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Resumo

Este trabalho descreve o uso da tecnologia de edição de genomas CRISPR-Cas9 para eliminar o gene endógeno OsABCG15 seguido por um protocolo de transformação modificado agrobacterium mediadopara produzir uma linha estável masculino-estéril no arroz.

Resumo

A esterilidade masculina é um importante traço agronômico para a produção de sementes híbridas que geralmente é caracterizada por defeitos funcionais em órgãos reprodutivos/gametas masculinos. Os recentes avanços na tecnologia de edição de genomas CRISPR-Cas9 permitem alta eficácia de edição e mutações de eliminação de tempo de genes candidatos endógenos em locais específicos. Além disso, a transformação genética mediada pelo agrobacteriumdo arroz também é um método-chave para a modificação genética, que tem sido amplamente adotada por muitos laboratórios públicos e privados. Neste estudo, aplicamos ferramentas de edição de genomas CRISPR-Cas9 e geramos com sucesso três linhas mutantes estéreis masculinas por edição de genoma direcionado de OsABCG15 em uma cultivar japonica. Utilizamos um método modificado de transformação de arroz mediado por Agrobacteriumque poderia fornecer excelentes meios de emasculação genética para a produção de sementes híbridas no arroz. Plantas transgênicas podem ser obtidas dentro de 2-3 meses e transformadores homozigos foram rastreados por genotipagem usando amplificação PCR e sequenciamento Sanger. A caracterização fenotípica básica da linha homozigosa estéril masculina foi realizada pela observação microscópica dos órgãos reprodutivos machos do arroz, análise de viabilidade do pólen por iodida de potássio iodo (I2-KI) manchando semi-fina seção transversal de anthers em desenvolvimento.

Introdução

O arroz é a cultura alimentar mais importante, particularmente nos países em desenvolvimento, e representa um alimento básico para mais da metade da população mundial. No geral, a demanda por grãos de arroz está crescendo e deve aumentar 50% até 2030 e 100% até 20501,2. Melhorias futuras no rendimento do arroz precisarão capitalizar em diversos recursos moleculares e genéticos que fazem do arroz um excelente modelo para pesquisa de plantas monocotíces. Estes incluem um sistema de transformação eficiente, mapa molecular avançado e banco de dados de sequência expressa, que foram gerados ao longo de muitos anos3,4. Uma estratégia para melhorar o rendimento das culturas é a produção de sementeshíbridas 5, um elemento central do qual é a capacidade de manipular a fertilidade masculina. Compreender o controle molecular da fertilidade masculina nas culturas de cereais pode ajudar a traduzir conhecimentos-chave em técnicas práticas para melhorar a produção de sementes híbridas e aumentar a produtividade das culturas6,,7.

A transformação genética é uma ferramenta fundamental para a pesquisa básica e a agricultura comercial, uma vez que permite a introdução de genes estrangeiros ou manipulação de genes endógenos em plantas agrícolas, e resulta na geração de linhas geneticamente modificadas. Um protocolo de transformação adequado pode ajudar a acelerar os estudos de biologia genética e molecular para a compreensão fundamental da regulação genética8. Nas bactérias, a transformação genética ocorre naturalmente; no entanto, nas plantas, é realizado artificialmente utilizando técnicas de biologia molecular9,10. Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria gram-negativa que causa a doença da gárbia da coroa nas plantas através da transferência de T-DNA, uma região de seu plasmídeo Ti, para a célula vegetal através de um sistema de secreção tipo IV11,12. Nas plantas, a transformação mediada por A. tumefaciensé considerada um método generalizado para modificação genética porque leva à integração estável e de baixo número de cópia do T-DNA no genoma hospedeiro13. O arroz transgênico foi gerado pela primeira vez através da transformação genética mediada pela Agrobacteriumem meados da década de 1990 na cultivar japonica14. Por meio desse protocolo, várias linhas transgênicas foram obtidas em um período de 4 meses com uma eficiência de transformação de 10% a 30%. O estudo indicou que há dois passos críticos para a transformação bem sucedida: um é a indução do calo embrionário de sementes maduras e outro é a adição de acetossiingona, um composto fenólico, à cultura bacteriana durante o coculoculto, o que permite maior transformação nas plantas14,15. Este protocolo tem sido amplamente utilizado com pequenas alterações na japonica16,,17,,18,,19, bem como outras cultivares como indica20,,21,,22,23 e japonicatropical24,25. De fato, mais de 80% dos artigos que descrevem a transformação do arroz utilizam a transformação genética mediada pelo Agrobacteriumcomo ferramenta13. Até o momento, vários protocolos de transformação genética foram desenvolvidos utilizando sementes de arroz como material inicial para indução calos16,17,18,,19. No entanto, muito pouco se sabe sobre a inflorescência jovem como explantas para a produção de calo. No geral, é importante estabelecer um protocolo de transformação e regeneração genética rápido, reprodutível e eficiente para genômica funcional e estudos sobre melhoria das culturas.

Nos últimos anos, o avanço da tecnologia CRISPR-Cas9 resultou em um mecanismo preciso de edição de genomas para entender a função genética e proporcionar melhorias agronomicamente importantes para a criação de plantas26,27. A CRISPR também oferece uma promessa considerável para a manipulação do desenvolvimento reprodutivo masculino e da produção híbrida. Neste estudo, utilizamos um sistema de eliminação genética usando a tecnologia CRISPR-Cas9 e o unimos a um protocolo eficiente de transformação de genes de arroz usando inflorescências jovens como explantas, criando assim linhas estéreis masculinas estáveis para o estudo do desenvolvimento reprodutivo.

Protocolo

1. construção vetorial de expressão vegetal sgRNA-CAS9 e transformação mediada por Agrobacterium

  1. Alvo de um gene estéril masculino OsABCG15 em arroz de acordo com a literatura publicada28.
  2. Design sgRNA para o local alvo localizado entre 106-125 bp no segundo exon de OsABCG15 (Figura 1).
  3. Use a quinase de polinucleotídeo T4 para sintetizar os oligos sgRNA (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCCCTCAAGGGGAT3' e 5 sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCCCTTGAGGATGGATGTGTGTTT').
  4. Use o endonuclease BbsI para digerir o vetor de espinha dorsal psgR-Cas929.
  5. Liga o sgRNA oligos de tamanho sintetizado com espinha dorsal psgR-Cas9 linearizada usando ligase T4 seguindo o protocolo do fabricante.
  6. Utilizando HindIII/EcoRI, digerir o sgRNA da etapa 1.5 e subclone no local HindIII/EcoRI do vetor binário pCAMBIA1300 para transformação estável29.
  7. Confirme o plasmídeo construído por digestão enzimética e sequenciamento. Posteriormente, transforme a construção binária na cepa EHA105 e plante-as em placas de seleção Kan/Rif a 28 °C por 2 a 3 dias.

2. Transformação genética do arroz e cultura do tecido vegetal

  1. Indução e regeneração de Calo
    NOTA: Use inflorescências de arroz jovem fresco como material inicial para induzir calo(Figura 2).
    1. Recolher as inflorescências jovens do campo de pastagem ou da casa verde na fase de meiose, determinadas por comprimento florete de 1,6-4,8 mm(Figura 2A)29. Certifique-se de que as inflorescências de arroz estão cobertas com baia de folhas. Limpe cada inflorescência com um cotonete de álcool de 70% e deixe secar antes de cortar.
    2. Leve a inflorescência para um banco limpo estéril. Corte-o em pequenos pedaços (quanto menor melhor) com uma tesoura esterilizada e, em seguida, transfira os cortes para uma placa de Petri contendo meio NBD2(Figura 2B, Tabela 1).
    3. Incubar a placa no escuro a 26 °C por cerca de 10-14 dias para induzir calo(Figura 3A).
      NOTA: Use o calo recém-formado para infiltração de Agrobacterium (etapa 2.2.7) diretamente ou recondicionada mais uma vez no meio NBD2 fresco para obter mais calo. Transfira o calo para o novo meio NBD2 a cada 8 a 10 dias.
  2. Transformação e co-cultivo
    1. Use bactérias A. tumefaciens contendo o plasmídeo binário da etapa 1.6 para transformação. Armazene as cepas de A. tumefaciens em meio YEB(Tabela 1) com 50% de glicerol a -80 °C para uso posterior.
    2. Streak A. tumefaciens de um estoque de glicerol de -80 °C para yeb meio de ágar contendo antibióticos seletivos (Tabela 1) e crescer a 25-28 °C por 48-72 h, para permitir que as colônias apareçam.
    3. Inocular uma única colônia da placa YEB com antibióticos seletivos a 5 mL de meio YEB líquido contendo os mesmos antibióticos seletivos(Tabela 1), em um tubo de ensaio estéril cônico de 50 mL. Agite em um agitador orbital a 250 x g, a 25-28 °C até que as bactérias cresçam para um OD600 de 0,5.
    4. Adicione 1 mL de suspensão bacteriana a 100 mL de meio YEB(Tabela 1) com os mesmos antibióticos seletivos em um frasco cônico de 250 mL e agite em um agitador orbital a 250 x g,a 28 °C por 4 h.
    5. Centrífuga a 4.000 x g por 10 minutos à temperatura ambiente para coletar bactérias. Descarte o supernaspeso.
    6. Resuspene a pelota bacteriana com meio AAM-AS(Tabela 1) e dilua a suspensão a um OD600 = 0,4.
      NOTA: O OD perfeito da suspensão bacteriana é fundamental para uma transformação eficiente. Ajuda a eliminar o crescimento bacteriano em excesso no calo.
    7. Colete cerca de 150 cali embrigênicos frágeis amarelo-claros de crescimento saudável da etapa 2.1.3 em um frasco estéril de 150 mL. Adicione 50-75 mL de suspensão celular bacteriana da etapa 2.2.6 no frasco estéril e, em seguida, adicione alguns meios AAM-AS frescos de 10-25 mL para imergir o cali por 10-20 min, tremendo ocasionalmente.
    8. Despeje a suspensão bacteriana do frasco cuidadosamente e seque o excesso de suspensão bacteriana do calo usando papel filtro estéril #1 ou papel de tecido. Em seguida, coloque-os em uma placa de Petri com meio NBD-AS(Tabela 1)coberto com um papel filtro estéril #1. Incubar a 25-28 °C no escuro por 3 dias e verificar se há excesso de crescimento bacteriano.
  3. Seleção para calo resistente
    1. Após 3 dias de co-cultivo, transfira o cali para uma placa de Petri estéril com um papel filtro estéril.
    2. Seque o caldo por 2h em um banco limpo. Certifique-se de que o calo não seja aderido ao papel filtro.
    3. Transfira o calli uniformemente usando pinça estéril para o meio de seleção primária NBD2 (com 40 mg/L de higromicina e 250 mg/L tempontina)(Tabela 1). Cultura calli por 2 semanas a 25-28 °C no escuro.
    4. Após 2 semanas, transfira calli uniformemente para uma nova placa contendo médio de seleção fresca NBD2 (com 40 mg/L de higromicina e 250 mg/L tempontina) (Tabela 1). Cultura o calli por mais 2 semanas a 25-28 °C no escuro.
  4. Diferenciação de Calo
    1. Transferir calo para ms médio fresco (com 25 mg/L de higromicina e 150 mg/L tempontina) (Tabela 1). Cultura sob a luz a 25-28 °C por cerca de 2 semanas.
    2. Repita o passo 2.4.1 mais uma vez.
    3. Transfira os botões de tiro para o novo meio MS (com 10 mg/L de higromicina) para proliferar mais brotos.
  5. Indução radicular
    1. Transfira os novos brotos para o meio de 1/2 MS(Tabela 1). Cultura sob a luz a 25 °C - 28 °C. As plantas transformadas produzem raízes dentro de 2 semanas.
    2. Após 1 semana, transfira as plantas para limpar vasos que cobrem a planta para evitar a desidratação.

3. Identificação genótipo

  1. Coletar folhas jovens de plantas recém-geradas para extração total de DNA usando o método cetyltrimethyl ammonium brometo (CTAB)31.
  2. Usando o DNA genômico como modelo, escolha os primers (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGTATT 3' e Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCGTGCTTTCA 3' localizado na região de Hygromycin) para realizar a reação em cadeia de polimerase (PCR) para validar a integração transgênica e as frequências(Figura 4). As seguintes condições de PCR: 94 °C para 5 min; 36 ciclos (94 °C para 30 s; 56 °C para 30 s; 72 °C por 1 min ); 72 °C por 7 min. Reações de PCR bem sucedidas produzem um amplicon de 604 bp.
  3. Execute outro PCR para amplificar a região genômica ao redor dos locais de destino CRISPR usando primers específicos (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAACAGTCT 3' e OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTTAAAACATTGCTAT 3') para identificar o genótipo dos transformadores. As condições do PCR são as mesmas da etapa 3.2.
  4. Use fragmentos PCR da etapa 3.3 diretamente para sequenciamento Sanger para identificar mutações.

4. Observe o fenótipo básico do mutante

  1. Prepare a solução I2-KI: dissolva 2 g de KI (iodeto de potássio) em 10 mL de água destilada e, em seguida, adicione 0,2 g de I2 (iodo resublimado) nele. Após a mistura, leve o volume total para 100 mL com água destilada.
  2. Prepare a solução FAA (63% etanol anidro, 5% ácido acético glacial, 5% formaldeído e 27% água) e misture antes de usar.
  3. Prepare a solução de coloração azul toluidina de 0,5%: dissolva 0,5 g de azul toluidina em 100 mL de água destilada.
  4. Realize observação fenotípica vegetativa, por meio de imagens de plantas inteiras com uma câmera digital.
  5. Realize observação de fenótipo reprodutivo, remova a palea e a lemma do florete. Tire fotos de anthers inteiros sob um estereóscópio.
  6. Observe a viabilidade do pólen por coloração de iodo.
    1. Escolha espinhos de arroz maduros antes da anestesia da flor, remova a palea e a lemma para soltar os antenos.
    2. Pegue 6 anteras e coloque-os em um escorregador de vidro. Adicione 1 gota de água destilada, esmague bem o anteã com pinças para liberar os grãos de pólen e, em seguida, adicione 2-3 gotas de solução I2-KI. Cubra com a mancha de cobertura.
    3. Observe sob um microscópio de baixa ampliação. Grãos de pólen tingidos preto mostram viabilidade mais vigorosa, nenhuma cor ou marrom-amarelo tingido são atrofiados ou degenerados.
  7. Realize uma seção semi-fina de anther de arroz
    1. Fixar as flores de arroz de diferentes estágios de desenvolvimento em uma solução da FAA. Aspire os materiais a 4 °C (geralmente 15 min) para permitir que o fixador penetre nos tecidos até que o material afunde no fundo da garrafa de coleta.
    2. Substitua por uma nova solução da FAA no dia seguinte. Uma vez que o material afunde até o fundo, substitua com 70% de etanol e armazene a 4 °C para uso a longo prazo.
    3. Desidratar os materiais com diferentes gradientes de etanol (70%, 80%, 95% cada vez por 30 min, 100% etanol por 2h, 100% etanol contendo um pouco de corante safranin por 2h).
      NOTA: Adicione um pouco de corante Safranin no segundo 100% etanol para colorir os antethers para facilitar a secção depois.
    4. Realize a incorporação seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Em seguida, asse em forno a 60 °C por 48 h antes de se seccionar.
    5. Selar a amostra para uma espessura de 2 μm usando um microtome. Adicione uma gota de água na lâmina de vidro. Em seguida, pegue as seções finas contendo blocos de anárpe por fórceps e coloque-as na superfície da gota d'água nas lâminas.
    6. Coloque os slides no banho de água a 50 °C para espalhar completamente as seções para deixá-lo firmemente aderir ao escorregador.
    7. Use 0,5% de toluidina azul solução manchar os slides por 30 minutos. Em seguida, enxágue com água e seque no capô da fumaça. Selar com cola de árvore neutra. Coloque delicadamente uma mancha de cobertura no escorregador e seque no capô da fumaça.
    8. Observe e fotografe a amostra sob um microscópio.

Resultados

Demonstrado aqui o uso da tecnologia de edição de genes para criar uma linha masculina estéril para futuras pesquisas da Agrobacterium- transformação genética mediada em arroz. Para criar a linha masculina estéril de osabcg15,a mutagênese mediada pelo CRISPR-CAS9 foi usada para a construção de vetores binários. O sgRNA foi conduzido pelo promotor osU3, enquanto o de expressão de hSpCas9 foi impulsionado pelo promotor duplo 35S, e o vetor médio foi montado em um único vetor binário pCA...

Discussão

Mutantes estéreis artificiais machos são tradicionalmente gerados por mutagênese física, química ou biológica aleatória. Embora sejam técnicas poderosas, sua natureza aleatória não consegue capitalizar a vasta quantidade de conhecimento genômico moderno que tem o potencial de proporcionar melhorias personalizadas na reprodução molecular32. O sistema CRISPR-Cas9 tem sido amplamente utilizado em plantas devido aos seus meios simples e acessíveis para manipular e editar DNA

Divulgações

Nenhum.

Agradecimentos

Os autores gostariam de reconhecer Xiaofei Chen por fornecer as inflorescências de arroz jovens e assistência para tornar a cultura do tecido de arroz meio. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31900611).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Naphthaleneacetic acidSigma-AldrichN0640
2，4-Dichlorophenoxyacetic AcidSigma-AldrichD7299
6-Benzylaminopurine (6-BA)Sigma-AldrichB3408
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
AgarSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000561
Ammonium sulfateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10002918
Aneurine hydrochlorideSigma-AldrichT4625
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218
Bacteriological peptoneSangon BiotechA100636
Beef extractSangon BiotechA600114
Boric acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004808
Calcium chloride dihydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd20011160
Casein acid hydrolysateBeijing XMJ Scientific Co., LtdC184
Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10007216
Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10008218
D(+)-Glucose anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63005518
D-sorbitolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63011037
EDTA, Disodium Salt, DihydrateSigma-AldrichE5134
EOS Digital SLR and Compact System CamerasCanonEOS 700D
FormaldehydeSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010018
Fully Automated Rotary MicrotomeLeica BiosystemsLeica RM 2265
Glacial acetic acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000208
GlycineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62011516
HygromycinBeijing XMJ Scientific Co., LtdH370
InositolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63007738
IodineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10011517
Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012116
KanamycineBeijing XMJ Scientific Co., LtdK378
KinetinSigma-AldrichK0753
L-ArginineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004034
L-Aspartic acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004736
L-GlutamineBeijing XMJ Scientific Co., LtdG229
L-prolineBeijing XMJ Scientific Co., LtdP698
Magnesium sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013018
Manganese sulfate monohydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013418
MicroscopesNIKONEclipse 80i
MSPhytotechM519
Nicotinic acidSigma-AldrichN0765
PhytagelSigma-AldrichP8169
Potassium chlorideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016308
Potassium dihydrogen phosphateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017608
Potassium iodideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017160
Potassium nitrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001721933
Pyridoxine Hydrochloride (B6)Sigma-Aldrich47862
RifampicinBeijing XMJ Scientific Co., LtdR501
Sodium hydroxideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
Sodium molybdate dihydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019816
Stereo microscopesLeica MicrosystemsLeica M205 A
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10021418
Technovit embedding Kits 7100Heraeus Teknovi, Germany14653
TimentinBeijing XMJ Scientific Co., LtdT869
Toluidine Blue OSigma-AldrichT3260
Water bath for paraffin sectionsLeica BiosystemsLeica HI1210
Yeast extractSangon BiotechA515245
Zinc sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10024018

Referências

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