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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von horizontalen Hippocampus-entorhinalen Kortex-Scheiben (HEC) von Mäusen, die eine spontane scharfe Wellenwelligkeit saufen. Slices werden in einer vereinfachten Grenzraum-Haltekammer inkubiert und Aufnahmen werden unter getauchten Bedingungen mit schnell fließender künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit durchgeführt, um die Sauerstoffversorgung des Gewebes und die spontane Entstehung von Netzwerkaktivität zu fördern.

Zusammenfassung

Akutes Nagetier-Gehirnschneiden bietet einen belastbaren experimentellen Ansatz, um Einblicke in die Organisation und Funktion neuronaler Schaltkreise mit einzelliger Auflösung mittels Elektrophysiologie, Mikroskopie und Pharmakologie zu gewinnen. Ein wichtiger Aspekt bei der Gestaltung von In-vitro-Experimenten ist jedoch das Ausmaß, in dem verschiedene Scheibenpräparate naturalistische Muster der neuronalen Aktivität rekapitulieren, wie sie in vivo beobachtet werden. Im intakten Gehirn erzeugt das Hippocampus-Netzwerk eine hochsynchronisierte Populationsaktivität, die den Verhaltenszustand des Tieres reflektiert, wie die scharfwelligen Wellenkomplexe (SWRs) am Beispiel der scharfwelligen Wellenkomplexe (SWRs) am Beispiel des Aufwachens oder des Nicht-REM-Schlafs. SWRs und andere Formen der Netzwerkaktivität können unter geeigneten Bedingungen spontan in isolierten Hippocampusscheiben entstehen. Um das leistungsstarke Gehirn-Slice-Toolkit auf die Untersuchung der Hippocampus-Netzwerkaktivität anzuwenden, ist es notwendig, einen Ansatz zu nutzen, der die Gewebegesundheit und die Erhaltung der funktionellen Konnektivität innerhalb des Hippocampus-Netzwerks optimiert. Mäuse werden transkardial mit kalter, auf Saccharose basierender künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit durchlässig. Horizontale Scheiben, die den Hippocampus enthalten, werden mit einer Dicke von 450 m geschnitten, um die synaptische Konnektivität zu erhalten. Slices werden in einer Kammer im Interface-Stil wiederhergestellt und für Aufnahmen in eine untergetauchte Kammer übertragen. Die Aufnahmekammer ist für die doppelte Oberflächensuperfusion von künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit bei hoher Durchflussrate ausgelegt, um die Sauerstoffversorgung der Scheibe zu verbessern. Dieses Protokoll liefert gesundes Gewebe, das für die Untersuchung komplexer und spontaner Netzwerkaktivitäten in vitrogeeignet ist.

Einleitung

Die elektrophysiologische Messung von lebenden Hippocampusscheiben in vitro ist ein kraftvoller experimenteller Ansatz mit zahlreichen Vorteilen. Der Experimentator kann ein Mikroskop, Mikromanipulatoren und ein Aufzeichnungssystem verwenden, um Messungen von einzelnen Neuronen im Gewebe direkt zu visualisieren und zu sammeln. Gewebescheiben sind auch sehr zugänglich für Photostimulation oder Arzneimittelabgabe für optogenetische, chemogenetische oder pharmakologische Experimente.

Das Hippocampus-Netzwerk erzeugt eine hochsynchrone Populationsaktivität in vivo, sichtbar als Schwingungen im extrazellulären lokalen Feldpotential1,2,3,4,5. Gehirn-Slice-Methoden wurden genutzt, um Einblicke in die zellulären und Schaltkreis-Mechanismen zu gewinnen, die diesen neuronalen Netzwerk-Oszillationen zugrunde liegen. Grundlagenarbeiten von Maier et al. zeigten, dass scharfe Wellenwellenkomplexe (SWRs) spontan in Scheiben des ventralen Hippocampus entstehen können6,7. Nachfolgende Studien von mehreren Forschern haben nach und nach viele Aspekte von SWRs aufgeklärt, einschließlich der Rolle von Neuromodulatoren bei der Regulierung des Netzwerkzustandes des Hippocampus8,9,10 und der synaptischen Mechanismen, die die In-vitro-Reaktivierung neuronaler Ensembles vorantreiben, die zuvor während des Verhaltens in vivo11aktiv waren. Hirn-Scheibenexperimente haben auch Einblick in die Gamma-Bereichs-Oszillation (30–100 Hz) gegeben, einen ausgeprägten Hippocampus-Netzwerkzustand, von dem angenommen wird, dass er die Speichercodierung und den Rückrufvon 12,13unterstützt. Schließlich haben Forscher, um die zentrale Rolle des Hippocampus und der damit verbundenen Strukturen in der Pathophysiologie der temporalen Lappenepilepsie14,15zu erkennen, Hippocampus-Scheibenpräparate verwendet, um die Erzeugung und Ausbreitung von epiptiformer Aktivität zu untersuchen. Carter et al. zeigten, dass kombinierte hippocampal-entorhinale Kortexscheiben, die von chronisch epileptischen Tieren hergestellt werden, spontan epileptische Einleitungen in vitro16erzeugen können. Anschließend untersuchten die Mittel, die den epileptiforformen Entladungen in Hippocampus-Scheiben zugrunde liegen, die Mechanismen, die den Epileptenableitungen zugrunde liegen, unter Verwendung modifizierter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) mit veränderten Ionenkonzentrationen (reduziert mg2+ oder erhöhte K+) oder zugesetzten Medikamenten (4AP oder Gabazin)17.

Die Forscher haben zahlreiche Hippocampus-Scheibenansätze entwickelt, die sich in schlüsselweisen Unterscheiden: (1) die Region des Hippocampus, die in der Scheibe enthalten ist (dorsal, mittel- oder ventral); (2) das Vorhandensein oder Fehlen von extrahippocampalen Geweben wie dem entorhinalen Kortex; (3) die Ausrichtung, die zum Schneiden von Scheiben (koronal, sagittal, horizontal oder schräg) verwendet wird; und (4) die Bedingungen, unter denen das Gewebe nach dem Schneiden gehalten wird (vollständig in ACSF getaucht oder an der Schnittstelle von ACSF und befeuchteter, autobogenreicher Luft gehalten).

Die Wahl des zu verwendenden Schneidansatzes sollte durch das Versuchsziel bestimmt werden. Zum Beispiel wurden quer- oder koronale Scheiben des dorsalen Hippocampus, die unter getauchten Bedingungen gepflegt werden, sehr effektiv für die Untersuchung von intrahippocampalen Schaltkreisen und synaptischer Plastizität18,19,20verwendet. Solche Präparate erzeugen jedoch nicht spontan Netzwerkschwingungen, so leicht wie Scheiben aus dem ventralen Hippocampus21,22,23. Obwohl ein Zustand anhaltender SWR-Aktivität durch tetanische Stimulation in Querscheiben aus dem dorsalen und ventralen Hippocampus24induziert werden kann, werden spontane SWRs leichter in ventralen Scheiben7,25beobachtet.

Eine inhärente physiologische und anatomische Unterscheidung zwischen dem dorsalen und ventralen Hippocampus wird durch Studien unterstützt, die sowohl in vivo als auch in vitrodurchgeführt werden26. Aufnahmen bei Ratten zeigten stark kohärente Theta-Rhythmen im dorsalen und mittleren Hippocampus, aber eine schlechte Kohärenz zwischen der ventralen Region und dem Rest des Hippocampus27. SWRs in vivo vermehren sich leicht zwischen dem dorsalen und mittleren Hippocampus, während SWRs, die ihren Ursprung im ventralen Hippocampus haben, oft lokal bleiben28. Die Assoziationsprojektionen, die von CA3-Pyramidenneuronen stammen, die sich im dorsalen und mittleren Hippocampus befinden, projizieren große Entfernungen entlang der Längsachse des Hippocampus. CA3-Projektionen aus ventralen Regionen bleiben relativ lokal und werden daher während des Schneidprozesses weniger wahrscheinlich durchtrennt29,30. Ventralslices können daher das wiederkehrende Netzwerk, das zur Erzeugung von Populationssynchronität erforderlich ist, besser erhalten. Die Neigung von ventralen Scheiben, spontane Netzwerkaktivitäten in vitro zu erzeugen, kann auch eine höhere intrinsische Erregbarkeit von pyramidenförmigen Neuronen oder eine schwächere GABAerge Hemmung im ventralen Hippocampus im Vergleich zu mehr dorsalen Regionen widerspiegeln31. Tatsächlich sind ventrale Hippocampusscheiben anfälliger für epilepptrime Aktivität32,33. So haben viele Studien der spontanen physiologischen8,9,11,24 oder pathologischen16,34,35,36 Netzwerkschwingungen traditionell einen horizontalen Schneidansatz verwendet, manchmal mit einem leichten Winkel in fronto-okzipitaler Richtung, der Gewebescheiben parallel zur Querebene des ventralen Hippocampus ergibt.

Die Netzwerkkonnektivität wird durch das Schneidverfahren unweigerlich beeinträchtigt, da viele Zellen im Slice getrennt werden. Der Winkel und die Dicke der Scheibe und das in der Zubereitung zurückgehaltene Gewebe sollten berücksichtigt werden, um die Konnektivität in den von Interesse interessierten Schaltkreisen zu optimieren. Viele Studien haben horizontale kombinierte Hippocampus-entorhinale Kortexscheiben (HEC) verwendet, um Wechselwirkungen zwischen den beiden Strukturen im Kontext physiologischer oder pathologischer Netzwerkschwingungen zu untersuchen. Roth et al. führten zwei Aufnahmen aus dem CA1-Unterfeld des Hippocampus und der Schicht V des medialen entorhinalen Kortex durch, um die Ausbreitung der SWR-Aktivität durch die HEC-Scheibe37zu demonstrieren. Viele Studien der epileppitischen Aktivität haben die HEC-Scheibenpräparation verwendet, um zu untersuchen, wie sich epileptische Entladungen durch das kortikohippocampale Netzwerk16,35,36,38ausbreiten. Es ist wichtig zu beachten, dass die Erhaltung der intakten Kortokhippocampalschleife keine Voraussetzung für spontane SWRs, epileptiforme Entladungen oder Gamma-Oszillationen ist; Netzwerkschwingungen können in Querscheiben des dorsalen oder ventralen Hippocampus ohne angehängte parahippocampale Gewebe21,22,23, 25,39,40,41erzeugt werden. Ein wichtigerer Faktor für die spontane Erzeugung von Netzwerkschwingungen in Hippocampus-Scheiben kann die Dicke jeder Scheibe sein, da eine dickere Scheibe (400–550 m) mehr Konnektivität im wiederkehrenden CA2/CA3-Netzwerk21,22,25erhalten wird.

Obwohl abgewinkelte horizontale HEC-Scheiben (mit einem ca. 12° Winkel in Front-Okzipital-Richtung geschnitten) verwendet wurden, um die funktionelle Konnektivität der Kortikohippocampal-Schleife11,16,34,35,42, solche abgewinkelten Präparate sind nicht erforderlich für spontane Netzwerkaktivität43,44,45. Die Verwendung einer abgewinkelten Schnittebene ermöglicht es dem Prüfer jedoch, selektiv Scheiben herzustellen, die die quer ausgerichtete Lamellen des ventralen oder mittleren Hippocampus am besten erhalten, je nachdem, ob ein Abwärts- oder ein Aufwärtswinkel angewendet wird (Abbildung 1). Dieser Ansatz ähnelt konzeptionell dem von Papatheodoropoulos et al., 2002, der jeden Hippocampus frei sezierte und dann einen Gewebechopper verwendete, um Querscheiben entlang der gesamten dorsal-ventralen Achse21zu erstellen. Angesichts der oben genannten funktionellen Unterscheidungen zwischen dem ventralen und dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus sollten die Forscher den anatomischen Ursprung von Scheiben bei der Gestaltung von Experimenten oder bei der Interpretation von Ergebnissen berücksichtigen. Die Verwendung einer Agarrampe während des Schneidvorgangs ist eine einfache Möglichkeit, bevorzugt Scheiben aus dem mittleren oder ventralen Hippocampus herzustellen.

Hippocampalscheiben können entweder in einer untergetauchten Kammer (mit vollständig empfänglichem Gewebe in ACSF) oder in einer Kammer im Interface-Stil (z. B. Oslo- oder Haas-Kammer, mit Scheiben, die nur von einem dünnen Film fließender Medien bedeckt sind) aufbewahrt werden. Die Schnittstellenpflege verbessert die Sauerstoffversorgung des Gewebes, was das neuronale Überleben fördert und eine anhaltend hohe intereuronale Aktivität ermöglicht. Traditionell verwenden die Bedingungen für die untergetauchte Aufzeichnung eine langsamere ACSF-Durchflussrate, die keine ausreichende Gewebesauerstoffversorgung für eine stabile Expression von Netzwerk-Level-Oszillationen bietet. In untergetauchten Hippocampusscheiben werden Carbachol-induzierte Gamma-Oszillationen nur vorübergehend46,47beobachtet, während sie in Schnittstellenaufnahmekammern10,48,49stabil gehalten werden können. Als solche haben sich viele Studien komplexer spontaner Aktivität in vitro auf Schnittstellenaufzeichnungskammern verlassen, um scharfwellige Wellenkomplexe6,7,8,9,10,25,37, Gamma-Oszillationen10,13und epileptiforme Aktivität16,38,45,47zu untersuchen.

In einer Aufnahmekammer im Untergetauchtstil kann ein Tauchmikroskopobjektiv verwendet werden, um einzelne Zellen zu visualisieren und gezielt gesund aussehende Zellen für Aufnahmen zu zielen. Das untergetauchte Präparat ermöglicht auch eine feine Kontrolle über das zelluläre Milieu, da das Tauchen eine schnelle Diffusion von Medikamenten oder anderen Verbindungen in das Gewebe erleichtert. Eine modifizierte Methodik, bei der stabile Netzwerkschwingungen unter unter Getauchtbedingungen aufrechterhalten werden, stellt somit einen starken experimentellen Ansatz dar. Ein Beispiel für diesen Ansatz ist die Arbeit von H.jos et al., bei der sich Hippocampusscheiben in einer vereinfachten Haltekammer im Grenzflächenstil für mehrere Stunden erholen, bevor sie in eine modifizierte Unterbrennkammer mit einer hohen Durchflussrate von ACSF (ca. 6 ml/min) übertragen werden, um die Sauerstoffversorgung des Gewebes zu verbessern12,48,49. Unter diesen Bedingungen können in einer untergetauchten Aufnahmekammer ein hohes Niveau der interneuronen Aktivität und stabile spontane Netzwerkschwingungen aufrechterhalten werden. Dieser modifizierte Ansatz ermöglicht es den Forschern, visuell geführte Ganzzell-Patchklemmenaufzeichnungen durchzuführen und den Beitrag morphologisch identifizierter Zelltypen zu Carbachol-induzierten Gammaoszillationen12zu charakterisieren. SWRs können auch spontan in untergetauchten Hippocampus-Scheiben mit einer schnellen Durchflussrate von ACSF11,48,49auftreten. Maier et al. zeigten, dass Hippocampus-Scheiben, die sich vor der Übertragung in eine untergetauchte Aufnahmekammer in einer Grenzkammer erholten, zuverlässig spontane SWRs zeigten, während Scheiben, die sich vor der Übertragung in eine untergetauchte Aufnahmekammer in ein Becherglas zurückzogen, kleinere evokierte Feldreaktionen, niedrigere Konzentrationen spontaner synaptischer Ströme zeigten und nur sehr selten spontane SWRs43zeigten. Schlingloff et al. nutzten diese verbesserte Methodik, um die Rolle von parvalbumin-exezierenden Korbzellen bei der Erzeugung spontaner WW44zu demonstrieren.

Das folgende Protokoll stellt eine Schneidmethode vor, mit der spontan aktive Neuronen in horizontalen Hippocampusscheiben unter Schnittstellenbedingungen zurückgewonnen und anschließend in einer untergetauchten Aufnahmekammer aufbewahrt werden können, die für pharmakologische oder optogenetische Manipulationen und visuell geführte Aufnahmen geeignet ist.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Columbia University (AC-AAAU9451) genehmigt.

1. Vorbereiten von Lösungen

  1. Herstellung der Saccharoseschneidlösung zum Schneiden, wie in Tabelle 1beschrieben.
    HINWEIS: Nach der Zubereitung von 1 L Saccharoselösung eine kleine Menge (ca. 100–200 ml) in einer Eisschale einfrieren. Diese gefrorenen Saccharosewürfel werden zu einer eisigen Gülle vermischt (siehe Schritt 4.3).
  2. Bereiten Sie künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) für die Aufzeichnung vor, wie in Tabelle 2beschrieben.
  3. Bereiten Sie 1 M NaCl für Stimulationspipetten vor, indem Sie 0,05844 g NaCl in 1 ml gereinigtem Wasser auflösen, das gefiltert wurde, um Spurenmetalle und andere Verunreinigungen zu entfernen.
    HINWEIS: Saccharose-Schneidlösung und ACSF sollten für jedes Experiment frisch vorbereitet werden.

2. Bereiten Sie Agar Rampe

  1. Bereiten Sie 4% Agar (z. B. 2 g Agar in 50 ml Wasser) durch Auflösen von Agarpulver in gereinigtes Wasser vor, das gefiltert wurde, um Spurenmetalle und andere Verunreinigungen zu entfernen. Erhitzen Sie das Gemisch in einer Mikrowelle, bis es gerade zu kochen beginnt (ca. 30-60 s). Gießen Sie den geschmolzenen Agar in eine Form und lassen Sie ihn abkühlen und erstarren bei 4 °C im Kühlschrank bei einer Causa ca. 12° Steigung.
    HINWEIS: Für eine Form kann man jedes Glas- oder Kunststoffbehälter in einem Winkel verwenden, mit genügend geschmolzenem Agar, der zu einer Rampe von 4 cm Länge und ca. 0,8 cm Höhe eingegossen wird.

3. Stufen Sie den Schneidbereich

  1. Füllen Sie einen 400 ml Becher mit einer Scheibenrückgewinnungskammer mit ca. 250 ml ACSF; In ein auf 32 °C erwärmtes Wasserbad stellen und mit Carbogen (95% Sauerstoffgas/5% Kohlendioxidgas) zu sprudeln beginnen.
    HINWEIS: Füllen Sie den Rückgewinnungsbecher mit gerade genug Flüssigkeit, um das Nylongewebe der Haltekammer an der Oberfläche der Lösung zu platzieren, so dass Scheiben an der Schnittstelle des warmen Lösungsgemisches und der Luft gehalten werden (Abbildung 1). Legen Sie kleine Stücke Linsenpapier auf das Nylongewebe. Die Scheiben liegen auf dem Linsenpapier, mit dem später Scheiben einzeln in die Aufnahmekammer übertragen werden können (siehe Schritt 6.6).
  2. Legen Sie einen Kolben mit der Saccharoselösung in einen Eiskübel, um zu kühlen und mit Carbogen zu sprudeln.
    HINWEIS: Die Rückgewinnungsbecher- und Saccharoselösung sollte erwärmt bzw. gekühlt werden, wobei Carbogen mindestens 30 Min. sprudelt, bevor die Maus in die Isoflurankammer gelegt wird.
  3. Ziehen Sie das Tablett mit vorgefertigten, gefrorenen Saccharoselösung Eiswürfel aus dem Gefrierschrank und legen Sie auf der Bank teilweise tauen.
  4. Legen Sie die Hälfte einer sauberen zweischneidigen Rasierklinge in das Mikrotom und kalibrieren Sie sie bei Bedarf. Legen Sie die andere Hälfte der Rasierklinge für den Einsatz während der Zerlegung beiseite.
  5. Führen Sie eine Carbogen-Leitung und Temperatursonde in die Schneidkammer und umgeben Sie mit Eis, um die Kammer zu kühlen.
  6. Bereiten Sie eine saubere Bank oder einen Tisch vor, der mit zwei Einweg-Absorberpads bedeckt ist. Legen Sie alle Sezierwerkzeuge und drei Teile Laborband auf dem linken Pad, wo die transkardiale Perfusion durchgeführt wird.
    HINWEIS: Zu den Dissektionswerkzeugen gehören eine kleine Bonner Schere, eine Dissektorschere, ein großer Spachtel/Löffel, Mikrospatula, Skalpell mit neuer Klinge, Spachtel, scharfe/stumpfe chirurgische Schere, große Gewebezangen und kleine Gewebezangen (siehe Tabelle der Materialien).
  7. Auf dem anderen saugfähigen Pad rechts vom Perfusionsbereich ein kreisförmiges Stück Filterpapier in den Deckel einer Glaspetrischale mit 100 mm Durchmesser legen. Legen Sie den Boden der Petrischale neben den Deckel und legen Sie eine Carbogen-Linie in beide Stücke der Schale.
  8. Verwenden Sie eine Rasierklinge oder Skalpell, um eine kleine Rampe von Agar zu schneiden (ca. 4 cm entlang der abgewinkelten Oberfläche, 0,8 cm in der Höhe, 2 cm in der Breite). Schneiden Sie ein Stück der Rampe vom hohen Ende ab und kehren Sie es um, um einen Hinterbaublock von Agar zu erstellen. Verwenden Sie Cyanoacrylat-Klebstoff, um die Agar-Rampe und den Stützblock an der Schneideplattform zu befestigen und beiseite zu legen.
    HINWEIS: Der Trägerblock von Agar hilft, das Gehirn während des Schneidens zu stabilisieren und bietet eine Oberfläche, auf der unnötige Gewebe von jeder Scheibe abgetrennt werden können (Abbildung 1).

4. Transkardiale Perfusion

  1. Eine 60 ml Tragfähigkeitsspritze als Reservoir für Saccharose-Schneidlösung ca. 18 Zoll über der Tischplatte aufhängen (z. B. mit einer dreizackigen Schwenkklemme an einem vertikalen Pfosten). Befestigen Sie Schläuche an der Unterseite des Reservoirs, führen Sie die Schläuche durch eine Rollenklemme und verbinden Sie das andere Ende des Rohres mit einer sauberen 20 G Nadel.
  2. Füllen Sie das 60 ml Reservoir mit ca. 30 ml gekühlter Saccharoselösung und leiten Sie eine Carbogen-Leitung in das Saccharosereservoir, um die Perfusate kontinuierlich zu sprudeln.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Saccharose ohne eingeschlossene Blasen durch den Schlauch und die Nadel fließt. Die Durchflussmenge sollte gerade schnell genug sein, um einen stetigen, kontinuierlichen Strom von tropfender Saccharose aus der Nadel zu haben.
  3. Mit einem Mixer die gefrorene Saccharose zerkleinern und in eine eisige Gülle mischen und mit dem großen Spachtel/Löffel die Gülle verteilen.
    1. Legen Sie eine kleine Menge Saccharose Gülle um die Ränder des Glases Petri Schale Deckel. Fügen Sie eine kleine Menge Saccharose Gülle auf den Petrischale Boden.
    2. Etwa 20 bis 30 ml Saccharose-Slurry in das Perfusionsflüssigkeitsreservoir geben und gut mit den 30 ml gekühlter Flüssigsaccharose vermischen, bis das Reservoir eine Mischung aus sehr kalter, überwiegend flüssiger Saccharose mit einer Restlösung enthält.
  4. Legen Sie die Maus in eine Kammer, die mit einem Isofluran-Verdampfer verbunden ist. Bei einem Sauerstofffluss von ca. 2 l/min drehen Sie das Zifferblatt des Verdampfers, um Isofluran in 5% Konzentration zu liefern, und starten Sie einen Timer.
    HINWEIS: Halten Sie diesen Timer während des Verlaufs des Schneidens unterwegs, um zu messen, wie schnell die Slices erhalten werden. Das Verfahren sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, so dass das Schneiden abgeschlossen ist und sich das Gewebe in der Grenzkammer innerhalb von 15–20 min des Tieres erholt, das in die Isoflurankammer eintritt. Beobachten Sie die Maus, um sicherzustellen, dass ein Zustand der tiefen Anästhesie erreicht wird. Nach mindestens 5 min sollte die Maus tief beästhetisiert sein und nicht auf Zehenkneifen reagieren.
  5. Unmittelbar vor dem Entfernen der Maus aus der Isoflurankammer den Petrischalendeckel mit gekühlter Saccharoselösung bis zu einer Tiefe von ca. 3–5 mm füllen und den Petrischalenboden mit gekühlter Saccharoselösung bis zu einer Tiefe von ca. 1,0 cm füllen.
  6. Übertragen Sie die Maus schnell auf das linke saugfähige Pad und verwenden Sie die 3 Stück Klebeband, um die Vorderbeine und den Schwanz zu sichern. Führen Sie eine Hinterbder Zehenklemme durch, um sicherzustellen, dass die Maus nicht reagiert, bevor ein Schnitt durchgeführt wird. Mit den großen TissueZangen und chirurgischen Scheren, Zelt die Haut und machen längs Schnitt von der Unterseite des Brustbeins bis zur Oberseite der Brust. Mit den Zangen ziehen Sie auf das Brustbein und verwenden Sie die Schere, um durch die Membran zu schneiden.
    HINWEIS: Die anfängliche Positionierung der Maus und zuerst mehrere Einschnitte, um das Zwerchfell zu trennen, sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Maus das Bewusstsein nicht wiedererlangt. Um eine ausreichende Tiefe der Anästhesie während des gesamten Verfahrens zu gewährleisten, kann ein Nasenkegel auf die Maus gelegt werden, um Isofluran während der Perfusion zu liefern.
  7. Verwenden Sie die Schere, um den Rippenkäfig auf jeder Seite zu schneiden, schneiden Sie in einer großen Bewegung in Richtung der Stelle, wo die Vorderbeine trifft den Körper. Mit der Zange, schwingen Sie die Vorderseite des Rippenkäfigs weg und nach oben zum Kopf, und entfernen Sie es dann vollständig mit einem horizontalen Schnitt mit der großen Schere. Halten Sie das Herz mit den großen Zangen an Ort und Stelle und setzen Sie die 20 G Perfusionsnadel in den linken Ventrikel ein. Sobald die Nadel richtig positioniert ist, sollte die linke Seite des Herzens schnell verblassen, da gekühlte Saccharoselösung den Ventrikel füllt.
  8. Verwenden Sie die kleine Dissektorschere, um in das rechte Atrium zu schneiden und das Blut aus dem Kreislaufsystem fließen zu lassen. Wenn die Schnitte richtig durchgeführt werden, sollte es minimale Schäden am Herzen geben, und es sollte weiterhin während der Durchblutung pumpen.
    HINWEIS: Aufgerollte Teile von Tissuepapier können verwendet werden, um Blut und Saccharoselösung aus dem Herzen zu leiten und die Sichtbarkeit der Perfusionsnadel während des Eingriffs zu erhalten.
  9. Stellen Sie sicher, dass die Perfusionsnadel an Ort und Stelle bleibt und nicht aus dem linken Ventrikel fällt. Mit einer richtigen Durchflussrate und Platzierung beginnt die Leber mit 20–30 s zu einer leichten Bräune/Beigefarbe zu verblassen.
  10. Nach 30–45 s verwenden Sie die große Schere, um die Maus zu enthaupten. Halten Sie den Kopf in der linken Hand, schieben oder schälen Sie die Haut weg vom Schädel. Bei einem gut durchbluteten Tier sollte der Schädel sehr blass sein, und das Gehirn sollte eine sehr hellrosa Farbe (anweißen) durch den Schädel ohne gut sichtbare Blutgefäße erscheinen.

5. Extrahieren Sie das Gehirn und schneiden Sie Scheiben

  1. Mit der kleinen Bonner Schere machen Sie zwei seitliche Schnitte durch den Schädel in Richtung der Mittellinie an der Vorderseite des Schädels, in der Nähe der Augen. Machen Sie zwei zusätzliche Schnitte auf beiden Seiten der Basis des Schädels.
  2. Übertragen Sie den Kopf auf den Boden der Glas Petrischale, wo sie meist in gekühlte Saccharoselösung getaucht werden sollte. Verwenden Sie die kleine Bonner Schere, um die Mittellinie entlang der Schädellänge zu schneiden, indem Sie mit der Schere hochziehen, um Schäden am darunter liegenden Hirngewebe zu minimieren. Mit den kleinen Tissue-Zangen, fest greifen jede Seite des Schädels und schwingen Sie es auf und weg vom Gehirn, wie ein Buch zu öffnen.
  3. Verwenden Sie die Finger der linken Hand, um die Schädelklappen offen zu halten und setzen Sie die Mikrospatula unter dem Gehirn in der Nähe der olfaktorischen Glühbirnen ein. Drehen Sie das Gehirn aus dem Schädel in die Saccharose und verwenden Sie die Mikrospatula, um den Hirnstamm zu trennen. Waschen Sie das Gehirn, um Restblut, Fell oder anderes Gewebe zu entfernen.
  4. Verwenden Sie den großen Spachtel/Löffel, um das Gehirn auf den Deckel der glasigen Petrischale zu übertragen. Mit der anderen Hälfte der zweischneidigen Rasierklinge zuvor beiseite gelegt, machen zwei koronare Schnitte, um zuerst das Kleinhirn und dann den vorderen Teil des Gehirns zu entfernen, einschließlich der olfaktorischen Glühbirnen (Abbildung 1).
  5. Cyanoacrylatkleber auf die Agarrampe auftragen. Legen Sie das Gehirn kurz mit den großen Tissuezangen auf ein Stück trockenes Filterpapier und übertragen Sie es dann sofort auf die Agarrampe, wobei die ventrale Oberfläche des Gehirns auf den Klebstoff aufgebracht wird.
    HINWEIS: Bei Scheiben des mittleren Hippocampus sollte das Gehirn mit dem vorderen Nachhang nach oben und dem Hinterteil näher an der Klinge ausgerichtet sein. Für Scheiben des ventralen Hippocampus, orientieren Sie das Gehirn mit dem vorderen Ende zeigt den Hang der Rampe, mit dem hinteren Ende an der Spitze der Rampe, weiter weg von der Klinge. In beiden Fällen sollte das Gehirn an der Oberseite der Rampe positioniert werden, so dass die koronal geschnittene Oberfläche des Gehirns den Agar-Backing-Block kontaktiert (Abbildung 1).
  6. Die Schneideplattform mit Agar und Gehirn in die Schneidkammer des Mikrotomlegens legen und vollständig mit gekühlter Saccharoselösung eintauchen. Verwenden Sie den großen Spachtel/Löffel, um einige Saccharose-Slurry in die Kammer zu übertragen, unter Rühren, um gefrorene Saccharose zu schmelzen und die Temperatur der Mischung schnell auf 1 bis 2 °C zu senken.
    HINWEIS: Beobachten Sie das Temperaturmessgerät während des gesamten Schneidens. Wenn die Saccharoselösung über 3 °C erwärmt, fügen Sie mehr Gülle hinzu und mischen Sie, um die Temperatur wieder nach unten zu bringen.
  7. Schneiden Sie Scheiben mit einer Dicke von 450 m mit einer Mikrotome-Geschwindigkeit von 0,07 mm/s. Wenn jede Scheibe freigesetzt wird, verwenden Sie die kleinen Gewebezangen und ein scharfes Skalpell, um zuerst die beiden Hemisphären zu trennen und dann Gewebe zu schneiden, bis die Scheibe hauptsächlich aus den Hippocampus- und Parahippocampal-Regionen besteht (Abbildung 1).
  8. Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um die Scheiben einzeln in die Schnittstellenrückgewinnungskammer zu übertragen, um sicherzustellen, dass sie an der Schnittstelle des ACSF und der Luft mit nur einem dünnen Meniskus von ACSF positioniert werden, der die Scheiben bedeckt. Schließen Sie den Deckel der Kammer fest und lassen Sie die Scheiben 30 min bei 32 °C erholen.
  9. Nach der ersten Erholung bei 32 °C die Schnittstellenrückgewinnungskammer aus dem Wasserbad holen und auf einen Rührer aufstellen, der so langsam eingestellt ist, dass der magnetische Rührbalken die Zirkulation von ACSF innerhalb der Kammer fördert. Lassen Sie es nach und nach auf Raumtemperatur abkühlen, wenn sich die Scheiben für weitere 90 min erholen. Stellen Sie sicher, dass die Rückgewinnungskammer ständig mit Carbogen geblasen wird und lassen Sie keine großen Blasen unter den Scheiben einfangen.

6. Führen Sie lokale Feldpotential (LFP) Aufzeichnungen von spontanen Aktivitäten

  1. Bereiten Sie sich auf LFP-Aufnahmen vor, indem Sie alle erforderlichen Geräte einschalten, einschließlich des Computers, auf dem die Erfassungssoftware ausgeführt wird, den mit dem Computer verbundenen Monitor, die Stimulatoren, den Mikromanipulator, den Temperaturregler, die Mikroskop-Lichtquelle, die mit dem Mikroskop befestigte Kamera, den Mikroelektrodenverstärker, den Digitizer und die Peristaltikpumpe. Wenn Sie ein zentrales Vakuumsystem verwenden, öffnen Sie das Wandventil, um die Vakuumleitung vorzubereiten, die ACSF aus der Aufnahmekammer entfernt.
  2. Füllen Sie das beheizte Reservoir mit ACSF, und legen Sie dann ein Ende des Schlauches in den 400 ml Becher mit dem sprudelnden ACSF. Schalten Sie die peristaltische Pumpe ein, um ACSF vom 400-ml-Becher auf das beheizte Reservoir und vom Reservoir weiter in die Aufnahmekammer zu leiten. Tippen oder kneifen Sie die Schläuche, um alle gefangenen Blasen zu lösen.
  3. Stellen Sie die Peristaltikpumpe so ein, dass der ACSF-Durchfluss durch die Aufnahmekammer schnell ist (ca. 8–10 mL/min). Verwenden Sie einen Temperaturfühler, um sicherzustellen, dass der ACSF 32 °C in der Mitte der Aufnahmekammer beträgt.
    HINWEIS: Wenn ACSF mit einer Peristaltikpumpe an die Aufnahmekammer geliefert wird, kann eine hohe Durchflussrate zu einer signifikanten Fluktuation der Durchflussrate führen. Konsistente Durchflussraten können mit einem einfachen Pulsationsdämpfer erreicht werden, der aus einer Reihe von leeren Spritzen besteht, die in den Schlauch integriert sind (Abbildung 2).
  4. Bereiten Sie Stimulations- und Aufzeichnungspipetten aus Borosilikatglaskapillaren mit einem beheizten Filamentzieher vor. Das Puller-Protokoll sollte so konfiguriert werden, dass Pipetten mit einem Widerstand von 2–3 MOhm für Stimulation oder lokale Feldpotenzial-Aufzeichnungselektroden erhalten werden.
  5. Füllen Sie Stimulationspipetten mit 1 M NaCl und LFP Pipetten mit ACSF.
  6. Halten Sie die Schläuche kurz ein und schalten Sie die Pumpe aus, um den ACSF-Fluss zu unterbrechen. Übertragen Sie eine Scheibe in die Aufnahmekammer mit feinen Zangen, um eine Ecke des Linsenpapiers zu greifen, das die Scheibe auf dem Linsenpapier ruht, wird auf dem Linsenpapier kleben. Legen Sie das Linsenpapier und schneiden Sie es mit der Scheibe nach unten in die Aufnahmekammer, dann "schälen" Sie das Linsenpapier, so dass die Scheibe in der Aufnahmekammer versunken ist. Sichern Sie die Scheibe mit einer Harfe.
    HINWEIS: Harfen können vorgefertigt oder im Labor mit einem U-förmigen Stück Edelstahl oder Platin und feinem Nylonfilament erworben werden.
  7. Legen Sie eine NaCl-gefüllte Stimulationspipette in den manuellen Mikromanipulator und bringen Sie die Spitze der Pipette langsam in die Oberfläche der Scheibe (z.B. in die Stratum-Radiatum-Schicht) in einem Winkel von ca. 30–45° vor. Sobald die Spitze der Pipette in das Gewebe eindringt, bringen Sie die Pipette langsam nach vorne und verzichten Sie auf große Bewegungen in seitlicher oder vertikaler Richtung, die Axt in der Scheibe unnötig beschädigen könnten. Legen Sie die Spitze der Pipette mindestens 50–100 m tief in die Scheibe, um Zellen in der Nähe der Oberfläche zu vermeiden, die beim Schneiden beschädigt wurden.
  8. Legen Sie eine ACSF-gefüllte LFP-Pipette in den Pipettenhalter, der am motorisierten Mikromanipulator befestigt ist. Wenden Sie einen sehr leichten positiven Druck entweder mit Munddruck oder einer 1 ml Spritze an, die über ein Hahnenventil und eine kurze Schlauchlänge mit dem Pipettenhalter verbunden ist.
    HINWEIS: Positionieren Sie LFP-Pipetten innerhalb der Scheibe, um die Signale von Interesse aufzuzeichnen: Bei scharfen Wellenwellen sollte eine LFP-Pipette in die Stratum pyramidale (SP) und eine zweite Pipette in der Stratum radiatum (SR) platziert werden. Diese Konfiguration ermöglicht gleichzeitige Aufnahmen der negativen Scharfwelle im SR und der Hochfrequenz-Wellenschwingung im SP (Abbildung 3).
  9. Mit dem Mikromanipulator wird die Spitze der LFP-Pipette langsam in den Interessenbereich (z.B. die PYRAMIDalzellschicht CA1) in einem Winkel von ca. 30–45° vorrücken. Legen Sie die Spitze der Pipette mindestens 50–100 m tief in die Scheibe, um Zellen in der Nähe der Oberfläche zu vermeiden, die beim Schneiden beschädigt wurden. Während sie die LFP-Pipette voranbringen, liefern Sie kontinuierlich einen kleinen Spannungstestimpuls mit der Erfassungssoftware und achten Sie auf eine plötzliche Erhöhung des Elektrodenwiderstands. Dies kann darauf hindeuten, dass die Pipette verstopft oder gegen eine Zelle gedrückt wurde.
  10. Sobald die LFP-Pipette im Interessenbereich positioniert ist, lassen Sie den positiven Druck vorsichtig los, indem Sie das Ventil an den Rohren öffnen, die am Pipettenhalter befestigt sind.
  11. Um den LFP gleichzeitig an einer zweiten Position aufzuzeichnen, wiederholen Sie die Schritte 6.8–6.10 mit einer zweiten Pipette und einem Mikromanipulator.
  12. Verwenden Sie den Mikroelektrodenverstärker in der aktuellen Klemmenkonfiguration, um spontane Aktivitäten im lokalen Feldpotenzial aufzuzeichnen, nachdem Sie die Brückenbilanzfunktion in der Erfassungssoftware verwendet haben, um den Serienwiderstand der Pipette zu korrigieren. Spontane SWRs erscheinen als positive Verformungen im extrazellulären Potential der SP-Schicht (Abbildung 3).
  13. Um evozierte Feldpotentiale aufzuzeichnen, verwenden Sie die an den Digitizer angeschlossenen Stimulatoren, um einen kurzen (200 us) quadratischen Spannungsimpuls durch die NaCl-gefüllte Stimulationspipette zu liefern. Passen Sie das Stimulationsspannungsrad an, um eine Reihe von Reaktionsamplituden zu evozieren.

Ergebnisse

Hier werden repräsentative Aufnahmen von HEC-Slices präsentiert, die wie in diesem Protokoll beschrieben vorbereitet werden. Nach der Wiederherstellung in einer Schnittstellenhaltekammer (Abbildung 1C) werden die Scheiben einzeln in eine untergetauchte Aufnahmekammer übertragen (Abbildung 2B). Die Aufnahmekammer wird mit autobogengesättigtem ACSF mit einer peristaltischen Pumpe geliefert (Abbildung 2A). Die Pumpe zieht ACSF zun?...

Diskussion

Es gibt mehrere Schritte in diesem Schneideprotokoll entwickelt, um die Gesundheit des Gewebes zu fördern und die Entstehung von spontanen naturalistischen Netzwerkaktivität zu fördern: die Maus ist transkardial durchlässig mit gekühlten Saccharose Schneiden Lösung; horizontal-entorhinale Kortex-Scheiben (HEC) werden mit einer Dicke von 450 m aus dem mittleren oder ventralen Hippocampus geschnitten; Scheiben erholen sich an der Schnittstelle von erwärmter ACSF und befeuchteter, autobogenreicher Luft; Während der ...

Offenlegungen

Der Autor hat nichts zu verraten.

Danksagungen

Der Autor bedankt sich bei Steve Siegelbaum für die Unterstützung. Die Finanzierung erfolgt durch 5R01NS106983-02 sowie 1 F31 NS113466-01.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
3D printerLulzbotLulzBot TAZ 6
Acute brain slice incubation holderNIH 3D Print Exchange3DPX-001623Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
Adenosine 5′-triphosphate magnesium saltSigma AldrichA9187-500MG
Ag-Cl ground pelletsWarner64-1309, (E205)
agarBecton, Dickinson214530-500g
ascorbic acidAlfa Aesar36237
beaker (250 mL)Kimax14000-250
beaker (400 mL)Kimax14000-400
biocytinSigma AldrichB4261
blenderOsterBRLY07-B00-NP0
Bonn scissors, smallbecton, Dickinson14184-09
borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)Sutter InstrumentsBF150-86-10HPFire polished capillaries are preferable.
calcium chloride solution (1 M)G-BiosciencesR040
cameraOlympusOLY-150
compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)AirgasX02OX95C2003102
compressed oxygenAirgasOX 200
constant voltage isolated stimulatorDigitimer Ltd.DS2A-Mk.II
coverslips (22x50 mm)VWR16004-314
cyanoacrylate adhesiveKrazy GlueKG925Ideally use the brush-on form for precision
data acquisition softwareAxographN/AAny equivalent software (e.g. pClamp) would work.
Dell Precision T1500 Tower Workstation DesktopDellN/ACatalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.
Digidata 1440AMolecular Devices1-2950-0367
digital timerVWR62344-6414-channel Traceable timer
disposable absorbant padsVWR56616-018
dissector scissorsFine Science Tools14082-09
double-edge razor bladesPersonnaBP9020
dual automatic temperature controllerWarner Instrument CorporationTC-344B
dual-surface or laminar-flow optimized recording chamberN/AN/AThe chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.
equipment rackAutomate ScientificFR-EQ70"A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology
Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA)Sigma Aldrich324626-25GM
filter paperWhatman1004 070
fine scaleMettler ToledoXS204DR
Flaming/Brown micropipette pullerSutter InstrumentsP-97
glass petri dish (100 x 15 mm)Corning3160-101
glucoseFisher ScientificD16-1
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrateSigma AldrichG8877-250MG
ice bucketsSigma AldrichBAM168072002-1EA
isoflurane vaporizerGeneral Anesthetic ServicesTec 3
lab tapeFisher Scientific15-901-10R
lens paperFisher Scientific11-996
light sourceOlympusTH4-100
magnesium chloride solution (1 M)Quality Biological351-033-721EA
magnetic stir barsFisher Scientific14-513-56Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.
micromanipulatorLuigs & NeumannSM-5
micromanipulator (manual)ScientificaLBM-2000-00
microscopeOlympusBX51WI
microspatulaFine Science Tools10089-11
monitorDell2007FPb
MultiClamp 700B Microelectrode AmplifierMolecular DevicesMULTICLAMP 700BThe MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)Sigma AldrichH3375-25G
needle (20 gauge, 1.5 in length)Becton, Dickinson305176
nylon filamentYLI Wonder Invisible Thread212-15-004size 0.004. This cat. # is from Amazon.com
nylon meshWarner Instruments Corporation64-0198
perstaltic pumpHarvard Apparatus70-2027
Phosphocreatine di(tris) saltSigma AldrichP1937-1G
pipette holdersMolecular Devices1-HL-U
platinum wireWorld PrecisionPT0203
polylactic acid (PLA) filamentUltimakerRAL 9010
potassium chlorideSigma AldrichP3911-500G
potassium gluconateSigma Aldrich1550001-200MG
potassium hydroxideSigma Aldrich60377-1KG
razor bladesVWR55411-050
roller clampWorld Precision Instruments14041
scaleMettler ToledoPM2000
scalpel handleFine Science Tools10004-13
slice harpWarnerSHD-26GH/2
sodium bicarbonateFisher ChemicalS233-500
sodium chlorideSigma AldrichS9888-1KG
sodium phosphate monobasic anhydrousFisher ChemicalS369-500
sodium pyruvateFisher ChemicalBP356-100
spatulaVWR82027-520
spatula/spoon, largeVWR470149-442
sterile scalpel bladesFeather72044-10
stirrer / hot plateCorning6795-220
stopcock valves, 1-wayWorld Precision Instruments14054
stopcock valves, 3-wayWorld Precision Instruments14036
sucroseAcros OrganicsAC177142500
support for swivel clampsFisher Scientific14-679Q
surgical scissors, sharp/bluntFine Science Tools14001-12
syringe (1 mL)Becton, Dickinson309659
syringe (60 mL with Luer-Lok tip)Becton, Dickinson309653
three-pronged clampFisher Scientific05-769-8Q
tissue forceps, largeFine Science Tools11021-15
tissue forceps, smallFine Science Tools11023-10
transfer pipettesFisher Scientific13-711-7M
tubingTygonE-3603ID 1/16 inch, OD 3/16 inch
tubingTygonR-3603ID 1/8 inch, OD 1/4 inch
vacuum greaseDow Corning14-635-5D
vibrating blade microtomeLeicaVT 1200S
vibration-dampening table with faraday cageMicro-G / TMC-ametek2536-516-4-30PE
volumetric flask (1 L)KimaxKIM-28014-1000
volumetric flask (2 L)PYREX65640-2000
warm water bathVWR1209
 

Referenzen

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