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Résumé

Ce protocole décrit la préparation des tranches horizontales de cortex hippocampal-entorhinal (HEC) des souris présentant l’activité spontanée d’ondulation d’onde forte. Les tranches sont incubées dans une chambre de rétention d’interface simplifiée et les enregistrements sont effectués dans des conditions submergées avec un fluide céphalo-rachidien artificiel à écoulement rapide pour favoriser l’oxygénation des tissus et l’émergence spontanée de l’activité au niveau du réseau.

Résumé

Le tranchage aigu du cerveau des rongeurs offre une approche expérimentale tractable pour mieux comprendre l’organisation et la fonction des circuits neuronaux avec résolution à cellule unique à l’aide d’électrophysiologie, de microscopie et de pharmacologie. Cependant, une considération majeure dans la conception des expériences in vitro est la mesure dans laquelle différentes préparations de tranche récapitulent des modèles naturalistes de l’activité neuronale comme observé in vivo. Dans le cerveau intact, le réseau hippocampal génère une activité de population hautement synchronisée reflétant l’état comportemental de l’animal, comme en illustrent les complexes d’ondulation à ondes vives (SWR) qui se produisent pendant les états de consommation éveillés ou le sommeil non paradoxal. Les DTS et d’autres formes d’activité réseau peuvent émerger spontanément dans des tranches hippocampiques isolées dans des conditions appropriées. Afin d’appliquer la boîte à outils puissante tranche de cerveau à l’étude de l’activité du réseau hippocampal, il est nécessaire d’utiliser une approche qui optimise la santé des tissus et la préservation de la connectivité fonctionnelle au sein du réseau hippocampal. Les souris sont transcardially perfusées avec le fluide céphalo-rachidien artificiel à base de saccharose froid. Les tranches horizontales contenant l’hippocampe sont coupées à une épaisseur de 450 μm pour préserver la connectivité synaptique. Les tranches se rétablissent dans une chambre de style interface et sont transférées dans une chambre submergée pour les enregistrements. La chambre d’enregistrement est conçue pour la superfusion à double surface du liquide céphalo-rachidien artificiel à un débit élevé afin d’améliorer l’oxygénation de la tranche. Ce protocole donne des tissus sains adaptés à l’étude de l’activité réseau complexe et spontanée in vitro.

Introduction

La mesure électrophysiologique à partir de tranches hippocampiques vivantes in vitro est une approche expérimentale puissante avec de nombreux avantages. L’expérimentateur peut utiliser un microscope, des micromanipulateurs et un système d’enregistrement pour visualiser et recueillir directement les mesures des neurones individuels dans le tissu. Les tranches de tissu sont également très accessibles à la photostimulation ou à l’administration de médicaments pour des expériences optogénétiques, chimiogénétiques ou pharmacologiques.

Le réseau hippocampal génère une activité de population hautement synchrone in vivo, visible sous forme d’oscillations dans le potentiel extracellulaire du champ local1,2,3,4,5. Des méthodes de tranche de cerveau ont été leveraged pour obtenir l’aperçu des mécanismes cellulaires et de circuit sous-jacents à ces oscillations neuronales de réseau. Les travaux de base de Maier et coll. ont démontré que des complexes pointus d’ondulation d’onde (SWRs) peuvent émerger spontanément dans des tranches de l’hippocampe ventral6,7. Les études suivantes de plusieurs investigateurs ont graduellement élucidé beaucoup d’aspects des SWRs, y compris le rôle des neuromodulateurs en réglementant l’état de réseau de l’hippocampe8,9,10 et les mécanismes synaptiques qui conduisent la réactivation in vitro des ensembles neuronaux précédemment actifs pendant le comportement in vivo11. Les expériences de tranche de cerveau ont également fourni un aperçu de l’oscillation de gamme gamma (30-100 Hz), un état distinct de réseau hippocampal censé soutenir l’encodage de mémoire et lerappel 12,13. Enfin, reconnaissant le rôle central de l’hippocampe et des structures associées dans la pathophysiologie de l’épilepsie du lobe temporal14,15, les chercheurs ont utilisé des préparations de tranches hippocampiques pour étudier la génération et la propagation de l’activité épileptiforme. Carter et coll. ont démontré que les tranches combinées du cortex hippocampal-entorhinal préparées à partir d’animaux épileptiques chroniques peuvent générer spontanément des décharges épileptiformes in vitro16. Par la suite, Karlócai et coll. ont exploré les mécanismes sous-jacents aux rejets épileptiformes dans les tranches hippocampiques en utilisant du liquide céphalo-rachidien artificiel modifié (ACSF) avec des concentrations d’ion altérées (mg2+ réduit ou K+élevé) ou des médicaments ajoutés (4AP ou gabazine)17.

Les chercheurs ont mis au point de nombreuses approches de tranches hippocampiques qui diffèrent de façon clé : (1) la région de l’hippocampe contenue dans la tranche (dorsale, intermédiaire ou ventrale); (2) la présence ou l’absence de tissus extrahippocampal tels que le cortex entorhinal ; (3) l’orientation utilisée pour couper les tranches (coronale, sagittale, horizontale ou oblique); et (4) les conditions dans lesquelles le tissu est maintenu après le tranchage (immergé entièrement dans l’ACSF ou maintenu à l’interface de l’ACSF et de l’air humidifié et riche en carbogen).

Le choix de l’approche de tranchage à utiliser doit être déterminé par l’objectif expérimental. Par exemple, des tranches transversales ou coronaires de l’hippocampe dorsal maintenus dans des conditions submergées ont été employées très efficacement pour l’étude des circuits intrahippocampal et de la plasticité synaptique18,19,20. Cependant, de telles préparations ne génèrent pas spontanément des oscillations réseau aussi facilement que les tranches de l’hippocampe ventral21,22,23. Bien qu’un état d’activité persistante de SWR puisse être induit par la stimulation tétanos dans les tranches transversales de l’hippocampe dorsal et ventral24,les SWRs spontanés sont plus facilement observés dans les tranches ventrales7,25.

Une distinction physiologique et anatomique inhérente entre l’hippocampe dorsal et ventral est soutenue par des études exécutées in vivo et in vitro26. Les enregistrements chez les rats ont indiqué des rythmes fortement cohérents de theta dans tout l’hippocampe dorsal et intermédiaire, pourtant la cohérence pauvre entre la région ventrale et le reste de l’hippocampe27. Les RSF in vivo se propagent facilement entre l’hippocampe dorsal et intermédiaire, tandis que les RS qui proviennent de l’hippocampe ventral demeurent souventlocaux 28. Les projections associationnelles provenant des neurones pyramidaux CA3 qui résident dans l’hippocampe dorsale et intermédiaire projettent de longues distances le long de l’axe longitudinal de l’hippocampe. Les projections de CA3 provenant de régions ventrales demeurent relativement locales et sont donc moins susceptibles d’être rompues au cours du processus detranchage 29,30. Les tranches ventrales peuvent donc mieux préserver le réseau récurrent nécessaire à la synchronisation de la population. La propension des tranches ventrales à générer des activités spontanées de réseau in vitro peut également refléter une excitabilité intrinsèque plus élevée des neurones pyramidaux ou une inhibition GABAergic plus faible dans l’hippocampe ventral par rapport aux régions plus dorsales31. En effet, les tranches hippocampales ventrales sont plus sensibles à l’activité épileptiforme32,33. Ainsi, de nombreuses études sur les oscillations physiologiquesspontanées 8,9,11,24 ou pathologiques16,34,35,36 oscillations réseau ont traditionnellement utilisé une approche horizontale de tranchage, parfois avec un léger angle dans la direction fronto-occipitale, qui donne des tranches de tissu parallèles au plan transversal de l’hippocampe ventral.

La connectivité réseau est inévitablement affectée par la procédure de tranchage car de nombreuses cellules de la tranche seront coupées. L’angle et l’épaisseur de la tranche et du tissu conservés dans la préparation doivent être considérés comme optimisant la connectivité dans les circuits d’intérêt. De nombreuses études ont utilisé des tranches horizontales combinées du cortex hippocampal-entorhinal (HEC) pour explorer les interactions entre les deux structures dans le contexte d’oscillations physiologiques ou pathologiques du réseau. Roth et coll. ont effectué des enregistrements doubles à partir du sous-champ CA1 de l’hippocampe et de la couche V du cortex entorhinal médial pour démontrer la propagation de l’activité swr par la trancheHEC 37. Beaucoup d’études de l’activité épileptiforme ont employé la préparation de tranche de HEC pour étudier comment les décharges épileptiformes propagent par le réseau corticohippocampal16,35,36,38. Il est important de noter que la conservation de la boucle corticohippocampal intacte n’est pas une condition préalable pour des SWRs spontanés, des décharges épileptiformes, ou des oscillations gamma ; les oscillations réseau peuvent être générées en tranches transversales de l’hippocampe dorsal ou ventral sans tissus parahippocampal attachés21,22,23, 25,39,40,41. Un facteur plus important pour la génération spontanée d’oscillations réseau en tranches hippocampiques peut être l’épaisseur de chaque tranche, car une tranche plus épaisse (400-550 μm) préservera plus de connectivité dans le réseau récurrent CA2/CA321,22,25.

Bien que des tranches horizontales inclinées de HEC (coupées avec un angle d’approximativement 12° dans la direction fronto-occipital) aient été employées pour étudier la connectivité fonctionnelle de la boucle corticohippocampal11,16,34,35,42,de telles préparations inclinées ne sont pas exigées pour l’activité spontanée de réseau43,44,45. Toutefois, l’utilisation d’un plan de découpage incliné permet à l’enquêteur de faire sélectivement des tranches qui préservent le mieux les lamellae orientées transversalement de l’hippocampe ventral ou intermédiaire, selon qu’un angle vers le bas ou vers le haut est appliqué (figure 1). Cette approche est conceptuellement semblable à celle utilisée par Papatheodoropoulos et coll., 2002, qui ont disséqué chaque hippocampe librement, puis utilisé un hachoir de tissu pour créer des tranches transversales le long de l’axe dorsal-ventralentier 21. À la lumière des distinctions fonctionnelles susmentionnées entre l’hippocampe ventral et dorsale-intermédiaire, les chercheurs devraient tenir compte de l’origine anatomique des tranches lors de la conception d’expériences ou de l’interprétation des résultats. L’utilisation d’une rampe d’agar pendant la procédure de tranchage est un moyen simple de produire préférentiellement des tranches de l’hippocampe intermédiaire ou ventral.

Les tranches hippocampiques peuvent être maintenues soit dans une chambre submergée (avec le tissu complètement immergé dans l’ACSF), soit dans une chambre de style interface (par exemple, chambre Oslo ou Haas, avec des tranches couvertes uniquement par un mince film de médias fluides). L’entretien de l’interface améliore l’oxygénation du tissu, ce qui favorise la survie neuronale et permet des niveaux élevés soutenus d’activité interuronale. Traditionnellement, les conditions d’enregistrement submergées utilisent un débit ACSF plus lent qui ne fournit pas une oxygénation adéquate des tissus pour l’expression stable des oscillations au niveau du réseau. Dans les tranches hippocampales submergées, les oscillations gamma induites par le carbachol ne sont observées quetransitoirement 46,47, alors qu’elles peuvent être maintenues de façon durable dans les chambres d’enregistrementd’interface 10,48,49. En tant que tel, de nombreuses études de l’activité spontanée complexe in vitro se sont appuyées sur des chambres d’enregistrement d’interface pour étudier les complexes d’ondulation à ondes vives6,7,8,9,10,25,37, oscillations gamma10,13, et l’activité épileptiforme16,38,45,47.

Dans une chambre d’enregistrement de style immergé, un objectif de microscope d’immersion peut être utilisé pour visualiser les cellules individuelles et cibler sélectivement les cellules d’aspect sain pour les enregistrements. La préparation submergée permet également un contrôle fin sur le milieu cellulaire, car la submersion facilite la diffusion rapide de médicaments ou d’autres composés dans le tissu. Ainsi, une méthodologie modifiée dans laquelle les oscillations stables du réseau sont maintenues dans des conditions submergées représente une approche expérimentale puissante. Cette approche est illustrée par le travail de Hájos et coll., dans lequel les tranches hippocampiques se rétablissent dans une chambre de détention simplifiée de style interface pendant plusieurs heures avant d’être transférées dans une chambre d’enregistrement submergée modifiée avec un débit élevé d’ACSF (~6 mL/min) pour améliorer l’approvisionnementen oxygène du tissu 12,48,49. Dans ces conditions, des niveaux élevés d’activité interneuronale et des oscillations spontanées stables du réseau peuvent être maintenus dans une chambre d’enregistrement submergée. Cette approche modifiée permet aux chercheurs d’effectuer des enregistrements de pinces à patch à cellules entières guidées visuellement et de caractériser la contribution des types de cellules morphologiquement identifiés aux oscillations gamma induites par le carbachol12. Les RSR peuvent également se produire spontanément dans des tranches hippocampiques submergées avec un débit rapide de11,48,49. Maier et coll. ont démontré que les tranches hippocampiques qui se sont rétablies dans une chambre d’interface avant d’être transférées dans une chambre d’enregistrement submergée présentaient de façon fiable des RS spontanés, tandis que les tranches qui se rétablissaient immergées dans un bécher avant d’être transférées dans une chambre d’enregistrement submergée montraient des réponses plus petites sur le terrain évoquées, des niveaux inférieurs de courants synaptiques spontanés et seulement très rarement des SWRspontanés 43. Schlingloff et coll. ont utilisé cette méthodologie améliorée pour démontrer le rôle des cellules paniers exprimant la parvalbumine dans la génération de SRSspontanés 44.

Le protocole suivant présente une méthode de tranchage par laquelle les neurones spontanément actifs dans les tranches hippocampiques horizontales peuvent être récupérés dans des conditions d’interface et ensuite maintenus dans une chambre d’enregistrement submergée adaptée aux manipulations pharmacologiques ou optogénétiques et aux enregistrements visuellement guidés.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Columbia (AC-AAAU9451).

1. Préparer des solutions

  1. Préparez la solution de coupe du saccharose pour le tranchage tel que décrit dans le tableau 1.
    REMARQUE : Après avoir préparé 1 L de solution de saccharose, congeler une petite quantité (environ 100 à 200 mL) dans un plateau de glace. Ces glaçons congelés au saccharose seront mélangés dans une boue glacée (voir l’étape 4.3).
  2. Préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) pour l’enregistrement tel que décrit dans le tableau 2.
  3. Préparez 1 M de NaCl pour les pipettes de stimulation en dissolvant 0,05844 g de NaCl dans 1 mL d’eau purifiée filtrée pour éliminer les métaux traces et autres impuretés.
    REMARQUE : La solution de coupe de saccharose et l’ACSF doivent être préparées fraîches pour chaque expérience.

2. Préparer la rampe d’agar

  1. Préparer 4 % d’agar (p. ex., 2 g d’agar dans 50 mL d’eau) en dissolvant la poudre d’agar dans de l’eau purifiée filtrée pour éliminer les métaux traces et autres impuretés. Chauffer le mélange au micro-ondes jusqu’à ce qu’il commence à bouillir (environ 30-60 s). Verser l’agar fondu dans un moule et lui permettre de refroidir et de solidifier à 4 °C dans un réfrigérateur à une inclinaison d’environ 12°.
    REMARQUE : Pour un moule, on peut utiliser n’importe quel récipient en verre ou en plastique réglé à un angle, avec suffisamment d’agar fondu versé pour former une rampe de 4 cm de longueur et d’environ 0,8 cm de hauteur.

3. Mettre en scène la zone de tranchage

  1. Remplir un bécher de 400 mL contenant une chambre de récupération en tranches d’environ 250 mL d’ACSF; placez-le dans un bain d’eau réchauffé à 32 °C et commencez à bouillonner avec du carbogen (95 % de gaz d’oxygène/5 % de dioxyde de carbone).
    REMARQUE : Remplissez le bécher de récupération avec juste assez de liquide pour placer le maillage en nylon de la chambre de retenue à la surface même de la solution, de sorte que les tranches se tiennent à l’interface du mélange de solution chaude et de l’air (figure 1). Placez de petits morceaux de papier d’objectif sur le maillage en nylon. Les tranches seront sur le dessus du papier de lentille, qui peut plus tard être utilisé pour transférer des tranches individuellement à la chambre d’enregistrement (voir l’étape 6.6).
  2. Placez un flacon avec la solution de saccharose dans un seau à glace pour refroidir et commencer à bouillonner avec du carbogen.
    REMARQUE : Le bécher de récupération et la solution de saccharose doivent être réchauffés et réfrigérés, respectivement, le carbogen bouillonnant pendant au moins 30 minutes avant que la souris ne soit placée dans la chambre isoflurane.
  3. Retirer le plateau de glaçons de solution de saccharose préfabriqués et congelés du congélateur et les déposer sur le banc pour les décongeler partiellement.
  4. Placez la moitié d’une lame de rasoir propre à double tranchant dans le microtome et calibrez si nécessaire. Réserver l’autre moitié de la lame de rasoir pour l’utiliser pendant la dissection.
  5. Exécutez une ligne de carbogen et une sonde de température dans la chambre de tranchage et entourez de glace pour refroidir la chambre.
  6. Préparez un banc ou une table propre recouvert de deux coussinets absorbants jetables. Placez tous les outils de dissection et trois morceaux de ruban adhésif de laboratoire sur le coussin gauche, où la perfusion transcardique sera effectuée.
    REMARQUE : Les outils de dissection comprennent de petits ciseaux de Bonn, des ciseaux dissector, une grande spatule/cuillère, une microspatule, un scalpel avec une nouvelle lame, une spatule, des ciseaux chirurgicaux pointus/émoussés, de gros forceps tissulaires et de petits forceps tissulaires (voir tableau des matériaux).
  7. Sur l’autre tampon absorbant à droite de la zone de perfusion, placez un morceau circulaire de papier filtre dans le couvercle d’une boîte petri en verre de 100 mm de diamètre. Placez le fond de la boîte de Pétri à côté du couvercle et placez une ligne de carbogen dans les deux morceaux du plat.
  8. Utilisez une lame de rasoir ou un scalpel pour couper une petite rampe d’agar (environ 4 cm le long de la surface inclinée, 0,8 cm de hauteur, 2 cm de largeur). Coupez un morceau de la rampe de l’extrémité haute et inversez-le pour créer un bloc d’agar de soutien. Utilisez l’adhésif cyanoacrylate pour apposer la rampe d’agar et le bloc d’appui sur la plate-forme de tranchage et réserver.
    REMARQUE : Le bloc d’appui de l’agar aide à stabiliser le cerveau pendant le tranchage et fournit une surface sur laquelle disséquer les tissus inutiles de chaque tranche (Figure 1).

4. Perfusion transcardique

  1. Suspendre une seringue de capacité de 60 mL comme réservoir pour la solution de coupe du saccharose à environ 18 pouces au-dessus du banc (p. ex., à l’aide d’une pince pivotante à trois volets sur un poteau vertical). Fixez le tube au fond du réservoir, exécutez le tube à travers une pince à rouleaux et connectez l’autre extrémité du tube à une aiguille propre de 20 G.
  2. Remplissez le réservoir de 60 mL d’environ 30 mL de solution de saccharose réfrigérée et dirigez une ligne de carbogen dans le réservoir de saccharose pour faire continuellement bouillonner le perfusate.
    REMARQUE : Assurez-vous que le saccharose coule à travers le tube et l’aiguille sans bulles piégées. Le débit devrait être juste assez rapide pour avoir un flux régulier et continu de saccharose dégoulinant de l’aiguille.
  3. À l’aide d’un mélangeur, écraser et mélanger le saccharose congelé dans un lisier glacé et utiliser la grande spatule/cuillère pour distribuer le lisier.
    1. Placez une petite quantité de boue de saccharose sur les bords du couvercle en verre de la boîte de Pétri. Ajouter une petite quantité de boue de saccharose au fond de la boîte de Pétri.
    2. Ajouter environ 20 à 30 mL de boue de saccharose au réservoir de liquide de perfusion, en le mélangeant bien avec les 30 mL de saccharose liquide réfrigéré jusqu’à ce que le réservoir contienne un mélange de saccharose très froid, principalement liquide, avec une solution congelée restante.
  4. Placez la souris dans une chambre reliée à un vaporisateur isoflurane. Avec l’oxygène qui coule à environ 2 L/min, tournez le cadran du vaporisateur pour livrer l’isoflurane à 5% de concentration et démarrer une minuterie.
    REMARQUE : Maintenez cette insurisation tout au long du tranchage pour évaluer la rapidité avec laquelle les tranches sont obtenues. La procédure doit être effectuée aussi rapidement que possible, de sorte que le tranchage est terminé, et le tissu se rétablit dans la chambre d’interface dans les 15-20 min de l’animal entrant dans la chambre isoflurane. Surveillez la souris pour vous assurer qu’un état d’anesthésie profonde est atteint. Après un minimum de 5 minutes, la souris doit être profondément anesthésiée et ne répond pas aux pincements d’unteil.
  5. Immédiatement avant d’enlever la souris de la chambre d’isoflurane, remplissez le couvercle de la boîte de Petri d’une solution de saccharose réfrigérée à une profondeur d’environ 3 à 5 mm et remplissez le fond de la boîte de Pétri d’une solution de saccharose réfrigérée à une profondeur d’environ 1,0 cm.
  6. Transférez rapidement la souris sur le tampon absorbant gauche et utilisez les 3 morceaux de ruban adhésif pour fixer les membres antérieurs et la queue. Effectuez une pincement de l’orteil de l’orteil de l’arrière pour s’assurer que la souris ne réagit pas avant qu’une incision ne soit pratiquée. À l’aide des gros forceps tissulaires et des ciseaux chirurgicaux, tentez la peau et faites une incision dans le sens de la longueur du bas du sternum jusqu’au haut de la poitrine. En utilisant les forceps tirer vers le haut sur le sternum et utiliser les ciseaux pour couper à travers le diaphragme.
    REMARQUE : Le positionnement initial de la souris et les premières incisions pour couper le diaphragme doivent être effectués le plus rapidement possible pour s’assurer que la souris ne reprend pas conscience. Pour assurer une profondeur adéquate de l’anesthésie tout au long de l’intervention, un cône nasal peut être placé sur la souris pour délivrer l’isoflurane pendant la perfusion.
  7. Utilisez les ciseaux pour couper à travers la cage thoracique de chaque côté, en coupant dans un grand mouvement vers le point où le membre antérieur rencontre le corps. Avec les forceps, balancer l’avant de la cage thoracique loin et vers le haut vers la tête, puis l’enlever complètement avec une coupe horizontale à l’aide des grands ciseaux. Maintenez le cœur en place à l’aide des gros forceps et insérez l’aiguille de perfusion de 20 G dans le ventricule gauche. Une fois que l’aiguille est positionnée correctement, le côté gauche du cœur doit rapidement pâlir car la solution de saccharose réfrigérée remplit le ventricule.
  8. Utilisez les petits ciseaux dissector pour couper dans l’atrium droit et permettre au sang de s’écouler du système circulatoire. Si les incisions sont effectuées correctement, il devrait y avoir des dommages minimes au cœur, et il devrait continuer à pomper tout au long de la perfusion.
    REMARQUE : Des morceaux enroulés de papier de soie peuvent être utilisés pour évacuer la solution de sang et de saccharose du cœur et maintenir la visibilité de l’aiguille de perfusion pendant l’intervention.
  9. Assurez-vous que l’aiguille de perfusion reste en place et ne tombe pas du ventricule gauche. Avec un taux d’écoulement et un placement appropriés, le foie commencera à pâlir à une couleur beige/beige clair avec 20-30 s.
  10. Après 30-45 s, utilisez les gros ciseaux pour décapiter la souris. Tenir la tête dans la main gauche, pousser ou peler la peau loin du crâne. Chez un animal bien perfusé, le crâne doit être très pâle, et le cerveau doit apparaître d’une couleur rose très clair (s’approchant du blanc) à travers le crâne sans vaisseaux sanguins clairement visibles.

5. Extraire le cerveau et couper les tranches

  1. À l’aide des petits ciseaux de Bonn, faire deux coupes latérales à travers le crâne vers la ligne médiane à l’avant du crâne, près des yeux. Faire deux coupes supplémentaires de chaque côté de la base du crâne.
  2. Transférer la tête au fond de la boîte de Pétri en verre où elle doit être principalement immergée dans une solution de saccharose réfrigérée. Utilisez les petits ciseaux de Bonn pour couper la ligne médiane le long de la longueur du crâne, en tirant vers le haut avec les ciseaux pour minimiser les dommages au tissu cérébral sous-jacent. À l’aide des petits forceps tissulaires, saisissez fermement chaque côté du crâne et balancez-le vers le haut et loin du cerveau, comme l’ouverture d’un livre.
  3. Utilisez les doigts de la main gauche pour tenir les volets du crâne ouverts et insérer la microspatule sous le cerveau près des ampoules olfactives. Retournez le cerveau du crâne dans le saccharose et utilisez la microspatule pour couper le tronc cérébral. Lavez le cerveau pour enlever le sang résiduel, la fourrure ou d’autres tissus.
  4. Utilisez la grande spatule/cuillère pour transférer le cerveau sur le couvercle de la boîte de Pétri en verre. Avec l’autre moitié de la lame de rasoir à double tranchant précédemment mis de côté, faire deux coupes coronal pour d’abord enlever le cervelet, puis la partie la plus antérieure du cerveau, y compris les ampoules olfactives (Figure 1).
  5. Appliquer l’adhésif cyanoacrylate sur la rampe d’agar. Placez très brièvement le cerveau sur un morceau de papier filtre sec à l’aide des gros forceps tissulaires, puis transférez-le immédiatement à la rampe d’agar, plaçant la surface ventrale du cerveau sur l’adhésif.
    REMARQUE : Pour les tranches de l’hippocampe intermédiaire, le cerveau doit être orienté avec l’antérieur faisant face à la pente de la rampe, et le postérieur plus près de la lame. Pour les tranches de l’hippocampe ventral, orientez le cerveau avec l’extrémité antérieure pointée vers le bas de la pente de la rampe, avec l’extrémité postérieure au sommet de la rampe, plus loin de la lame. Dans les deux cas, le cerveau doit être placé au sommet de la rampe, de sorte que la surface coronally-coupée du cerveau entre en contact avec le bloc d’appui d’agar (figure 1).
  6. Placez la plate-forme de tranchage avec l’agar et le cerveau dans la chambre de tranchage de la microtome et plongez complètement avec la solution de saccharose réfrigérée. Utilisez la grande spatule/cuillère pour transférer un peu de boue de saccharose dans la chambre, en remuant pour faire fondre le saccharose congelé et faire baisser rapidement la température du mélange à ~1-2 °C.
    REMARQUE : Surveillez la jauge de température tout au long du tranchage. Si la solution de saccharose se réchauffe au-dessus de 3 °C, ajouter plus de boue et mélanger pour ramener la température vers le bas.
  7. Couper les tranches à une épaisseur de 450 μm avec la vitesse de microtome réglée à 0,07 mm/s. Au fur et à mesure que chaque tranche est libérée, utilisez les petits forceps tissulaires et un scalpel pointu pour séparer d’abord les deux hémisphères, puis pour couper les tissus jusqu’à ce que la tranche se compose principalement de l’hippocampe et des régions parahippocampales (figure 1).
  8. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour transférer les tranches individuellement à la chambre de récupération de l’interface, en s’assurant qu’elles sont placées à l’interface de l’ACSF et de l’air avec seulement un ménisque mince d’ACSF couvrant les tranches. Fermer hermétiquement le couvercle de la chambre et laisser les tranches récupérer à 32 °C pendant 30 min.
  9. Après la récupération initiale à 32 °C, sortez la chambre de récupération de l’interface du bain d’eau et placez-la sur un agitateur réglé à une vitesse lente de sorte que la barre magnétique favorise la circulation de l’ACSF à l’intérieur de la chambre. Laissez-le refroidir graduellement à température ambiante pendant que les tranches récupèrent pendant 90 min supplémentaires. Assurez-vous que la chambre de récupération est continuellement bouillonne de carbogen et ne laissez pas les grosses bulles se coincer sous les tranches.

6. Effectuer des enregistrements d’activité spontanée sur le terrain (LFP) locaux

  1. Préparez-vous aux enregistrements LFP en alliant tout l’équipement nécessaire, y compris l’ordinateur exécutant le logiciel d’acquisition, le moniteur connecté à l’ordinateur, les stimulateurs, le micromanipulateur, le contrôleur de température, la source de lumière du microscope, la caméra fixée au microscope, l’amplificateur microélecrode, le numériseur et la pompe périssaliste. Si vous utilisez un système de vide central, ouvrez la vanne murale pour préparer la ligne de vide qui retirera l’ACSF de la chambre d’enregistrement.
  2. Remplissez le réservoir chauffé d’ACSF, puis placez une extrémité du tube dans le bécher de 400 mL contenant le bouillonnant ACSF. Allumez la pompe périssaltique pour diriger l’ACSF du bécher de 400 mL vers le réservoir chauffé, et du réservoir vers la chambre d’enregistrement. Appuyez ou pincez le tube pour libérer les bulles piégées.
  3. Réglez la pompe périssaltique pour vous assurer que le débit de l’ACSF à travers la chambre d’enregistrement est rapide (~ 8-10 mL/min). Utilisez une sonde de température pour vous assurer que l’ACSF est à 32 °C au centre de la chambre d’enregistrement.
    REMARQUE : Si l’ACSF est livré à la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pompe périssaltique, un débit élevé peut entraîner une fluctuation importante du débit. Des débits constants peuvent être atteints à l’aide d’un simple amortisseur de pulsation composé d’une série de seringues vides intégrées dans le tube (figure 2).
  4. Préparer la stimulation et enregistrer les pipettes à partir de capillaires en verre borosilicate à l’aide d’un tire-filament chauffant. Le protocole puller doit être configuré pour produire des pipettes avec une résistance de 2-3 MOhm pour la stimulation ou des électrodes d’enregistrement potentielles sur le terrain local.
  5. Remplissez les pipettes de stimulation avec des pipettes 1 M NaCl et LFP avec ACSF.
  6. Serrez brièvement le tube et éteignez la pompe pour arrêter l’écoulement de l’ACSF. Transférer une tranche dans la chambre d’enregistrement à l’aide de forceps fins pour saisir un coin du papier de lentille de la tranche repose sur la tranche collera au papier de lentille. Placez le papier de l’objectif et tranchez-le dans la chambre d’enregistrement avec la tranche orientée vers le bas, puis « pelez » le papier de l’objectif en laissant la tranche immergée dans la chambre d’enregistrement. Fixer la tranche à l’aide d’une harpe.
    REMARQUE : Les harpes peuvent être achetées pré-fabriquées ou fabriquées en laboratoire à l’aide d’un morceau en forme de U d’acier inoxydable ou de platine et de filament de nylon fin.
  7. Placez une pipette de stimulation remplie de NaCl dans le micromanipulateur manuel et avancez lentement la pointe de la pipette dans la surface de la tranche (p. ex., dans la couche de radiatum strate) à un angle d’environ 30 à 45 °. Une fois que la pointe de la pipette pénètre dans le tissu, avancez la pipette vers l’avant lentement et abstenez-vous de grands mouvements dans la direction latérale ou verticale qui pourraient endommager inutilement les axones dans la tranche. Placez l’extrémité de la pipette au moins 50-100 μm profondément dans la tranche pour éviter les cellules près de la surface qui ont été endommagées pendant le tranchage.
  8. Placez une pipette LFP remplie d’ACSF dans le porte-pipette fixé au micromanipulateur motorisé. Appliquez une pression positive très légère à l’aide d’une pression buccale ou d’une seringue de 1 mL reliée par une valve de robinet d’arrêt et une courte longueur de tube au porte-pipette.
    REMARQUE : Placez les pipettes LFP dans la tranche afin d’enregistrer les signaux d’intérêt : en cas d’ondulations d’ondes aiguës, une pipette LFP doit être placée dans la strate pyramidale (SP) et une deuxième pipette dans le radiatum stratique (SR). Cette configuration permet d’enregistrer simultanément l’onde pointue négative dans le SR et l’oscillation d’ondulation à haute fréquence dans le SP (Figure 3).
  9. L’utilisation du micromanipulateur avance lentement la pointe de la pipette LFP dans la région d’intérêt (p. ex., la couche pyramidale de cellules CA1) à un angle d’environ 30 à 45 °. Placez l’extrémité de la pipette au moins 50-100 μm profondément dans la tranche pour éviter les cellules près de la surface qui ont été endommagées pendant le tranchage. Tout en faisant progresser la pipette LFP, livrer continuellement une petite impulsion de test de tension à l’aide du logiciel d’acquisition et de regarder pour une augmentation soudaine de la résistance aux électrodes. Cela peut indiquer que la pipette a été obstruée ou pressée contre une cellule.
  10. Une fois que la pipette LFP est positionnée dans la région d’intérêt, relâchez soigneusement la pression positive en ouvrant la vanne sur le tube fixé au porte-pipette.
  11. Pour enregistrer simultanément la LFP dans un deuxième emplacement, répétez les étapes 6.8-6.10 avec une deuxième pipette et micromanipulateur.
  12. Utilisez l’amplificateur microélecrode dans la configuration actuelle de la pince pour enregistrer l’activité spontanée dans le potentiel de champ local après avoir utilisé la fonction d’équilibre du pont dans le logiciel d’acquisition pour corriger la résistance en série de la pipette. Les DTS spontanés apparaîtront comme des déviations positives dans le potentiel extracellulaire de la couche SP (figure 3).
  13. Afin d’enregistrer les potentiels de champ évoqués, utilisez les stimulateurs connectés au numériseur pour fournir une courte impulsion de tension carrée (200 nous) à travers la pipette de stimulation remplie de NaCl. Ajustez le cadran de tension de stimulation pour évoquer une gamme d’amplitudes de réponse.

Résultats

Présentés ici sont des enregistrements représentatifs de tranches HEC préparé tel que décrit dans ce protocole. Après récupération dans une chambre de détention d’interface (figure 1C), les tranches sont transférées individuellement dans une chambre d’enregistrement submergée (figure 2B). La chambre d’enregistrement est fournie avec acsf saturé de carbogen à l’aide d’une pompe périssaltique (Figure 2A). La ...

Discussion

Il y a plusieurs étapes dans ce protocole de tranchage conçus pour favoriser la santé des tissus et favoriser l’émergence de l’activité spontanée du réseau naturaliste : la souris est transcardially perfusée avec la solution de coupe de saccharose réfrigérée ; les tranches de cortex horizontal-entorhinal (HEC) sont coupées à une épaisseur de 450 μm de l’hippocampe intermédiaire ou ventral ; les tranches se rétablissent à l’interface de l’ACSF réchauffé et de l’air humidifié et riche en ca...

Déclarations de divulgation

L’auteur n’a rien à divulguer.

Remerciements

L’auteur tiens à remercier Steve Siegelbaum pour son soutien. Le financement est fourni par 5R01NS106983-02 ainsi que par 1 F31 NS113466-01.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
3D printerLulzbotLulzBot TAZ 6
Acute brain slice incubation holderNIH 3D Print Exchange3DPX-001623Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
Adenosine 5′-triphosphate magnesium saltSigma AldrichA9187-500MG
Ag-Cl ground pelletsWarner64-1309, (E205)
agarBecton, Dickinson214530-500g
ascorbic acidAlfa Aesar36237
beaker (250 mL)Kimax14000-250
beaker (400 mL)Kimax14000-400
biocytinSigma AldrichB4261
blenderOsterBRLY07-B00-NP0
Bonn scissors, smallbecton, Dickinson14184-09
borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)Sutter InstrumentsBF150-86-10HPFire polished capillaries are preferable.
calcium chloride solution (1 M)G-BiosciencesR040
cameraOlympusOLY-150
compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)AirgasX02OX95C2003102
compressed oxygenAirgasOX 200
constant voltage isolated stimulatorDigitimer Ltd.DS2A-Mk.II
coverslips (22x50 mm)VWR16004-314
cyanoacrylate adhesiveKrazy GlueKG925Ideally use the brush-on form for precision
data acquisition softwareAxographN/AAny equivalent software (e.g. pClamp) would work.
Dell Precision T1500 Tower Workstation DesktopDellN/ACatalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.
Digidata 1440AMolecular Devices1-2950-0367
digital timerVWR62344-6414-channel Traceable timer
disposable absorbant padsVWR56616-018
dissector scissorsFine Science Tools14082-09
double-edge razor bladesPersonnaBP9020
dual automatic temperature controllerWarner Instrument CorporationTC-344B
dual-surface or laminar-flow optimized recording chamberN/AN/AThe chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.
equipment rackAutomate ScientificFR-EQ70"A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology
Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA)Sigma Aldrich324626-25GM
filter paperWhatman1004 070
fine scaleMettler ToledoXS204DR
Flaming/Brown micropipette pullerSutter InstrumentsP-97
glass petri dish (100 x 15 mm)Corning3160-101
glucoseFisher ScientificD16-1
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrateSigma AldrichG8877-250MG
ice bucketsSigma AldrichBAM168072002-1EA
isoflurane vaporizerGeneral Anesthetic ServicesTec 3
lab tapeFisher Scientific15-901-10R
lens paperFisher Scientific11-996
light sourceOlympusTH4-100
magnesium chloride solution (1 M)Quality Biological351-033-721EA
magnetic stir barsFisher Scientific14-513-56Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.
micromanipulatorLuigs & NeumannSM-5
micromanipulator (manual)ScientificaLBM-2000-00
microscopeOlympusBX51WI
microspatulaFine Science Tools10089-11
monitorDell2007FPb
MultiClamp 700B Microelectrode AmplifierMolecular DevicesMULTICLAMP 700BThe MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)Sigma AldrichH3375-25G
needle (20 gauge, 1.5 in length)Becton, Dickinson305176
nylon filamentYLI Wonder Invisible Thread212-15-004size 0.004. This cat. # is from Amazon.com
nylon meshWarner Instruments Corporation64-0198
perstaltic pumpHarvard Apparatus70-2027
Phosphocreatine di(tris) saltSigma AldrichP1937-1G
pipette holdersMolecular Devices1-HL-U
platinum wireWorld PrecisionPT0203
polylactic acid (PLA) filamentUltimakerRAL 9010
potassium chlorideSigma AldrichP3911-500G
potassium gluconateSigma Aldrich1550001-200MG
potassium hydroxideSigma Aldrich60377-1KG
razor bladesVWR55411-050
roller clampWorld Precision Instruments14041
scaleMettler ToledoPM2000
scalpel handleFine Science Tools10004-13
slice harpWarnerSHD-26GH/2
sodium bicarbonateFisher ChemicalS233-500
sodium chlorideSigma AldrichS9888-1KG
sodium phosphate monobasic anhydrousFisher ChemicalS369-500
sodium pyruvateFisher ChemicalBP356-100
spatulaVWR82027-520
spatula/spoon, largeVWR470149-442
sterile scalpel bladesFeather72044-10
stirrer / hot plateCorning6795-220
stopcock valves, 1-wayWorld Precision Instruments14054
stopcock valves, 3-wayWorld Precision Instruments14036
sucroseAcros OrganicsAC177142500
support for swivel clampsFisher Scientific14-679Q
surgical scissors, sharp/bluntFine Science Tools14001-12
syringe (1 mL)Becton, Dickinson309659
syringe (60 mL with Luer-Lok tip)Becton, Dickinson309653
three-pronged clampFisher Scientific05-769-8Q
tissue forceps, largeFine Science Tools11021-15
tissue forceps, smallFine Science Tools11023-10
transfer pipettesFisher Scientific13-711-7M
tubingTygonE-3603ID 1/16 inch, OD 3/16 inch
tubingTygonR-3603ID 1/8 inch, OD 1/4 inch
vacuum greaseDow Corning14-635-5D
vibrating blade microtomeLeicaVT 1200S
vibration-dampening table with faraday cageMicro-G / TMC-ametek2536-516-4-30PE
volumetric flask (1 L)KimaxKIM-28014-1000
volumetric flask (2 L)PYREX65640-2000
warm water bathVWR1209
 

Références

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