Corte cerebral de ratón agudo para investigar la actividad espontánea de la red de hipocampo

Resumen

Este protocolo describe la preparación de rodajas horizontales de corteza hipocampal-entorrinaal (HEC) de ratones que exhiben actividad espontánea de ondulación de onda aguda. Las rodajas se incuban en una cámara de retención de interfaz simplificada y las grabaciones se realizan en condiciones sumergidas con líquido cefalorraquídeo artificial de flujo rápido para promover la oxigenación tisular y la aparición espontánea de la actividad a nivel de red.

Resumen

El corte cerebral agudo de roedores ofrece un enfoque experimental tractable para obtener información sobre la organización y función de los circuitos neuronales con resolución unicelular mediante electrofisiología, microscopía y farmacología. Sin embargo, una consideración importante en el diseño de experimentos in vitro es hasta qué punto diferentes preparaciones de rebanadas recapitulan patrones naturalistas de actividad neuronal como se observa in vivo. En el cerebro intacto, la red de hipocampos genera una actividad poblacional altamente sincronizada que refleja el estado conductual del animal, como lo ejemplifican los complejos de ondulación de onda aguda (SWR) que se producen durante la vigilia de los estados consumados o el sueño no REM. Los SWR y otras formas de actividad de la red pueden surgir espontáneamente en rodajas de hipocampo aisladas en condiciones apropiadas. Con el fin de aplicar el potente kit de herramientas de corte cerebral a la investigación de la actividad de la red de hipocampo, es necesario utilizar un enfoque que optimice la salud de los tejidos y la preservación de la conectividad funcional dentro de la red del hipocampo. Los ratones se fusionan transcardialmente con líquido cefalorraquídeo artificial a base de sacarosa fría. Las rodajas horizontales que contienen el hipocampo se cortan a un espesor de 450 μm para preservar la conectividad sináptica. Los sectores se recuperan en una cámara de estilo interfaz y se transfieren a una cámara sumergida para grabaciones. La cámara de grabación está diseñada para la superfusión de doble superficie de líquido cefalorraquídeo artificial a un alto caudal para mejorar la oxigenación de la rebanada. Este protocolo produce tejido sano adecuado para la investigación de la actividad compleja y espontánea de la red in vitro.

Introducción

La medición electrofisiológica de las rodajas de hipocampo vivos in vitro es un potente enfoque experimental con numerosas ventajas. El experimentador puede utilizar un microscopio, micromanipuladores y un sistema de grabación para visualizar y recopilar directamente mediciones de neuronas individuales en el tejido. Las rodajas de tejido también son muy accesibles para la fototimulación o la administración de fármacos para experimentos optogenéticos, químicos o farmacológicos.

La red hipocampal genera una actividad poblacional altamente sincrónica in vivo,visible como oscilaciones en el potencial de campo local extracelular^1,2,3,4,5. Los métodos de corte cerebral se han aprovechado para obtener información sobre los mecanismos celulares y de circuito subyacentes a estas oscilaciones de la red neuronal. El trabajo fundacional de Maier et al. demostró que los complejos afilados de onda-ondulación (SWR) pueden emerger espontáneamente en rodajas del hipocampo ventral^6,7. Estudios posteriores de múltiples investigadores han aclarado gradualmente muchos aspectos de los SWR, incluyendo el papel de los neuromoduladores en la regulación del estado de red del hipocampo^8,9,10 y los mecanismos sinápticos que impulsan la reactivación in vitro de conjuntos neuronales previamente activos durante el comportamiento in vivo^11. Los experimentos de corte cerebral también han proporcionado información sobre la oscilación del rango gamma (30-100 Hz), un estado de red hipocampal distinto que se cree que admite la codificación de memoria y la recuperación^12,13. Por último, reconociendo el papel central del hipocampo y las estructuras asociadas en la fisiopatología de la epilepsia del lóbulo temporal^14,15,los investigadores han utilizado preparaciones de rebanadas de hipocampo para investigar la generación y propagación de la actividad epileptiforme. Carter y otros demostraron que las rodajas combinadas de corteza hipocampal-entorrinal preparadas a partir de animales crónicamente epilépticos pueden generar espontáneamente descargas epileptiformes in vitro^16. Posteriormente, Karlócai et al. exploró los mecanismos subyacentes a las descargas epileptiformes en rodajas de hipocampo mediante el uso de líquido cefalorraquídeo artificial modificado (ACSF) con concentraciones de iones alteradas (mg²⁺ reducido o K⁺elevado) o medicamentos añadidos (4AP o gabazina)^17.

Los investigadores han desarrollado numerosos enfoques de rebanadas de hipocampo que difieren de maneras clave: (1) la región del hipocampo contenida en la rebanada (dorsal, intermedia o ventral); 2) la presencia o ausencia de tejidos extrahippocampales como la corteza entorrina; (3) la orientación utilizada para cortar rodajas (coronales, sagitales, horizontales u oblicuas); y (4) las condiciones en las que se mantiene el tejido después del corte (sumergido completamente en ACSF o mantenido en la interfaz de ACSF y aire humidificado y rico en carbohidratos).

La elección de qué enfoque de corte debe determinarse mediante el objetivo experimental. Por ejemplo, las rodajas transversales o coronales del hipocampo dorsal mantenido en condiciones sumergidas se han utilizado muy eficazmente para la investigación de circuitos intrahippocampales y plasticidad sináptica^18,19,20. Sin embargo, tales preparaciones no generan espontáneamente oscilaciones de red tan fácilmente como las rebanadas del hipocampo ventral^21,22,23. Aunque un estado de actividad persistente de SWR puede ser inducido por estimulación tetánica en rodajas transversales del hipocampo dorsal y ventral^24,los SWR espontáneos se observan más fácilmente en las rodajas ventrales^7,25.

Una distinción fisiológica y anatómica inherente entre el hipocampo dorsal y ventral está respaldada por estudios realizados tanto in vivo como in vitro^26. Las grabaciones en ratas revelaron ritmos theta fuertemente coherentes a lo largo del hipocampo dorsal e intermedio, pero mala coherencia entre la región ventral y el resto del hipocampo^27. Los SWR in vivo se propagan fácilmente entre el hipocampo dorsal e intermedio, mientras que los SWR que se originan en el hipocampo ventral a menudo permanecen locales^28. Las proyecciones asociacionales originadas a partir de neuronas piramidales CA3 que residen en el hipocampo dorsal e intermedio proyectan largas distancias a lo largo del eje longitudinal del hipocampo. Las proyecciones ca3 procedentes de regiones ventrales siguen siendo relativamente locales y, por lo tanto, tienen menos probabilidades de ser cortadas durante el proceso de corte^29,30. Por lo tanto, las rodajas ventrales pueden conservar mejor la red recurrente necesaria para generar sincronia de población. La propensión de las rodajas ventrales a generar actividades espontáneas de red in vitro también puede reflejar una mayor excitabilidad intrínseco de las neuronas piramidales o una inhibición GABAérgica más débil en el hipocampo ventral en comparación con las regiones más dorsales^31. De hecho, las rodajas de hipocampo ventral son más susceptibles a la actividad epileptiforme^32,33. Así, muchos estudios de oscilaciones fisiológicas espontáneas de red^8,9,11,24 o patológicas^16,34,35,36 han utilizado tradicionalmente un enfoque de corte horizontal, a veces con un ligero ángulo en la dirección fronto-occipital, que produce rodajas de tejido paralelas al plano transversal del hipocampo ventral.

La conectividad de red se ve inevitablemente afectada por el procedimiento de corte, ya que muchas celdas del sector se cortarán. El ángulo y el grosor de la rebanada y el tejido retenido en la preparación deben considerarse para optimizar la conectividad en los circuitos de interés. Muchos estudios han utilizado rodajas horizontales combinadas de corteza hipocampal-entorrinales (HEC) para explorar interacciones entre las dos estructuras en el contexto de oscilaciones fisiológicas o patológicas de la red. Roth et al. realizaron grabaciones duales desde el subcampo CA1 del hipocampo y la capa V de la corteza entorrinal medial para demostrar la propagación de la actividad SWR a través de la rebanada^{HEC 37.} Muchos estudios de actividad epileptiforme han utilizado la preparación de la rebanada HEC para investigar cómo se propagan las descargas epileptiformes a través de la red corticohippocampal^16,35,36,38. Es importante tener en cuenta que la preservación del bucle corticohippocampal intacto no es un requisito previo para los SWR espontáneos, descargas epileptiformes o oscilaciones gamma; las oscilaciones de red se pueden generar en rodajas transversales del hipocampo dorsal o ventral sin tejidos parahippocampales unidos^{21,22,23, 25,39,40,41.} Un factor más importante para la generación espontánea de oscilaciones de red en rodajas de hipocampo puede ser el grosor de cada rebanada, ya que una rebanada más gruesa (400-550 μm) preservará más conectividad en la red recurrente CA2/CA3^21,22,25.

Aunque se han utilizado rodajas HEC horizontales en ángulo (cortadas con un ángulo aproximado de 12° en la dirección fronto-occipital) para estudiar la conectividad funcional del bucle corticohippocampal^{11,16,34,35,42,}tales preparaciones en ángulo no son necesarias para la actividad espontánea de la red^43,44,45. Sin embargo, el uso de un plano de corte en ángulo permite al investigador hacer selectivamente rodajas que conserven mejor las lamellas orientadas transversalmente del hipocampo ventral o intermedio, dependiendo de si se aplica un ángulo hacia abajo o hacia arriba(Figura 1). Este enfoque es conceptualmente similar al utilizado por Papatheodoropoulos et al., 2002, que diseccionó cada hipocampo libre y luego utilizó un helicóptero de tejido para crear rodajas transversales a lo largo de todo el eje dorsal-ventral^21. A la luz de las distinciones funcionales antes mencionadas entre el hipocampo ventral y dorsal-intermedio, los investigadores deben considerar el origen anatómico de las rodajas al diseñar experimentos o interpretar resultados. El uso de una rampa de agar durante el procedimiento de corte es una manera sencilla de producir preferentemente rodajas del hipocampo intermedio o ventral.

Las rodajas de hipocampo se pueden mantener en una cámara sumergida (con el tejido completamente sumergido en ACSF), o una cámara de estilo interfaz (por ejemplo, cámara Oslo o Haas, con rodajas cubiertas sólo por una fina película de medios que fluyen). El mantenimiento de la interfaz mejora la oxigenación del tejido, que promueve la supervivencia neuronal y permite niveles altos sostenidos de actividad interneuronal. Tradicionalmente, las condiciones de registro sumergidas utilizan un caudal de ACSF más lento que no proporciona una oxigenación adecuada del tejido para una expresión estable de las oscilaciones a nivel de red. En las rodajas de hipocampo sumergido oscilaciones gamma inducidas por carbachol sólo se observan transitoriamente^46,47, mientras que se pueden mantener establemente en las cámaras de grabación de interfaz^10,48,49. Como tal, muchos estudios de actividad espontánea compleja in vitro se han basado en cámaras de registro de interfaz para investigar complejos de ondulación de ondulación aguda^{6,7,8,9,10,25,37,}oscilaciones gamma^10,13,y actividad epileptiforme^16,38,45,47.

En una cámara de grabación de estilo sumergido, se puede utilizar un objetivo de microscopio de inmersión para visualizar células individuales y dirigirse selectivamente a células de aspecto saludable para grabaciones. La preparación sumergida también permite un control fino sobre el entorno celular, ya que la inmersión facilita la rápida difusión de fármacos u otros compuestos al tejido. Por lo tanto, una metodología modificada en la que se mantienen oscilaciones estables de la red en condiciones sumergidas representa un enfoque experimental potente. Este enfoque se ejemplifica con el trabajo de Hájos et al., en el que las rodajas de hipocampo se recuperan en una cámara de sujeción simplificada de estilo interfaz durante varias horas antes de transferirse a una cámara de grabación sumergida modificada con un alto caudal de ACSF (~6 mL/min) para mejorar el suministro de oxígeno al tejido^12,48,49. En estas condiciones, se pueden mantener altos niveles de actividad interneuron y oscilaciones espontáneas estables de la red en una cámara de grabación sumergida. Este enfoque modificado permite a los investigadores realizar grabaciones de abrazaderas de parches de células enteras guiadas visualmente y caracterizar la contribución de los tipos celulares identificados morfológicamente a las oscilaciones gamma inducidas por carbachol^12. Los SWR también pueden ocurrir espontáneamente en rodajas de hipocampo sumergidas con un caudal rápido de ACSF^11,48,49. Maier et al. demostraron que las rodajas de hipocampo que se recuperaban en una cámara de interfaz antes de transferirse a una cámara de grabación sumergida mostraban de forma fiable swrs espontáneos, mientras que las rodajas que se recuperaban sumergidas en un vaso de precipitados antes de ser transferidas a una cámara de grabación sumergida mostraban respuestas de campo evocadas más pequeñas, niveles más bajos de corrientes sinápticas espontáneas, y sólo muy rara vez mostraban SWR espontáneos^43. Schlingloff et al. utilizaron esta metodología mejorada para demostrar el papel de las células de cesta que expresan parvalbumina en la generación de SWR^{espontáneos 44}.

El siguiente protocolo presenta un método de corte a través del cual las neuronas espontáneamente activas en rodajas de hipocampo horizontal pueden recuperarse en condiciones de interfaz y posteriormente mantenerse en una cámara de grabación sumergida adecuada para manipulaciones farmacológicas u optogenéticas y grabaciones guiadas visualmente.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Columbia (AC-AAAU9451).

1. Preparar soluciones

1. Preparar solución de corte de sacarosa para cortar como se describe en la Tabla 1.
   NOTA: Después de preparar 1 L de solución de sacarosa, congele una pequeña cantidad (aproximadamente 100-200 ml) en una bandeja de hielo. Estos cubitos de hielo de sacarosa congelados se mezclarán en un purines helados (ver paso 4.3).
2. Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) para su registro como se describe en la Tabla 2.
3. Preparar 1 M de NaCl para pipetas de estimulación mediante la disolución de 0,05844 g de NaCl en 1 ml de agua purificada que se ha filtrado para eliminar los metales traza y otras impurezas.
   NOTA: La solución de corte de sacarosa y el ACSF deben prepararse frescos para cada experimento.

2. Preparar la rampa del agar

1. Preparar 4% de agar (por ejemplo, 2 g de agar en 50 ml de agua) disolviendo polvo de agar en agua purificada que se ha filtrado para eliminar los metales traza y otras impurezas. Caliente la mezcla en un microondas hasta que empiece a hervir (aproximadamente 30-60 s). Vierta el agar fundido en un molde y deje que se enfríe y solidifique a 4 °C en una nevera a una inclinación de aproximadamente 12°.
   NOTA: Para un molde, se puede utilizar cualquier recipiente de vidrio o plástico en un ángulo, con suficiente agar fundido vertido para formar una rampa de 4 cm de longitud y aproximadamente 0,8 cm de altura.

3. Escenificar el área de corte

1. Llene un vaso de precipitados de 400 ml que contenga una cámara de recuperación de rebanadas con aproximadamente 250 ml de ACSF; colocarlo en un baño de agua calentado a 32 °C y comenzar a burbujear con carbógeno (95% gas oxígeno / 5% gas de dióxido de carbono).
   NOTA: Llene el vaso de precipitados de recuperación con suficiente líquido para colocar la malla de nylon de la cámara de sujeción en la misma superficie de la solución, de modo que las rodajas se mantendrán en la interfaz de la mezcla de solución caliente y el aire(Figura 1). Coloque pequeños trozos de papel de lente en la malla de nylon. Las rodajas se colocarán encima del papel de la lente, que más tarde se puede utilizar para transferir rebanadas individualmente a la cámara de grabación (ver paso 6.6).
2. Coloque un matraz con la solución de sacarosa en un cubo de hielo para enfriar y comenzar a burbujear con carbógeno.
   NOTA: El vaso de recuperación y la solución de sacarosa deben calentarse y enfriarse, respectivamente, con burbujeo de carbógenos durante al menos 30 minutos antes de colocar el ratón en la cámara isoflurano.
3. Extraiga la bandeja de cubitos de hielo de solución de sacarosa prefabricados y congelados del congelador y colóquelo en el banco para descongelarlo parcialmente.
4. Coloque la mitad de una cuchilla de afeitar limpia de doble filo en el microtome y calibrar si es necesario. Reserve la otra mitad de la cuchilla de afeitar para su uso durante la disección.
5. Ejecute una línea de carbógenos y una sonda de temperatura en la cámara de corte y envuel sea rodeada de hielo para enfriar la cámara.
6. Prepare un banco o mesa limpio cubierto con dos almohadillas absorbentes desechables. Poner todas las herramientas de disección y tres piezas de cinta de laboratorio en la almohadilla izquierda, donde se realizará la perfusión transcardial.
   NOTA: Las herramientas de disección incluyen pequeñas tijeras Bonn, tijeras disecctores, espátula/cuchara grandes, microspago, bisturí con nueva hoja, espátula, tijeras quirúrgicas afiladas/contundentes, fórceps de tejido grandes y fórceps de tejido pequeño (ver Tabla de Materiales).
7. En la otra almohadilla absorbente a la derecha del área de perfusión, coloque un trozo circular de papel filtrante en la tapa de una placa Petri de vidrio de 100 mm de diámetro. Coloque la parte inferior de la placa de Petri junto a la tapa y coloque una línea de carbógeno en ambos trozos del plato.
8. Utilice una cuchilla de afeitar o bisturí para cortar una pequeña rampa de agar (aproximadamente 4 cm a lo largo de la superficie en ángulo, 0,8 cm de altura, 2 cm de ancho). Corte un pedazo de la rampa del extremo alto y revierta para crear un bloque de respaldo de agar. Utilice el adhesivo de cianoacrilato para colocar la rampa del agar y el bloque de respaldo en la plataforma de corte y reservar.
   NOTA: El bloque de respaldo del agar ayuda a estabilizar el cerebro durante el corte y proporciona una superficie en la que diseccionar tejidos innecesarios de cada rebanada (Figura 1).

4. Perfusión transcardial

1. Suspenda una jeringa de 60 ml de capacidad como depósito para la solución de corte de sacarosa aproximadamente 18 pulgadas por encima de la sobremesa (por ejemplo, utilizando una abrazadera giratoria de tres puntas en un poste vertical). Conecte el tubo a la parte inferior del depósito, ejecute el tubo a través de una abrazadera de rodillos y conecte el otro extremo del tubo a una aguja limpia de 20 G.
2. Llene el depósito de 60 ml con aproximadamente 30 ml de solución de sacarosa refrigerada y dirija una línea de carbógenos al depósito de sacarosa para burbujear continuamente el perfusato.
   NOTA: Asegúrese de que la sacarosa fluya a través del tubo y la aguja sin burbujas atrapadas. El caudal debe ser lo suficientemente rápido como para tener un flujo constante y continuo de sacarosa goteando de la aguja.
3. Usando una licuadora, tritura y mezcla la sacarosa congelada en un purines helados y usa la espátula/cuchara grande para distribuir los purines.
   1. Coloque una pequeña cantidad de purines de sacarosa alrededor de los bordes de la tapa de la placa de Petri de vidrio. Añade una pequeña cantidad de purines de sacarosa a la parte inferior de la placa De Petri.
   2. Añadir aproximadamente 20-30 ml de purines de sacarosa al depósito de líquido de perfusión, mezclándolo bien con los 30 ml de sacarosa líquida refrigerada hasta que el depósito contenga una mezcla de sacarosa muy fría, predominantemente líquida, con alguna solución congelada remanente.
4. Coloque el ratón en una cámara conectada a un vaporizador isoflurano. Con el oxígeno fluyendo a aproximadamente 2 L/min, gire la esfera del vaporizador para entregar isofluranos a una concentración del 5% y comience un temporizador.
   NOTA: Mantenga este temporizador en marcha durante todo el curso del corte para medir la rapidez con la que se obtienen las rebanadas. El procedimiento debe realizarse lo antes posible, de forma que el corte esté completo, y el tejido se esté recuperando en la cámara de interfaz en un plazo de 15-20 minutos a partir de que el animal entre en la cámara isoflurano. Observe el ratón para asegurarse de que se logra un estado de anestesia profunda. Después de un mínimo de 5 minutos, el ratón debe ser profundamente anestesiado y no responde a pellizcos de los dedos del pie.
5. Inmediatamente antes de retirar el ratón de la cámara isoflurano, llene la tapa de la placa De Petri con solución de sacarosa refrigerada a una profundidad de aproximadamente 3-5 mm y llene el fondo de la placa Petri con solución de sacarosa fría a una profundidad de aproximadamente 1,0 cm.
6. Transfiera rápidamente el ratón a la almohadilla absorbente izquierda y utilice las 3 piezas de cinta para asegurar las extremidades delanteras y la cola. Realice un pellizco del dedo del pie trasero para asegurarse de que el ratón no responde antes de realizar cualquier incisión. Usando las fórceps de tejido grandes y tijeras quirúrgicas, carpa la piel y hacer una incisión a lo largo desde la parte inferior del esternón hasta la parte superior del pecho. Usando las fórceps tire hacia arriba en el esternón y use las tijeras para cortar a través del diafragma.
   NOTA: El posicionamiento inicial del ratón y las primeras incisiones para cortar el diafragma deben realizarse lo más rápido posible para garantizar que el ratón no recupere la conciencia. Para garantizar una profundidad adecuada de anestesia durante todo el procedimiento, se puede colocar un cono nasal en el ratón para suministrar isofluranos durante la perfusión.
7. Utilice las tijeras para cortar a través de la caja torácica a cada lado, cortando en un gran movimiento hacia el punto donde la extremidad delantera se encuentra con el cuerpo. Con las fórceps, balancee la parte delantera de la caja torácica hacia la cabeza, y luego retírela completamente con un corte horizontal usando las tijeras grandes. Sujete el corazón en su lugar usando las fórceps grandes e inserte la aguja de perfusión de 20 G en el ventrículo izquierdo. Una vez que la aguja se coloca correctamente, el lado izquierdo del corazón debe palidecer rápidamente a medida que la solución de sacarosa fría llena el ventrículo.
8. Utilice las pequeñas tijeras dissector para cortar en el atrio derecho y permitir que la sangre fluya fuera del sistema circulatorio. Si las incisiones se realizan correctamente, debe haber un daño mínimo en el corazón, y debe continuar bombeando a lo largo de la perfusión.
   NOTA: Los trozos enrollados de papel tisú se pueden utilizar para eliminar la solución de sangre y sacarosa del corazón y mantener la visibilidad de la aguja de perfusión durante el procedimiento.
9. Asegúrese de que la aguja de perfusión permanezca en su lugar y no caiga del ventrículo izquierdo. Con un caudal y una colocación adecuados, el hígado comenzará a palidecer a un color bronceado/beige claro con 20-30 s.
10. Después de 30-45 s, usa las tijeras grandes para decapitar al ratón. Sosteniendo la cabeza en la mano izquierda, empuje o pele la piel lejos del cráneo. En un animal bien perfundido, el cráneo debe ser muy pálido, y el cerebro debe aparecer de un color rosa muy claro (acercándose al blanco) a través del cráneo sin vasos sanguíneos claramente visibles.

5. Extraiga el cerebro y corte las rebanadas

1. Usando las pequeñas tijeras bonn, hacer dos cortes laterales a través del cráneo hacia la línea media en la parte delantera del cráneo, cerca de los ojos. Haga dos cortes adicionales a ambos lados de la base del cráneo.
2. Transfiera la cabeza a la parte inferior de la placa de cristal Petri, donde debe sumergirse principalmente en solución de sacarosa fría. Usa las pequeñas tijeras bonn para cortar la línea media a lo largo de la longitud del cráneo, tirando hacia arriba con las tijeras para minimizar el daño al tejido cerebral subyacente. Usando los pequeños fórceps tisulares, agarra firmemente cada lado del cráneo y colóquelo hacia arriba y lejos del cerebro, como abrir un libro.
3. Utilice los dedos de la mano izquierda para mantener abiertas las aletas del cráneo e inserte la microspaácula debajo del cerebro cerca de las bombillas olfativas. Voltea el cerebro del cráneo hacia la sacarosa y usa la microspaátula para cortar el tallo cerebral. Lave el cerebro para eliminar cualquier sangre residual, pelaje u otros tejidos.
4. Utilice la espátula/cuchara grande para transferir el cerebro a la tapa de la placa de cristal Petri. Con la otra mitad de la hoja de afeitar de doble filo previamente reservada, hacer dos cortes coronales para primero eliminar el cerebelo y luego la parte más anterior del cerebro, incluyendo las bombillas olfativas(Figura 1).
5. Aplique adhesivo de cianoacrilato en la rampa del agar. Coloque muy brevemente el cerebro en un pedazo de papel filtrante seco usando los fórceps de tejido grandes y luego transfiéralo inmediatamente a la rampa del agar, colocando la superficie ventral del cerebro en el adhesivo.
   NOTA: Para las rodajas del hipocampo intermedio, el cerebro debe estar orientado con el anterior mirando hacia arriba de la pendiente de la rampa, y el posterior más cerca de la hoja. Para las rodajas del hipocampo ventral, oriente el cerebro con el extremo anterior apuntando hacia abajo por la pendiente de la rampa, con el extremo posterior en la parte superior de la rampa, más lejos de la hoja. En cualquier caso, el cerebro debe colocarse en la parte superior de la rampa, de tal manera que la superficie cortada coronalmente del cerebro entre en contacto con el bloque de respaldo del agar (Figura 1).
6. Coloque la plataforma de corte con el agar y el cerebro en la cámara de corte del microtome y sumérjase completamente con solución de sacarosa refrigerada. Utilice la espátula/cuchara grande para transferir algunos purines de sacarosa a la cámara, revolviendo para derretir cualquier sacarosa congelada y reducir rápidamente la temperatura de la mezcla a ~1–2 °C.
   NOTA: Observe el indicador de temperatura durante todo el corte. Si la solución de sacarosa se calienta por encima de 3 °C, agregue más purines y mezcle para volver a bajar la temperatura.
7. Corte las rodajas a un espesor de 450 μm con la velocidad del microtome establecida en 0,07 mm/s. A medida que se libera cada rebanada, utilice los pequeños fórceps tisulares y un bisturí afilado para separar primero los dos hemisferios, y luego para cortar el tejido hasta que la rebanada consista principalmente en las regiones del hipocampo y parahippocampal (Figura 1).
8. Utilice una pipeta de transferencia de plástico para transferir las rodajas individualmente a la cámara de recuperación de la interfaz, asegurándose de que se colocan en la interfaz del ACSF y el aire con sólo un menisco delgado de ACSF que cubre las rodajas. Cierre firmemente la tapa de la cámara y deje que las rodajas se recuperen a 32 °C durante 30 min.
9. Después de la recuperación inicial a 32 °C, saque la cámara de recuperación de la interfaz del baño de agua y colóquela en un agitador ajustado a una velocidad lenta de modo que la barra de agitación magnética promueva la circulación de ACSF dentro de la cámara. Deje que se enfríe gradualmente a temperatura ambiente a medida que las rodajas se recuperan durante 90 minutos adicionales. Asegúrese de que la cámara de recuperación se burbujee continuamente con carbógeno y no permita que las burbujas grandes queden atrapadas debajo de las rodajas.

6. Realizar grabaciones de potencial de campo local (LFP) de actividad espontánea

1. Prepárese para las grabaciones LFP encendiendo todo el equipo necesario, incluyendo el ordenador que ejecuta el software de adquisición, el monitor conectado al ordenador, los estimuladores, el micromanipulador, el controlador de temperatura, la fuente de luz del microscopio, la cámara conectada al microscopio, el amplificador de microelectrodos, el digitalizador y la bomba peristáltica. Si utiliza un sistema de vacío central, abra la válvula de pared para preparar la línea de vacío que extraerá ACSF de la cámara de grabación.
2. Llene el depósito calentado con ACSF, luego coloque un extremo del tubo en el vaso de precipitados de 400 ml que contiene el ACSF burbujeante. Encienda la bomba peristáltica para dirigir acsf desde el vaso de precipitados de 400 ml hasta el depósito calentado, y desde el depósito hacia adelante a la cámara de grabación. Toque o pellizque el tubo para liberar cualquier burbuja atrapada.
3. Ajuste la bomba peristáltica para asegurarse de que el caudal acsf a través de la cámara de grabación es rápido (~ 8-10 mL/min). Utilice una sonda de temperatura para asegurarse de que el ACSF está a 32 °C en el centro de la cámara de grabación.
   NOTA: Si acsf se entrega a la cámara de grabación utilizando una bomba peristáltica, un alto caudal puede resultar en una fluctuación significativa en el caudal. Los caudales constantes se pueden lograr utilizando un amortiguador de pulsación simple que consiste en una serie de jeringas vacías integradas en el tubo (Figura 2).
4. Prepare la estimulación y el registro de pipetas de capilares de vidrio borosilicato utilizando un extractor de filamento calentado. El protocolo de extracción debe configurarse para producir pipetas con una resistencia de 2-3 MOhm para la estimulación o electrodos de grabación de potencial de campo local.
5. Llene las pipetas de estimulación con pipetas NaCl y LFP de 1 M con ACSF.
6. Sujete brevemente el tubo y apague la bomba para pausar el flujo de ACSF. Transfiera una rebanada a la cámara de grabación usando fórceps finos para agarrar una esquina del papel de la lente que la rebanada está descansando en la rebanada se pegará al papel de la lente. Coloque el papel de la lente y corte en la cámara de grabación con la rebanada hacia abajo, luego "pele" el papel de la lente dejando la rebanada sumergida en la cámara de grabación. Asegure el corte usando un arpa.
   NOTA: Las arpas se pueden comprar prefamente o hacer en el laboratorio utilizando una pieza en forma de U de acero inoxidable o platino y filamento de nylon fino.
7. Coloque una pipeta de estimulación rellena de NaCl en el micromanipulador manual y avance lentamente la punta de la pipeta en la superficie de la rebanada (por ejemplo, en la capa de estrato radiatum) en un ángulo de aproximadamente 30-45°. Una vez que la punta de la pipeta entre en el tejido, avance la pipeta hacia adelante lentamente y abstenerse de grandes movimientos en la dirección lateral o vertical que podrían dañar innecesariamente los axones dentro de la rebanada. Coloque la punta de la pipeta al menos 50-100 μm de profundidad en la rebanada para evitar células cercanas a la superficie que se dañaron durante el corte.
8. Coloque una pipeta LFP llena de ACSF en el soporte de pipeta conectado al micromanipulador motorizado. Aplique una presión positiva muy ligera utilizando la presión de la boca o una jeringa de 1 ml conectada a través de una válvula stopcock y una corta longitud de tubo al soporte de la pipeta.
   NOTA: Coloque las pipetas LFP dentro de la rebanada para registrar las señales de interés: en el caso de ondas de onda aguda, se debe colocar una pipeta LFP en el estrato piramidal (SP) y una segunda pipeta en el estrato radiatum (SR). Esta configuración permite grabaciones simultáneas de la onda afilada negativa en el SR y la oscilación de ondulación de alta frecuencia en el SP (Figura 3).
9. El uso del micromanipulador avanza lentamente la punta de la pipeta LFP hacia la región de interés (por ejemplo, la capa de células piramidales CA1) en un ángulo de aproximadamente 30-45°. Coloque la punta de la pipeta al menos 50-100 μm de profundidad en la rebanada para evitar células cercanas a la superficie que se dañaron durante el corte. Mientras avanza la pipeta LFP, entregue continuamente un pequeño pulso de prueba de voltaje utilizando el software de adquisición y esté atento a un aumento repentino de la resistencia a los electrodos. Esto puede indicar que la pipeta ha sido obstruida o presionada contra una célula.
10. Una vez que la pipeta LFP se coloca en la región de interés, libere cuidadosamente la presión positiva abriendo la válvula en el tubo conectado al soporte de pipeta.
11. Para grabar la LFP en una segunda ubicación simultáneamente, repita los pasos 6.8–6.10 con una segunda pipeta y micromanipulador.
12. Utilice el amplificador de microelectrodo en la configuración de abrazadera actual para registrar la actividad espontánea en el potencial de campo local después de utilizar la función de equilibrio de puente en el software de adquisición para corregir la resistencia en serie de la pipeta. Los SWR espontáneos aparecerán como desviaciones positivas en el potencial extracelular de la capa SP (Figura 3).
13. Con el fin de registrar potenciales de campo evocados, utilice los estimuladores conectados al digitalizador para entregar un pulso de voltaje cuadrado corto (200 nosotros) a través de la pipeta de estimulación llena de NaCl. Ajuste el dial de voltaje de estimulación para evocar una gama de amplitudes de respuesta.

Resultados

Aquí se presentan grabaciones representativas de sectores HEC preparados como se describe en este protocolo. Después de la recuperación en una cámara de retención de interfaz (Figura 1C), los sectores se transfieren individualmente a una cámara de grabación sumergida (Figura 2B). La cámara de grabación se suministra con ACSF saturado de carbógeno utilizando una bomba peristáltica(Figura 2A). La bomba primero extrae ACSF d...

Discusión

Hay varios pasos en este protocolo de corte diseñado para promover la salud de los tejidos y favorecer la aparición de la actividad espontánea de la red naturalista: el ratón se perfunde transcardialmente con solución de corte de sacarosa refrigerada; las rodajas de corteza horizontal-entorrinaal (HEC) se cortan a un espesor de 450 μm del hipocampo intermedio o ventral; las rodajas se recuperan en la interfaz de acsf calentado y aire humidificado, rico en carbohidratos; durante las grabaciones, las rodajas se sobre...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	Lulzbot	LulzBot TAZ 6
Acute brain slice incubation holder	NIH 3D Print Exchange	3DPX-001623	Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma Aldrich	A9187-500MG
Ag-Cl ground pellets	Warner	64-1309, (E205)
agar	Becton, Dickinson	214530-500g
ascorbic acid	Alfa Aesar	36237
beaker (250 mL)	Kimax	14000-250
beaker (400 mL)	Kimax	14000-400
biocytin	Sigma Aldrich	B4261
blender	Oster	BRLY07-B00-NP0
Bonn scissors, small	becton, Dickinson	14184-09
borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)	Sutter Instruments	BF150-86-10HP	Fire polished capillaries are preferable.
calcium chloride solution (1 M)	G-Biosciences	R040
camera	Olympus	OLY-150
compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)	Airgas	X02OX95C2003102
compressed oxygen	Airgas	OX 200
constant voltage isolated stimulator	Digitimer Ltd.	DS2A-Mk.II
coverslips (22x50 mm)	VWR	16004-314
cyanoacrylate adhesive	Krazy Glue	KG925	Ideally use the brush-on form for precision
data acquisition software	Axograph	N/A	Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.
Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop	Dell	N/A	Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.
Digidata 1440A	Molecular Devices	1-2950-0367
digital timer	VWR	62344-641	4-channel Traceable timer
disposable absorbant pads	VWR	56616-018
dissector scissors	Fine Science Tools	14082-09
double-edge razor blades	Personna	BP9020
dual automatic temperature controller	Warner Instrument Corporation	TC-344B
dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber	N/A	N/A	The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.
equipment rack	Automate Scientific	FR-EQ70"	A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology
Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	324626-25GM
filter paper	Whatman	1004 070
fine scale	Mettler Toledo	XS204DR
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
glass petri dish (100 x 15 mm)	Corning	3160-101
glucose	Fisher Scientific	D16-1
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma Aldrich	G8877-250MG
ice buckets	Sigma Aldrich	BAM168072002-1EA
isoflurane vaporizer	General Anesthetic Services	Tec 3
lab tape	Fisher Scientific	15-901-10R
lens paper	Fisher Scientific	11-996
light source	Olympus	TH4-100
magnesium chloride solution (1 M)	Quality Biological	351-033-721EA
magnetic stir bars	Fisher Scientific	14-513-56	Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.
micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-5
micromanipulator (manual)	Scientifica	LBM-2000-00
microscope	Olympus	BX51WI
microspatula	Fine Science Tools	10089-11
monitor	Dell	2007FPb
MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier	Molecular Devices	MULTICLAMP 700B	The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)	Sigma Aldrich	H3375-25G
needle (20 gauge, 1.5 in length)	Becton, Dickinson	305176
nylon filament	YLI Wonder Invisible Thread	212-15-004	size 0.004. This cat. # is from Amazon.com
nylon mesh	Warner Instruments Corporation	64-0198
perstaltic pump	Harvard Apparatus	70-2027
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma Aldrich	P1937-1G
pipette holders	Molecular Devices	1-HL-U
platinum wire	World Precision	PT0203
polylactic acid (PLA) filament	Ultimaker	RAL 9010
potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911-500G
potassium gluconate	Sigma Aldrich	1550001-200MG
potassium hydroxide	Sigma Aldrich	60377-1KG
razor blades	VWR	55411-050
roller clamp	World Precision Instruments	14041
scale	Mettler Toledo	PM2000
scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
slice harp	Warner	SHD-26GH/2
sodium bicarbonate	Fisher Chemical	S233-500
sodium chloride	Sigma Aldrich	S9888-1KG
sodium phosphate monobasic anhydrous	Fisher Chemical	S369-500
sodium pyruvate	Fisher Chemical	BP356-100
spatula	VWR	82027-520
spatula/spoon, large	VWR	470149-442
sterile scalpel blades	Feather	72044-10
stirrer / hot plate	Corning	6795-220
stopcock valves, 1-way	World Precision Instruments	14054
stopcock valves, 3-way	World Precision Instruments	14036
sucrose	Acros Organics	AC177142500
support for swivel clamps	Fisher Scientific	14-679Q
surgical scissors, sharp/blunt	Fine Science Tools	14001-12
syringe (1 mL)	Becton, Dickinson	309659
syringe (60 mL with Luer-Lok tip)	Becton, Dickinson	309653
three-pronged clamp	Fisher Scientific	05-769-8Q
tissue forceps, large	Fine Science Tools	11021-15
tissue forceps, small	Fine Science Tools	11023-10
transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
tubing	Tygon	E-3603	ID 1/16 inch, OD 3/16 inch
tubing	Tygon	R-3603	ID 1/8 inch, OD 1/4 inch
vacuum grease	Dow Corning	14-635-5D
vibrating blade microtome	Leica	VT 1200S
vibration-dampening table with faraday cage	Micro-G / TMC-ametek	2536-516-4-30PE
volumetric flask (1 L)	Kimax	KIM-28014-1000
volumetric flask (2 L)	PYREX	65640-2000
warm water bath	VWR	1209