JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

这项工作描述了使用CRISPR-Cas9基因组编辑技术敲除内源 基因OsABCG15， 然后修改的农业细菌 中培养转化方案，在水稻中产生稳定的雄性-无菌线。

摘要

雄性不育是杂交种子生产的重要农艺特征，通常以雄性生殖器官/游戏体的功能缺陷为特征。CRISPR-Cas9基因组编辑技术的最新进展使特定位点内源候选基因的编辑效率高，而且可以节省时间。此外， 水稻的农业细菌中位基因转化也是基因改造的关键方法，已被许多公立和私营实验室广泛采用。在这项研究中，我们应用CRISPR-Cas9基因组编辑工具，通过目标基因组编辑 OsABCG15在japonica 培养中成功生成三 条雄性无菌 突变线。我们采用一 种改良的农业细菌调剂水稻转化方法，为水稻杂交种子生产提供了优良的遗传消瘦手段。转基因植物可以在2~3个月内获得，通过PCR扩增和桑格测序通过基因分型筛选同源转化剂。通过对水稻雄性生殖器官的微观观察，通过碘碘化钾（I2-KI）染色半薄横截面进行花粉生存能力分析，对雄性无菌同源线进行基本表型表征。

引言

稻米是最重要的粮食作物，特别是在发展中国家，是世界人口一半以上的主食。总体而言，对稻谷的需求正在增长，预计到2030年将增长50%，到2050年将增长100%。,2未来水稻产量的提高需要利用多样化的分子和遗传资源，使水稻成为单体植物研究的优秀模型。其中包括一个有效的转换系统，先进的分子图，和公开访问的数据库的表达序列标签，这是多年来产生的,3，4。提高作物产量的一个策略是杂交种子生产5，其中一个核心要素是操纵男性生育能力。了解谷物作物中男性肥力的分子控制有助于将关键知识转化为实用技术，以提高杂交种子产量，提高作物,产量。

基因转化是基础研究和商业农业的关键工具，因为它能够引进外来基因或操纵作物中的内源基因，并产生转基因线。适当的转化方案可以帮助加速遗传和分子生物学研究，以基本理解基因调控8。在细菌中，遗传转化是自然发生的;然而，在植物中，它是使用分子生物学技术9，10,人为执行的。农业细菌Tumefaciens是一种土壤传播的、格拉姆阴性细菌，通过T-DNA（Ti质粒的一个区域）通过IV型分泌系统11，12将T-DNA转移到植物细胞中，导致植物冠胆病。在植物中，A.tumefaciens-中照转化被认为是一种广泛的基因修饰方法，因为它导致T-DNA稳定且低拷贝数集成到宿主基因组13中。转基因水稻是1990Agrobacterium年代中期在雅波尼卡品种14中首次通过农业细菌培养基因转化产生的。利用该协议，在4个月内获得多条转基因线路，转化效率为10%~30%。研究表明，成功转化有两个关键步骤:一是胚胎基因从成熟种子中诱导，另一个是将乙酰胺酮（一种酚类化合物）加入到共同培养的细菌培养中，从而在14、15,植物中提高转化效率。该协议已广泛使用与小改动在japonica16，,17，,18， 19,19以及其他品种，如稻谷20， 21，,21,22，,23和热带贾波尼卡24，,25.事实上，超过80%的关于水稻转化的文章使用农业细菌中位基因转化作为工具13。迄今为止，已经开发出几种基因转化方案，利用水稻种子作为卡卢斯诱导16、17、18、19,17,18,的起始材料。然而，对于年轻的花序作为卡卢斯生产的外植，却很少为人所知。总体而言，为功能基因组学和作物改良研究建立快速、可重复、高效的基因转化和再生协议非常重要。

近年来，CRISPR-Cas9技术的发展产生了精确的基因组编辑机制，以了解基因功能，为植物育种提供农,27艺上的重要改进。CRISPR也为男性生殖发育和杂交生产提供了相当大的希望。在这项研究中，我们利用CRISPR-Cas9技术利用基因敲除系统，并结合使用幼年花序作为外植的高效水稻基因转化方案，从而为研究生殖发育创造稳定的雄性无菌线。

研究方案

1. sgRNA-CAS9植物表达载体 构造和农业细菌-中栽转化

  1. 根据28日出版的文献，在水稻中瞄准雄性无菌基因OsABCG15。
  2. 在 OsABCGG15 的第二个 exon 中，为位于 106-125 bp 之间的目标站点设计 sgRNA（图 1）。
  3. 使用 T4 多核苷酸激酶合成 sgRNA 寡糖 （sgR-osABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGAT3' 和 5'sgR-OsABCG15-R:ACATCCCCTGTGTGTT'）。
  4. 使用内核糖化 BBSI 消化 psgR-Cas9 骨干向量29。
  5. 按照制造商的协议使用T4连结使用线性psgR-Cas9骨干网将合成的sgRNA寡合体进行。
  6. 使用HinsIII/EcoRI，从步骤1.5和子包到pCAMBIA1300二进制载体的HinsIII/EcoRI站点中消化sgRNA盒，实现稳定变换29。
  7. 通过酶消化和测序确认构造质粒。之后，将二元结构 转化为农业细菌图梅法辛菌株 EHA105，并在28°C的Kan/Rif选择板上生长2~3天。

2. 水稻遗传转化和植物组织培养

  1. 卡卢斯感应和再生
    注:使用新鲜的幼米花序作为起始材料来诱导卡卢斯（图2）。
    1. 收集年轻的花序从稻田或绿屋在梅病阶段，由1.6-4.8毫米的花长确定（图2A）29。29确保水稻花序上覆盖着叶套。用 70% 的酒精拭子擦拭每个花序，在切割前晾干。
    2. 将花序带到干净的无菌长凳上。用消毒剪刀将其切成小块（越小越好），然后将切割转移到含有 NBD2 介质的培养板（图 2B，表 1）。
    3. 在26°C的黑暗中孵育板约10-14天，以诱导卡卢斯（图3A）。
      注:使用新形成的农业细菌渗透卡 卢斯（ 步骤2.2.7）直接或重新修复一次在新鲜的NBD2介质，以获得更多的卡卢斯。每 8~10 天将调用转移到新的 NBD2 介质中。
  2. 转型与共同培育
    1. 使用包含步骤 1.6 中的二质粒的 A. tumefaciens 细菌进行转化。将 A. tumefaciens 菌株 存放在 YEB 介质 （表 1） 中，在 -80 °C 下将 50% 甘油储存，供进一步使用。
    2. 从A. tumefaciens -80°C 甘油库存到含有选择性抗生素的 YEB agar 介质（表1），在 25~28°C 下生长 48~72 小时，允许菌落出现。
    3. 在50 mL锥形无菌试管中，用选择性抗生素从YEB板接种含有相同选择性抗生素的5 mL液体YEB介质（表1）。在250 x g的轨道摇床上摇动，温度为25~28°C，直到细菌长到0.5的OD600。
    4. 在250 mL圆锥烧瓶中加入1mL的细菌悬浮液至100 mL的YEB介质（表1），并在250 x g的轨道摇床上摇动，在28°C下4小时。
    5. 在室温下以 4，000 x g 离心 10 分钟，收集细菌。丢弃上一杯。
    6. 用AM-AS介质（表1）重新悬浮细菌颗粒，将悬浮液稀释至OD 600 = 0.4。
      注:细菌悬浮液的完美OD对于高效转化至关重要。它有助于消除过度的细菌生长在卡卢斯。
    7. 从步骤2.1.3收集约150个健康生长的浅黄色脆弱胚胎，放入150mL无菌烧瓶中。将步骤2.2.6中的50~75 mL细菌细胞悬浮液加入无菌烧瓶中，然后加入约10~25 mL新鲜AM-AS介质，使卡利浸入10~20分钟，偶尔摇晃。
    8. 小心地从烧瓶中倒出细菌悬浮液，并使用无菌滤纸或纸巾将多余的细菌悬浮液从#1中干燥。然后把它们放在用NBD-AS介质（表1）覆盖的无菌滤纸和#1。在黑暗中25~28°C孵育3天，检查细菌过度生长。
  3. 耐磨的卡卢斯选择
    1. 经过3天的共同栽培，将卡利转移到无菌培养皿与无菌滤纸。
    2. 在干净的长凳上风干 2 小时。确保卡努斯未粘附在滤纸上。
    3. 使用无菌钳子均匀地转移卡利至初级选择介质 NBD2（带 40 mg/L 湿霉素和 250 mg/L 时素） （表 1）。在黑暗中25~28°C的培养卡利2周。
    4. 2周后，均匀地将卡利转移到含有新鲜选择介质NBD2的新盘子（含40毫克/升吸霉素和250毫克/升正则素）（表1）。在黑暗中25~28°C下再培养2周。
  4. 卡卢斯差异化
    1. 将卡卢斯转移到新鲜的MS中等（与25毫克/升湿霉素和150毫克/升时素）（表1）。在25~28°C的光线下培养约2周。
    2. 再重复步骤 2.4.1。
    3. 将芽转移到新的MS介质（用10毫克/升的催眠素），以增殖更多的芽。
  5. 根感应
    1. 将新芽转移到 1/2 MS 介质中（表 1）。在25°C - 28°C的光下培养。 转化的植物在2周内产生根。
    2. 1周后，将植物转移到覆盖植物的清洁盆中，以防止脱水。

3. 基因型识别

  1. 使用乙酰甲基溴（CTAB）方法31从新生成的植物中收集幼叶，以提取总DNA。
  2. 使用基因组DNA作为模板，选择素转剂（Hygromycin-F:5' GATGTTGGCCCCTATTAT 3' 和海格罗霉素-R:5' CGAGAATCTCTCTCTC3' 位于海格罗霉素区域）执行聚合酶链反应（PCR）以验证转基因整合和频率（图4）。以下PCR条件:94°C，5分钟;36 个周期（94 °C 表示 30 s;56 °C 表示 30 s;72 °C 1 分钟）;72 °C 7分钟成功的PCR反应产生604bp安培。
  3. 执行另一个 PCR，使用特定的底转（OsABCG15-ID-F:5' GTCTCATCTCTCACATCT 3' 和 OsABCG15-ID-R:5' TTTGTACATTTATTTC 3'）放大CRISPR靶点周围的基因组区域，以确定转化剂的基因型。PCR 条件与步骤 3.2 中的条件相同。
  4. 直接使用步骤 3.3 中的 PCR 片段进行桑格测序，以识别突变。

4. 观察突变体的基本表型

  1. 准备 I2-KI 溶液:在 10 mL 蒸馏水中溶解 2 g KI（碘化钾），然后加入 0.2 g I2（ 重新吸收碘）。混合后，将总体积与蒸馏水一起达到100 mL。
  2. 准备 FAA 溶液（63% 无水乙醇、5% 冰醋酸、5% 甲醛和 27% 水）并在使用前混合。
  3. 准备0.5%的托卢伊丁蓝色染色溶液:在100 mL的蒸馏水中溶解0.5克托卢伊丁蓝。
  4. 通过数码相机对整个植物进行成像，进行植物表型观察。
  5. 进行生殖表型观察，从花瓣中去除古生物和表皮。在立体显微镜下拍摄整个动脉的照片。
  6. 通过碘染色观察花粉的生存能力。
    1. 在花香前采摘成熟的稻穗，取出古色古香和白米，释放香膏。
    2. 拿 6 个安瑟，把它们放在玻璃滑梯上。加入1滴蒸馏水，用钳子粉碎另一个井，释放花粉颗粒，然后加入2~3滴的一2-KI溶液。盖上盖玻片。
    3. 在低放大显微镜下观察。花粉粒染成黑色显示更旺盛的生存能力，没有颜色或黄褐色染色发育迟缓或退化。
  7. 执行半薄的水稻部分
    1. 将不同发育阶段的米花固定到 FAA 解决方案中。在 4 °C（一般 15 分钟）下真空材料，使固定材料渗透到组织中，直到材料沉入收集瓶的底部。
    2. 第二天更换新的 FAA 解决方案。一旦材料沉入底部，用70%乙醇代替，储存在4°C，供长期使用。
    3. 用不同梯度的乙醇脱水材料（30分钟为70%、80%、95%，2小时为100%乙醇，2小时为100%乙醇，含一点萨夫兰宁染料为100%乙醇为2小时）。
      注:在第二个100%乙醇中加入一点萨夫兰宁染料，为安瑟着色，以便于事后进行分节。
    4. 按照制造商的说明（材料表）执行嵌入。然后，在60°C的烤箱中烘烤48小时，然后进行切块。
    5. 使用微原子将样品分段到2 μm的厚度。在玻璃滑梯上加一滴水。然后，拿起用钳子拾取包含另一个方块的薄部分，并把它们放在滑梯上的水滴表面。
    6. 将滑梯放在 50°C 的水浴上，以完全展开部分，让它牢固地粘附在滑轨上。
    7. 使用 0.5% 的托利丁蓝色溶液弄脏幻灯片 30 分钟。然后，用水冲洗，在烟罩中干燥。用中性树胶密封。轻轻地将盖玻片放在幻灯片上，并在烟罩中干燥。
    8. 在显微镜下观察和拍摄样品。

结果

这里演示的是利用基因编辑技术，为水稻中农业细菌的遗传转化的未来研究创建一条雄性无菌线。为了创建雄性无菌线osabcg15，CRISPR-CAS9中位突变用于二元向量构造。sgRNA由OsU3启动子驱动，而hSpCas9的表达盒是由双35S启动子驱动的，中间载体组装在一个二进制载体pCAMBIA1300中，专为农业细菌中调解的水稻稳定转化而设计。图1A提供了用于CRISPR/Cas9中切水稻突变的构造的

讨论

人工原生雄性无菌突变体传统上由随机的物理、化学或生物突变产生。虽然这些都是强大的技术，他们的随机性质未能利用大量的现代基因组知识，有可能提供定制的改进分子育种32。CRISPR-Cas9系统由于其操作和编辑DNA29，33的简单而经济实惠的手段，在植物中得到了广泛的应用。与传统的诱变方法相比，它具有节省时间的潜力。

披露声明

没有。

致谢

作者感谢陈小飞为幼米提供花序，协助制作水稻组织培养媒介。这项工作得到了国家自然科学基金（31900611）的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Naphthaleneacetic acidSigma-AldrichN0640
2, 4-Dichlorophenoxyacetic AcidSigma-AldrichD7299
6-Benzylaminopurine (6-BA)Sigma-AldrichB3408
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406
AgarSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000561
Ammonium sulfateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10002918
Aneurine hydrochlorideSigma-AldrichT4625
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218
Bacteriological peptoneSangon BiotechA100636
Beef extractSangon BiotechA600114
Boric acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004808
Calcium chloride dihydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd20011160
Casein acid hydrolysateBeijing XMJ Scientific Co., LtdC184
Cobalt(II) chloride hexahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10007216
Copper(II) sulfate pentahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10008218
D(+)-Glucose anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63005518
D-sorbitolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63011037
EDTA, Disodium Salt, DihydrateSigma-AldrichE5134
EOS Digital SLR and Compact System CamerasCanonEOS 700D
FormaldehydeSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010018
Fully Automated Rotary MicrotomeLeica BiosystemsLeica RM 2265
Glacial acetic acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000208
GlycineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62011516
HygromycinBeijing XMJ Scientific Co., LtdH370
InositolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd63007738
IodineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10011517
Iron(II) sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012116
KanamycineBeijing XMJ Scientific Co., LtdK378
KinetinSigma-AldrichK0753
L-ArginineSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004034
L-Aspartic acidSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd62004736
L-GlutamineBeijing XMJ Scientific Co., LtdG229
L-prolineBeijing XMJ Scientific Co., LtdP698
Magnesium sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013018
Manganese sulfate monohydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013418
MicroscopesNIKONEclipse 80i
MSPhytotechM519
Nicotinic acidSigma-AldrichN0765
PhytagelSigma-AldrichP8169
Potassium chlorideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016308
Potassium dihydrogen phosphateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017608
Potassium iodideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017160
Potassium nitrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001721933
Pyridoxine Hydrochloride (B6)Sigma-Aldrich47862
RifampicinBeijing XMJ Scientific Co., LtdR501
Sodium hydroxideSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
Sodium molybdate dihydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019816
Stereo microscopesLeica MicrosystemsLeica M205 A
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10021418
Technovit embedding Kits 7100Heraeus Teknovi, Germany14653
TimentinBeijing XMJ Scientific Co., LtdT869
Toluidine Blue OSigma-AldrichT3260
Water bath for paraffin sectionsLeica BiosystemsLeica HI1210
Yeast extractSangon BiotechA515245
Zinc sulfate heptahydrateSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10024018

参考文献

  1. Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
  2. Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
  3. Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
  4. Lippman, Z. B., Zamir, D. Heterosis: revisiting the magic. Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).
  5. Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
  6. Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
  7. Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
  8. Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
  9. Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).
  10. Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
  11. Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
  12. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
  13. Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
  14. Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
  15. Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
  16. Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
  17. Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
  18. Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
  19. Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
  20. Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
  21. Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
  22. Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
  23. Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice. Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).
  24. Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
  25. Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
  26. Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
  27. Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
  28. Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
  29. Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
  30. Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
  31. Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

Jove 164 CRISPR Cas9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。