Agrobacterium-Transformação Genética Mediada, Produção Transgênica e Sua Aplicação para o Estudo do Desenvolvimento Reprodutivo Masculino no Arroz

Resumo

Este trabalho descreve o uso da tecnologia de edição de genomas CRISPR-Cas9 para eliminar o gene endógeno OsABCG15 seguido por um protocolo de transformação modificado agrobacterium mediadopara produzir uma linha estável masculino-estéril no arroz.

Resumo

A esterilidade masculina é um importante traço agronômico para a produção de sementes híbridas que geralmente é caracterizada por defeitos funcionais em órgãos reprodutivos/gametas masculinos. Os recentes avanços na tecnologia de edição de genomas CRISPR-Cas9 permitem alta eficácia de edição e mutações de eliminação de tempo de genes candidatos endógenos em locais específicos. Além disso, a transformação genética mediada pelo agrobacteriumdo arroz também é um método-chave para a modificação genética, que tem sido amplamente adotada por muitos laboratórios públicos e privados. Neste estudo, aplicamos ferramentas de edição de genomas CRISPR-Cas9 e geramos com sucesso três linhas mutantes estéreis masculinas por edição de genoma direcionado de OsABCG15 em uma cultivar japonica. Utilizamos um método modificado de transformação de arroz mediado por Agrobacteriumque poderia fornecer excelentes meios de emasculação genética para a produção de sementes híbridas no arroz. Plantas transgênicas podem ser obtidas dentro de 2-3 meses e transformadores homozigos foram rastreados por genotipagem usando amplificação PCR e sequenciamento Sanger. A caracterização fenotípica básica da linha homozigosa estéril masculina foi realizada pela observação microscópica dos órgãos reprodutivos machos do arroz, análise de viabilidade do pólen por iodida de potássio iodo (I₂-KI) manchando semi-fina seção transversal de anthers em desenvolvimento.

Introdução

O arroz é a cultura alimentar mais importante, particularmente nos países em desenvolvimento, e representa um alimento básico para mais da metade da população mundial. No geral, a demanda por grãos de arroz está crescendo e deve aumentar 50% até 2030 e 100% até 2050^1,2. Melhorias futuras no rendimento do arroz precisarão capitalizar em diversos recursos moleculares e genéticos que fazem do arroz um excelente modelo para pesquisa de plantas monocotíces. Estes incluem um sistema de transformação eficiente, mapa molecular avançado e banco de dados de sequência expressa, que foram gerados ao longo de muitos anos

Protocolo

1. construção vetorial de expressão vegetal sgRNA-CAS9 e transformação mediada por Agrobacterium

1. Alvo de um gene estéril masculino OsABCG15 em arroz de acordo com a literatura publicada²⁸.
2. Design sgRNA para o local alvo localizado entre 106-125 bp no segundo exon de OsABCG15 (Figura 1).
3. Use a quinase de polinucleotídeo T4 para sintetizar os oligos sgRNA (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCCCTCAAGGGGAT3' e 5 sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCCCTTGAGGATGGATGTGTGTTT').
4. Use o endonuclease BbsI para digerir o vetor de espinha dorsal psgR-Cas9²⁹

Resultados

Demonstrado aqui o uso da tecnologia de edição de genes para criar uma linha masculina estéril para futuras pesquisas da Agrobacterium- transformação genética mediada em arroz. Para criar a linha masculina estéril de osabcg15,a mutagênese mediada pelo CRISPR-CAS9 foi usada para a construção de vetores binários. O sgRNA foi conduzido pelo promotor osU3, enquanto o de expressão de hSpCas9 foi impulsionado pelo promotor duplo 35S, e o vetor médio foi montado em um único vetor binário pCA.......

Discussão

Mutantes estéreis artificiais machos são tradicionalmente gerados por mutagênese física, química ou biológica aleatória. Embora sejam técnicas poderosas, sua natureza aleatória não consegue capitalizar a vasta quantidade de conhecimento genômico moderno que tem o potencial de proporcionar melhorias personalizadas na reprodução molecular³². O sistema CRISPR-Cas9 tem sido amplamente utilizado em plantas devido aos seus meios simples e acessíveis para manipular e editar DNA

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Naphthaleneacetic acid	Sigma-Aldrich	N0640
2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid	Sigma-Aldrich	D7299
6-Benzylaminopurine (6-BA)	Sigma-Aldrich	B3408
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
Agar	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10000561
Ammonium sulfate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10002918
Aneurine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T4625
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218
Bacteriological peptone	Sangon Biotech	A100636
Beef extract	Sangon Biotech	A600114
Boric acid	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10004808
Calcium chloride dihydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	20011160
Casein acid hydrolysate	Beijing XMJ Scientific Co., Ltd	C184
Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10007216
Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10008218
D(+)-Glucose anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	63005518
D-sorbitol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	63011037
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
EOS Digital SLR and Compact System Cameras	Canon	EOS 700D
Formaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010018
Fully Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	Leica RM 2265
Glacial acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10000208
Glycine	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	62011516
Hygromycin	Beijing XMJ Scientific Co., Ltd	H370
Inositol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	63007738
Iodine	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10011517
Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10012116
Kanamycine	Beijing XMJ Scientific Co., Ltd	K378
Kinetin	Sigma-Aldrich	K0753
L-Arginine	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	62004034
L-Aspartic acid	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	62004736
L-Glutamine	Beijing XMJ Scientific Co., Ltd	G229
L-proline	Beijing XMJ Scientific Co., Ltd	P698
Magnesium sulfate heptahydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10013018
Manganese sulfate monohydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10013418
Microscopes	NIKON	Eclipse 80i
MS	Phytotech	M519
Nicotinic acid	Sigma-Aldrich	N0765
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Potassium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016308
Potassium dihydrogen phosphate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10017608
Potassium iodide	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10017160
Potassium nitrate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	1001721933
Pyridoxine Hydrochloride (B6)	Sigma-Aldrich	47862
Rifampicin	Beijing XMJ Scientific Co., Ltd	R501
Sodium hydroxide	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019718
Sodium molybdate dihydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019816
Stereo microscopes	Leica Microsystems	Leica M205 A
Sucrose	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10021418
Technovit embedding Kits 7100	Heraeus Teknovi, Germany	14653
Timentin	Beijing XMJ Scientific Co., Ltd	T869
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260
Water bath for paraffin sections	Leica Biosystems	Leica HI1210
Yeast extract	Sangon Biotech	A515245
Zinc sulfate heptahydrate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10024018