אורז
    1. לתקן את פרחי האורז בשלבים התפתחותיים שונים לפתרון FAA. שואבים את החומרים ב-4°C (בדרך כלל 15 דקות) כדי לאפשר למתקן לחדור לרקמות עד שהחומר שוקע לתחתית בקבוק האיסוף.
    2. החלף בפתרון FAA חדש למחרת. ברגע שהחומר שוקע לתחתית, החלף ב-70% אתנול ואחסן ב-4°C לשימוש לטווח ארוך.
    3. מייבשים את החומרים עם מעברי צבע שונים של אתנול (70%, 80%, 95% בכל פעם במשך 30 דקות, 100% אתנול ל-2 שעות, 100% אתנול המכיל מעט צבע ספראנין למשך 2 שעות).
      הערה: להוסיף קצת צבע Safranin לתוך השני 100% אתנול לצבוע את anthers עבור מקטע קל יותר לאחר מכן.
    4. בצע הטבעה על-ידי ביצוע הוראת היצרן (טבלת חומרים). לאחר מכן, אופים בתנור ב-60 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות לפני המקטע.
    5. מקטע את הדגימה לעובי של 2 μm באמצעות microtome. מוסיפים טיפת מים על מגלשת הזכוכית. לאחר מכן, להרים את החלקים הדקים המכילים בלוקים anther על ידי מפס ולשים אותם על פני השטח של טיפת המים על המגלשות.
    6. מניחים את המגלשות על אמבט המים ב-50°C כדי להפיץ את החלקים לחלוטין כדי לאפשר לה לדבוק ביציבות בשקופית.
    7. השתמש 0.5% טולואידין כחול פתרון להכתים את השקופיות במשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף עם מים ויבש בכסה המנוע אדים. אטום עם דבק עץ נייטרלי. מניחים בעדינות כיסוי על המגלשה ומתייבשים בכיסוי האדים.
    8. צפה וצלם את הדגימה תחת מיקרוסקופ.

תוצאות

הוכח כאן הוא השימוש בטכנולוגיית עריכת גנים כדי ליצור קו סטרילי זכר למחקר עתידי על ידי אגרובקטריום-מתווכים טרנספורמציה גנטית באורז. כדי ליצור את הקו הסטרילי הגברי של osabcg15, CRISPR-CAS9-בתיווך mutagenesis שימש לבנייה וקטורית בינארית. SgRNA היה מונע על ידי היזם OsU3, בעוד קלטת הביטוי של hSpCas9 היה מונ?...

Discussion

מוטנטים סטריליים גבריים מלאכותיים נוצרים באופן מסורתי על ידי מוטגנזה פיזית, כימית או ביולוגית אקראית. למרות שאותם טכניקות רבות עוצמה, טבעם האקראי לא מצליח לנצל את הכמות העצומה של ידע גנומי מודרני בעל פוטנציאל לספק שיפורים מותאמים אישית ברבייה מולקולרית32. מערכת CRISPR-Cas9 שימשה ב...

Disclosures

ללא.

Acknowledgements

המחברים רוצים להכיר Xiaofei חן למתן תפלות אורז צעיר וסיוע בהפיכה את תרבות רקמת האורז בינוני. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31900611).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Naphthaleneacetic acidSigma-AldrichN0640
2, 4-Dichlorophenoxyacetic AcidSigma-AldrichD7299
6-Benzylaminopurine (6-BA)Sigma-AldrichB3408
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
AgarSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000561
Ammonium sulfateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10002918
Aneurine hydrochlorideSigma-AldrichT4625
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218
Bacteriological peptoneSangon BiotechA100636
Beef extractSangon BiotechA600114
Boric acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004808
Calcium chloride dihydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd20011160
Casein acid hydrolysateBeijing XMJ Scientific Co., LtdC184
Cobalt(II) chloride hexahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10007216
Copper(II) sulfate pentahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10008218
D(+)-Glucose anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63005518
D-sorbitolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63011037
EDTA, Disodium Salt, DihydrateSigma-AldrichE5134
EOS Digital SLR and Compact System CamerasCanonEOS 700D
FormaldehydeSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010018
Fully Automated Rotary MicrotomeLeica BiosystemsLeica RM 2265
Glacial acetic acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000208
GlycineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62011516
HygromycinBeijing XMJ Scientific Co., LtdH370
InositolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63007738
IodineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10011517
Iron(II) sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012116
KanamycineBeijing XMJ Scientific Co., LtdK378
KinetinSigma-AldrichK0753
L-ArginineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004034
L-Aspartic acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004736
L-GlutamineBeijing XMJ Scientific Co., LtdG229
L-prolineBeijing XMJ Scientific Co., LtdP698
Magnesium sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013018
Manganese sulfate monohydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013418
MicroscopesNIKONEclipse 80i
MSPhytotechM519
Nicotinic acidSigma-AldrichN0765
PhytagelSigma-AldrichP8169
Potassium chlorideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016308
Potassium dihydrogen phosphateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017608
Potassium iodideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017160
Potassium nitrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001721933
Pyridoxine Hydrochloride (B6)Sigma-Aldrich47862
RifampicinBeijing XMJ Scientific Co., LtdR501
Sodium hydroxideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
Sodium molybdate dihydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019816
Stereo microscopesLeica MicrosystemsLeica M205 A
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10021418
Technovit embedding Kits 7100Heraeus Teknovi, Germany14653
TimentinBeijing XMJ Scientific Co., LtdT869
Toluidine Blue OSigma-AldrichT3260
Water bath for paraffin sectionsLeica BiosystemsLeica HI1210
Yeast extractSangon BiotechA515245
Zinc sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10024018

References

  1. Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
  2. Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
  3. Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
  4. Lippman, Z. B., Zamir, D. Heterosis: revisiting the magic. Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).
  5. Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
  6. Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
  7. Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
  8. Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
  9. Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).
  10. Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
  11. Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
  12. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
  13. Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
  14. Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
  15. Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
  16. Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
  17. Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
  18. Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
  19. Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
  20. Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
  21. Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
  22. Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
  23. Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice. Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).
  24. Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
  25. Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
  26. Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
  27. Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
  28. Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
  29. Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
  30. Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
  31. Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE164CRISPR Cas9anther

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved