Corte cerebral aguda do rato para investigar atividade espontânea da rede hipocampal

Resumo

Este protocolo descreve a preparação de fatias horizontais do córtex hipocampal-entorhinal (HEC) de camundongos que exibem atividade espontânea de ondulação de ondas afiadas. As fatias são incubadas em uma câmara de realização de interface simplificada e as gravações são realizadas em condições submersas com fluido cerebrospinal artificial de fluxo rápido para promover a oxigenação tecidual e o surgimento espontâneo da atividade em nível de rede.

Resumo

O corte cerebral de roedores agudos oferece uma abordagem experimental tratável para obter uma visão sobre a organização e função de circuitos neurais com resolução unicelular usando eletrofisiologia, microscopia e farmacologia. No entanto, uma grande consideração no desenho de experimentos in vitro é a extensão em que diferentes preparações de fatias recapitulam padrões naturalistas da atividade neural como observado in vivo. No cérebro intacto, a rede hipocampal gera atividade populacional altamente sincronizada refletindo o estado comportamental do animal, como exemplificado pelos complexos de ondas agudas (SWRs) que ocorrem durante o despertar de estados consumados ou sono não-REM. SWRs e outras formas de atividade de rede podem surgir espontaneamente em fatias hipocampais isoladas em condições apropriadas. Para aplicar o poderoso kit de ferramentas de fatia cerebral à investigação da atividade da rede hipocampal, é necessário utilizar uma abordagem que otimize a saúde do tecido e a preservação da conectividade funcional dentro da rede hipocampal. Os camundongos são transcardialmente perfundidos com fluido cerebrospinal artificial à base de sacarose fria. As fatias horizontais contendo o hipocampo são cortadas a uma espessura de 450 μm para preservar a conectividade sináptica. As fatias se recuperam em uma câmara estilo interface e são transferidas para uma câmara submersa para gravações. A câmara de gravação foi projetada para superfusão de superfície dupla de fluido cerebrospinal artificial a uma alta taxa de fluxo para melhorar a oxigenação da fatia. Este protocolo produz tecido saudável adequado para a investigação de atividades complexas e espontâneas da rede in vitro.

Introdução

A medição eletrofisiológica de fatias hipocampais vivas in vitro é uma abordagem experimental poderosa com inúmeras vantagens. O experimentador pode usar um microscópio, micromanipuladores e um sistema de gravação para visualizar e coletar diretamente medições de neurônios individuais no tecido. As fatias de tecido também são muito acessíveis à fotostimulação ou à entrega de medicamentos para experimentos optogenéticos, quimigênicos ou farmacológicos.

A rede hipocampal gera atividade populacional altamente síncrona in vivo,visível como oscilações no potencial de campo local extracelular^1,2,3,4,5. Os métodos de fatia cerebral foram aproveitados para obter uma visão dos mecanismos celulares e de circuito subjacentes a essas oscilações da rede neuronal. O trabalho fundamental de Maier et al. demonstrou que complexos de ondas acentuadas (SWRs) podem surgir espontaneamente em fatias do hipocampo ventral^6,7. Estudos subsequentes de múltiplos pesquisadores têm gradualmente elucidado muitos aspectos das SWRs, incluindo o papel dos neuromoduladores na regulação do estado de rede do hipocampo^8,9,10 e os mecanismos sinápticos que impulsionam a reativação in vitro de conjuntos neuronais anteriormente ativos durante o comportamento in vivo¹¹. Experimentos com fatias cerebrais também forneceram uma visão da oscilação da gama gama gama (30-100 Hz), um estado distinto da rede hipocampal que se acredita apoiar a codificação da memória e recordar^12,13. Finalmente, reconhecendo o papel central do hipocampo e das estruturas associadas na fisiopatologia da epilepsia do lobo temporal^14,15, pesquisadores têm usado preparações de fatias hipocampais para investigar a geração e propagação da atividade epilépforme. Carter et al. demonstraram que fatias combinadas de córtex hipocampal-entorhinal preparadas a partir de animais cronicamente epilépticos podem gerar espontaneamente descargas epilépticas in vitro¹⁶. Posteriormente, Karlócai et al. exploraram os mecanismos subjacentes às descargas epilépformas em fatias hipocampais usando fluido cerebrospinal artificial modificado (ACSF) com concentrações de íons alteradas (Mg²⁺ ou K⁺elevados ) ou drogas adicionadas (4AP ou gabazina)¹⁷.

Os pesquisadores desenvolveram numerosas abordagens de fatias hipocampais que diferem de formas-chave: (1) a região do hipocampo contida na fatia (dorsal, intermediária ou ventral); (2) a presença ou ausência de tecidos extrahiptocampais, como o córtex entorhinal; (3) a orientação utilizada para cortar fatias (coronal, sagital, horizontal ou oblíqua); e (4) as condições sob as quais o tecido é mantido após o corte (submerso totalmente em ACSF ou mantido na interface do ACSF e ar umidificado, rico em carbogênio).

A escolha de qual abordagem de corte deve ser determinada pelo objetivo experimental. Por exemplo, fatias transversais ou coronais do hipocampo dorsal mantidas em condições submersas têm sido utilizadas de forma muito eficaz para a investigação de circuitos intrahipotecampal e plasticidade sináptica^18,19,20. No entanto, tais preparações não geram espontaneamente oscilações de rede tão facilmente quanto fatias do hipocampo ventral^21,22,23. Embora um estado de atividade SWR persistente possa ser induzido pela estimulação tetanica em fatias transversais do hipocampo dorsal e ventral²⁴, swRs espontâneos são mais facilmente observados em fatias ventrais^7,25.

Uma distinção fisiológica e anatômica inerente entre o hipocampo dorsal e ventral é apoiada por estudos realizados tanto in vivo quanto in vitro²⁶. Gravações em ratos revelaram ritmos de fortemente coerentes em todo o hipocampo dorsal e intermediário, mas com pouca coerência entre a região ventral e o resto do hipocampo²⁷. SWRs in vivo propagam-se prontamente entre o hipocampo dorsal e intermediário, enquanto os SWRs que se originam no hipocampo ventral permanecem frequentemente locais²⁸. As projeções associacionais originárias de neurônios piramimais ca3 que residem no projeto de hipocampo dorsal e intermediário a longas distâncias ao longo do eixo longitudinal do hipocampo. As projeções de CA3 originárias de regiões ventrais permanecem relativamente locais e, portanto, são menos propensas a serem cortadas durante o processo de corte^29,30. As fatias ventrais podem, portanto, preservar melhor a rede recorrente necessária para gerar sincronia populacional. A propensão de fatias ventrais para gerar atividades espontâneas de rede in vitro também pode refletir maior excitabilidade intrínseca de neurônios piramidários ou inibição mais fraca do hipocampo ventral em comparação com regiões mais dorsais³¹. De fato, as fatias hipocampais ventrais são mais suscetíveis à atividade epilépforme^32,33. Assim, muitos estudos de fisiológicas espontâneas^8,9,11,24 ou patológicos^16,34,35,36 oscilações de rede têm tradicionalmente utilizado uma abordagem de corte horizontal, às vezes com um leve ângulo na direção fronto-occipital, que produz fatias de tecido paralelas ao plano transversal do hipocampo ventral.

A conectividade de rede é inevitavelmente impactada pelo procedimento de corte, pois muitas células na fatia serão cortadas. O ângulo e a espessura da fatia e o tecido retido na preparação devem ser considerados para otimizar a conectividade nos circuitos de interesse. Muitos estudos utilizaram fatias horizontais combinadas de córtex hipocampal-entorhinal (HEC) para explorar interações entre as duas estruturas no contexto de oscilações fisiológicas ou patológicas da rede. Roth et al. realizaram gravações duplas do subcampo CA1 do hipocampo e da camada V do córtex entorhinal medial para demonstrar a propagação da atividade SWR através da fatia HEC³⁷. Muitos estudos de atividade epilepiforme têm utilizado a preparação da fatia hec para investigar como as descargas epilépformes se propagam através da rede corticohippocampal^16,35,36,38. É importante notar que a preservação do laço corticohippocampal intacto não é um pré-requisito para SWRs espontâneos, descargas epilépticas ou oscilações gama; oscilações de rede podem ser geradas em fatias transversais do hipocampo dorsal ou ventral sem tecidos parahiptocampais anexados^{21,22,23, 25,39,40,41}. Um fator mais importante para a geração espontânea de oscilações de rede em fatias hipocampais pode ser a espessura de cada fatia, pois uma fatia mais grossa (400-550 μm) preservará mais conectividade na rede recorrente CA2/CA3^21,22,25.

Embora as fatias de HEC horizontais angulares (cortadas com ângulo de aproximadamente 12° na direção fronto-occipital) tenham sido utilizadas para estudar a conectividade funcional do laço corticohippocampal^{11,16,34,35,42}, tais preparações angulares não são necessárias para a atividade espontânea da rede^43,44,45. No entanto, o uso de um plano de corte angular permite ao investigador fazer seletivamente fatias que melhor preservem o lamellae transversalmente orientado do hipocampo ventral ou intermediário, dependendo se um ângulo para baixo ou para cima é aplicado(Figura 1). Esta abordagem é conceitualmente semelhante à usada por Papatheodoropoulos et al., 2002, que dissecou cada hipocampo livre e depois usou um helicóptero de tecido para criar fatias transversais ao longo de todo o eixo dorsal-ventral²¹. À luz das distinções funcionais acima mencionadas entre o hipocampo ventral e dorsal-intermediário, os pesquisadores devem considerar a origem anatômica das fatias ao projetar experimentos ou interpretar resultados. O uso de uma rampa de ágar durante o procedimento de corte é uma maneira simples de produzir preferencialmente fatias do hipocampo intermediário ou ventral.

As fatias hipocampais podem ser mantidas em uma câmara submersa (com o tecido totalmente imerso em ACSF), ou em uma câmara de estilo interface (por exemplo, câmara de Oslo ou Haas, com fatias cobertas apenas por uma fina película de mídia fluindo). A manutenção da interface aumenta a oxigenação do tecido, o que promove a sobrevivência neuronal e permite altos níveis sustentados de atividade interneuronal. Tradicionalmente, as condições de gravação submersas utilizam uma taxa de fluxo ACSF mais lenta que não fornece oxigenação adequada do tecido para uma expressão estável de oscilações em nível de rede. Em fatias hipocampais submersas, as oscilações gama induzidas por carbachol são observadas apenas transitoriamente^46,47, enquanto podem ser mantidas de forma estável nas câmaras de gravação de interface^10,48,49. Como tal, muitos estudos de atividade espontânea complexa in vitro têm se apoiado em câmaras de gravação de interface para investigar complexos de ondas agudas^{6,7,8,9,10,25,37}, oscilações gama^10,13, e atividade epilépforma^16,38,45,47.

Em uma câmara de gravação de estilo submerso, um objetivo de microscópio de imersão pode ser usado para visualizar células individuais e direcionar seletivamente células de aparência saudável para gravações. A preparação submersa também permite um bom controle sobre o meio celular, pois a submersão facilita a rápida difusão de drogas ou outros compostos para o tecido. Assim, uma metodologia modificada na qual as oscilações estáveis da rede são mantidas em condições submersas representa uma abordagem experimental poderosa. Esta abordagem é exemplificada pelo trabalho de Hájos et al., no qual as fatias hipocampais se recuperam em uma câmara de retenção simplificada no estilo interface por várias horas antes da transferência para uma câmara de gravação submersa modificada com uma alta taxa de fluxo de ACSF (~6 mL/min) para aumentar o fornecimento de oxigênio ao tecido^12,48,49. Nessas condições, altos níveis de atividade interneuron e oscilações estáveis da rede espontânea podem ser mantidos em uma câmara de gravação submersa. Esta abordagem modificada permite que os pesquisadores realizem gravações de grampos de remendo de células inteiras visualmente guiadas e caracterizem a contribuição de tipos de células morfologicamente identificadas para as oscilações gama induzidas por carbachol¹². SwRs também podem ocorrer espontaneamente em fatias hipocampais submersas com uma taxa de fluxo rápida de ACSF^11,48,49. Maier et al. demonstraram que as fatias hipocampais que se recuperaram em uma câmara de interface antes da transferência para uma câmara de gravação submersa exibiam de forma confiável SWRs espontâneas, enquanto as fatias que se recuperavam submersas em um béquer antes da transferência para uma câmara de gravação submersa apresentaram respostas de campo evocadas menores, níveis mais baixos de correntes sinápticas espontâneas, e apenas muito raramente exibiam SWRs espontâneos⁴³. Schlingloff et al. utilizaram essa metodologia aprimorada para demonstrar o papel das células cestos expressas por parvalbumin na geração de SWRs^{espontâneas 44}.

O protocolo a seguir apresenta um método de corte através do qual neurônios espontaneamente ativos em fatias hipocampais horizontais podem ser recuperados em condições de interface e posteriormente mantidos em uma câmara de gravação submersa adequada para manipulações farmacológicas ou optogenéticas e gravações visualmente guiadas.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Columbia (AC-AAAU9451).

1. Preparar soluções

1. Prepare a solução de corte de sacarose para fatiamento, conforme descrito na Tabela 1.
   NOTA: Após preparar 1 L de solução de sacarose, congele uma pequena quantidade (aproximadamente 100-200 mL) em uma bandeja de gelo. Estes cubos de gelo de sacarose congelados serão misturados em um chorume gelado (ver passo 4.3).
2. Prepare o fluido cefalorraquidiano artificial (ACSF) para gravação conforme descrito na Tabela 2.
3. Prepare 1 M de NaCl para pipetas de estimulação dissolvendo 0,05844 g de NaCl em 1 mL de água purificada que foi filtrada para remover metais de traço e outras impurezas.
   NOTA: A solução de corte de sacarose e a ACSF devem ser preparadas frescas para cada experimento.

2. Prepare a rampa de ágar

1. Prepare 4% de ágar (por exemplo, 2 g de ágar em 50 mL de água) dissolvendo o pó de ágar em água purificada que foi filtrada para remover metais de traço e outras impurezas. Aqueça a mistura em um micro-ondas até começar a ferver (aproximadamente 30-60 s). Despeje o ágar derretido em um molde e deixe esfriar e solidificar a 4 °C em uma geladeira a aproximadamente 12° inclinação.
   NOTA: Para um molde, pode-se usar qualquer conjunto de vidro ou recipiente plástico em um ângulo, com ágar derretido suficiente derramado para formar uma rampa de 4 cm de comprimento e aproximadamente 0,8 cm de altura.

3. Encenou a área de corte

1. Encha um béquer de 400 mL contendo uma câmara de recuperação de fatias com aproximadamente 250 mL de ACSF; colocá-lo em um banho de água aquecido a 32 °C e começar a borbulhar com carbogen (95% gás oxigênio/5% gás dióxido de carbono).
   NOTA: Encha o béquer de recuperação com fluido suficiente para colocar a malha de nylon da câmara de retenção na própria superfície da solução, de modo que as fatias sejam mantidas na interface da mistura de solução quente e no ar(Figura 1). Coloque pequenos pedaços de papel de lente na malha de nylon. As fatias ficarão em cima do papel da lente, que mais tarde pode ser usado para transferir fatias individualmente para a câmara de gravação (ver passo 6.6).
2. Coloque um frasco com a solução de sacarose em um balde de gelo para esfriar e comece a borbulhar com carbogen.
   NOTA: A solução de béquer e sacarose deve ser aquecida e refrigerada, respectivamente, com carbogen borbulhando por pelo menos 30 minutos antes do mouse ser colocado na câmara isoflurane.
3. Retire a bandeja de cubos de gelo pré-fabricados e congelados da solução de sacarose do congelador e coloque no banco para descongelar parcialmente.
4. Coloque metade de uma lâmina de barbear de dois gumes limpa no microtome e calibrar se necessário. Reserve a outra metade da lâmina de barbear para uso durante a dissecção.
5. Execute uma linha de carbogen e sonda de temperatura na câmara de corte e cerque com gelo para esfriar a câmara.
6. Prepare um banco limpo ou mesa coberta com duas almofadas absorventes descartáveis. Coloque todas as ferramentas de dissecção e três pedaços de fita de laboratório na almofada esquerda, onde será realizada a perfusão transcárdia.
   NOTA: As ferramentas de dissecção incluem tesouras pequenas de Bonn, tesoura dissecatória, espátula/colher grande, microspatula, bisturi com nova lâmina, espátula, tesoura cirúrgica afiada/contundente, fórceps de tecido grande e pequenas fórceps teciduais (ver Tabela de Materiais).
7. Na outra almofada absorvente à direita da área de perfusão, coloque um pedaço circular de papel filtro na tampa de uma placa de petri de vidro de 100 mm de diâmetro. Coloque o fundo da placa de Petri ao lado da tampa e coloque uma linha de carbogen em ambos os pedaços do prato.
8. Use uma lâmina de barbear ou bisturi para cortar uma pequena rampa de ágar (aproximadamente 4 cm ao longo da superfície angular, 0,8 cm de altura, 2 cm de largura). Corte um pedaço da rampa da extremidade alta e reverta para criar um bloco de apoio de ágar. Use adesivo de cianoacrilato para fixar a rampa do ágar e o bloco de apoio à plataforma de corte e reserve.
   NOTA: O bloco de apoio do ágar ajuda a estabilizar o cérebro durante o corte e fornece uma superfície na qual dissecar tecidos desnecessários de cada fatia(Figura 1).

4. Perfusão transcárvia

1. Suspenda uma seringa de capacidade de 60 mL como reservatório para solução de corte de sacarose aproximadamente 18 polegadas acima da bancada (por exemplo, usando um grampo giratório de três pontas em um poste vertical). Anexar tubos ao fundo do reservatório, executar a tubulação através de um grampo de rolo, e conectar a outra extremidade do tubo a uma agulha limpa de 20 G.
2. Encha o reservatório de 60 mL com aproximadamente 30 mL de solução de sacarose resfriada e direcione uma linha de carbogen para dentro do reservatório de sacarose para borbulhar continuamente o perfusato.
   NOTA: Certifique-se de que a sacarose está fluindo através da tubulação e agulha sem quaisquer bolhas presas. A vazão deve ser rápida o suficiente para ter um fluxo constante e contínuo de sacarose pingando da agulha.
3. Usando um liquidificador, triture e misture a sacarose congelada em um chorume gelado e use a espátula/colher grande para distribuir o chorume.
   1. Coloque uma pequena quantidade de pasta de sacarose ao redor das bordas da tampa da placa de petri de vidro. Adicione uma pequena quantidade de pasta de sacarose ao fundo da placa de Petri.
   2. Adicione cerca de 20-30 mL de sacarose ao reservatório de fluido de perfusão, misturando-o bem com os 30 mL de sacarose líquida resfriada até que o reservatório contenha uma mistura de sacarose muito fria e predominantemente líquida com alguma solução congelada remanescente.
4. Coloque o mouse em uma câmara conectada a um vaporizador de isoflurane. Com o oxigênio fluindo a aproximadamente 2 L/min, gire o mostrador do vaporizador para entregar isoflurane a 5% de concentração e inicie um temporizador.
   NOTA: Mantenha este temporizador durante todo o processo de corte para medir a rapidez com que as fatias são obtidas. O procedimento deve ser feito o mais rápido possível, de modo que o corte esteja completo, e o tecido esteja se recuperando na câmara de interface dentro de 15-20 minutos do animal que entra na câmara isoflurane. Observe o mouse para garantir que um estado de anestesia profunda seja alcançado. Após um mínimo de 5 minutos, o mouse deve ser profundamente anestesiado e sem resposta para pinças do dedo do dedo.
5. Imediatamente antes de remover o mouse da câmara de isoflurane, encha a tampa da placa de Petri com solução de sacarose resfriada a uma profundidade de aproximadamente 3-5 mm e encha o fundo da placa de Petri com solução de sacarose gelada a uma profundidade de aproximadamente 1,0 cm.
6. Transfira rapidamente o mouse para a almofada absorvente esquerda e use as 3 peças de fita para fixar os membros dianteiros e a cauda. Execute uma pinça do dedo do pé traseiro para garantir que o mouse não responda antes que qualquer incisão seja realizada. Usando as grandes fórceps teciduais e tesouras cirúrgicas, tenda a pele e faça uma incisão longitudinal da parte inferior do esterno até o topo do peito. Usando as fórceps puxe para cima no esterno e use a tesoura para cortar através do diafragma.
   NOTA: O posicionamento inicial do mouse e as primeiras incisões para cortar o diafragma devem ser realizados o mais rápido possível para garantir que o mouse não recupere a consciência. Para garantir uma profundidade adequada da anestesia durante todo o procedimento, um cone de nariz pode ser colocado no mouse para entregar isoflurane durante a perfusão.
7. Use a tesoura para cortar a caixa torácica de cada lado, cortando em um grande movimento em direção ao ponto onde o membro dianteiro encontra o corpo. Com os fórceps, gire a frente da caixa torácica para longe e para cima em direção à cabeça, e então remova-a totalmente com um corte horizontal usando a tesoura grande. Segure o coração no lugar usando as grandes fórceps e insira a agulha de perfusão de 20 G no ventrículo esquerdo. Uma vez que a agulha esteja posicionada corretamente, o lado esquerdo do coração deve rapidamente empalidecer à medida que a solução de sacarose resfriada preenche o ventrículo.
8. Use a pequena tesoura dissecadora para cortar no átrio direito e permitir que o sangue flua para fora do sistema circulatório. Se as incisões forem realizadas corretamente, deve haver danos mínimos ao coração, e deve continuar bombeando durante toda a perfusão.
   NOTA: Pedaços enrolados de papel de tecido podem ser usados para afastar a solução de sangue e sacarose do coração e manter a visibilidade da agulha de perfusão durante o procedimento.
9. Certifique-se de que a agulha de perfusão permaneça no lugar e não caia do ventrículo esquerdo. Com uma taxa de fluxo e colocação adequadas, o fígado começará a empalidecer a uma cor bronzeada/bege leve com 20-30 s.
10. Depois de 30-45, use a tesoura grande para decapitar o rato. Segurando a cabeça na mão esquerda, empurre ou descasque a pele do crânio. Em um animal bem perfumado, o crânio deve ser muito pálido, e o cérebro deve aparecer uma cor rosa muito clara (aproximando-se de branco) através do crânio sem vasos sanguíneos claramente visíveis.

5. Extrair o cérebro e cortar fatias

1. Usando a pequena tesoura Bonn, faça dois cortes laterais através do crânio em direção à linha média na frente do crânio, perto dos olhos. Faça dois cortes adicionais em cada lado da base do crânio.
2. Transfira a cabeça para o fundo da placa de vidro Petri, onde deve ser principalmente imersa em solução de sacarose gelada. Use a pequena tesoura bonn para cortar a linha média ao longo do comprimento do crânio, puxando para cima com a tesoura para minimizar danos ao tecido cerebral subjacente. Usando as pequenas fórceps teciduais, segure firmemente cada lado do crânio e gire-o para cima e para longe do cérebro, como abrir um livro.
3. Use os dedos da mão esquerda para segurar os retalhos do crânio abertos e inserir a microspatula sob o cérebro perto das lâmpadas olfativas. Vire o cérebro para fora do crânio na sacarose e use a microspatula para cortar o tronco cerebral. Lave o cérebro para remover qualquer sangue residual, pele ou outros tecidos.
4. Use a espátula/colher grande para transferir o cérebro para a tampa da placa de vidro Petri. Com a outra metade da lâmina de barbear de dois gumes previamente reservada, faça dois cortes coronais para primeiro remover o cerebelo e, em seguida, a porção mais anterior do cérebro, incluindo as lâmpadas olfativas(Figura 1).
5. Aplique adesivo de cianoacrilato na rampa do ágar. Coloque brevemente o cérebro em um pedaço de papel filtro seco usando as grandes fórceps teciduais e, em seguida, transfira imediatamente para a rampa do ágar, colocando a superfície ventral do cérebro sobre o adesivo.
   NOTA: Para fatias do hipocampo intermediário, o cérebro deve ser orientado com o anterior voltado para a inclinação da rampa, e o posterior mais perto da lâmina. Para fatias do hipocampo ventral, oriente o cérebro com a extremidade anterior apontada para baixo da encosta da rampa, com a extremidade posterior no topo da rampa, mais longe da lâmina. Em ambos os casos, o cérebro deve ser posicionado no topo da rampa, de tal forma que a superfície coronally cortada do cérebro entra em contato com o bloco de apoio doágar (Figura 1).
6. Coloque a plataforma de corte com o ágar e o cérebro na câmara de corte do microtome e mergulhe completamente com solução de sacarose gelada. Use a espátula/colher grande para transferir um pouco de sacarose para a câmara, mexendo para derreter qualquer sacarose congelada e rapidamente baixar a temperatura da mistura para ~1-2 °C.
   NOTA: Observe o medidor de temperatura durante todo o corte. Se a solução de sacarose aquecer acima de 3 °C, adicione mais chorume e misture para baixar a temperatura.
7. Corte as fatias a uma espessura de 450 μm com a velocidade do microtome definida para 0,07 mm/s. À medida que cada fatia é liberada, use as pequenas fórceps teciduais e um bisturi afiado para primeiro separar os dois hemisférios, e depois cortar tecido até que a fatia consista principalmente nas regiões hipocampo e parahiptocampal(Figura 1).
8. Use uma pipeta de transferência de plástico para transferir as fatias individualmente para a câmara de recuperação da interface, garantindo que elas estejam posicionadas na interface do ACSF e no ar com apenas um menisco fino de ACSF cobrindo as fatias. Feche bem a tampa da câmara e deixe as fatias se recuperarem a 32 °C por 30 min.
9. Após a recuperação inicial a 32 °C, tire a câmara de recuperação da interface do banho de água e coloque em um agitador a uma velocidade lenta, de modo que a barra de agitação magnética promova a circulação de ACSF dentro da câmara. Deixe esfriar gradualmente até a temperatura ambiente à medida que as fatias se recuperam por mais 90 minutos. Certifique-se de que a câmara de recuperação seja continuamente borbulhada com carbogen e não permita que grandes bolhas fiquem presas sob as fatias.

6. Realizar gravações de potencial de campo local (LFP) de atividade espontânea

1. Prepare-se para gravações de LFP ligando todos os equipamentos necessários, incluindo o computador executando o software de aquisição, o monitor conectado ao computador, os estimuladores, o micromanipulador, o controlador de temperatura, a fonte de luz do microscópio, a câmera ligada ao microscópio, o amplificador de microeletromes, o digitalizador e a bomba peristáltica. Se usar um sistema de vácuo central, abra a válvula de parede para preparar a linha de vácuo que removerá o ACSF da câmara de gravação.
2. Encha o reservatório aquecido com ACSF e coloque uma extremidade da tubulação no béquer de 400 mL contendo o ACSF borbulhante. Ligue a bomba peristáltica para direcionar o ACSF do béquer de 400 mL para o reservatório aquecido, e do reservatório em diante para a câmara de gravação. Toque ou aperte a tubulação para liberar quaisquer bolhas presas.
3. Ajuste a bomba peristáltica para garantir que a taxa de fluxo DESF através da câmara de gravação seja rápida (~ 8-10 mL/min). Use uma sonda de temperatura para garantir que o ACSF esteja a 32 °C no centro da câmara de gravação.
   NOTA: Se o ACSF for entregue na câmara de gravação usando uma bomba peristáltica, uma alta taxa de fluxo pode resultar em uma flutuação significativa na taxa de fluxo. Taxas de fluxo consistentes podem ser alcançadas usando um simples amortecedor de pulsação consistindo de uma série de seringas vazias integradas ao tubo(Figura 2).
4. Prepare a estimulação e a gravação de pipetas de capilares de vidro borossilicato usando um puxador de filamento aquecido. O protocolo puller deve ser configurado para produzir pipetas com uma resistência de 2-3 MOhm para estimulação ou eletrodos de gravação em potencial de campo local.
5. Encha as pipetas de estimulação com pipetas de 1 M NaCl e LFP com ACSF.
6. Fixar brevemente a tubulação e desligar a bomba para pausar o fluxo de ACSF. Transfira uma fatia para a câmara de gravação usando fórceps finos para agarrar um canto do papel da lente que a fatia está apoiada na fatia grudará no papel da lente. Coloque o papel da lente e corte na câmara de gravação com a fatia virada para baixo, em seguida, "descasque" o papel da lente deixando a fatia submersa na câmara de gravação. Segure a fatia usando uma harpa.
   NOTA: As harpas podem ser compradas pré-fabricadas ou feitas em laboratório usando uma peça em forma de U de aço inoxidável ou filamento de nylon fino e de platina.
7. Coloque uma pipeta de estimulação cheia de NaCl no micromanipulador manual e avance lentamente a ponta da pipeta para a superfície da fatia (por exemplo, na camada de radiador do estrato) em um ângulo de aproximadamente 30-45°. Uma vez que a ponta da pipeta entre no tecido, avance a pipeta lentamente e abstenha-se de grandes movimentos na direção lateral ou vertical que poderiam danificar desnecessariamente os axônios dentro da fatia. Coloque a ponta da pipeta a pelo menos 50-100 μm de profundidade na fatia para evitar células próximas à superfície que foram danificadas durante o corte.
8. Coloque uma pipeta LFP preenchida pela ACSF no porta-tubos ligado ao micromanipulador motorizado. Aplique uma pressão positiva muito leve usando pressão bucal ou uma seringa de 1 mL conectada através de uma válvula de torneira e um curto comprimento de tubulação ao suporte da pipeta.
   NOTA: Posição Pipetas LFP dentro da fatia para registrar os sinais de interesse: no caso de ondulações de ondas acentuadas, uma pipeta LFP deve ser colocada no estrato pyramidale (SP) e uma segunda pipeta no radiador estrato (SR). Esta configuração permite gravações simultâneas da onda acentuada negativa no RS e da oscilação de ondas de alta frequência na SP (Figura 3).
9. Usando o micromanipulador, avance lentamente a ponta da pipeta LFP para a região de interesse (por exemplo, a camada de célula piramimácida CA1) em um ângulo de aproximadamente 30-45°. Coloque a ponta da pipeta a pelo menos 50-100 μm de profundidade na fatia para evitar células próximas à superfície que foram danificadas durante o corte. Ao avançar a pipeta LFP, ofereça continuamente um pequeno pulso de teste de tensão usando o software de aquisição e observe um aumento repentino na resistência ao eletrodo. Isso pode indicar que a pipeta foi entupida ou pressionada contra uma célula.
10. Uma vez que a pipeta LFP esteja posicionada na região de interesse, solte cuidadosamente a pressão positiva abrindo a válvula na tubulação presa ao suporte da pipeta.
11. Para registrar o LFP em um segundo local simultaneamente, repita as etapas 6.8-6.10 com uma segunda pipeta e micromanipulador.
12. Use o amplificador de microeletroda na configuração atual do grampo para registrar atividade espontânea no potencial de campo local após o uso da função de equilíbrio da ponte no software de aquisição para corrigir a resistência em série da pipeta. SwRs espontâneos aparecerão como deflexões positivas no potencial extracelular da camada sp(Figura 3).
13. Para registrar os potenciais de campo evocados, use os estimuladores conectados ao digitalizador para fornecer um pulso curto (200 dólares) de tensão quadrada através da pipeta de estimulação preenchida pela NaCL. Ajuste o mostrador de tensão de estimulação para evocar uma gama de amplitudes de resposta.

Resultados

Apresentados aqui estão gravações representativas de fatias hec preparadas como descrito neste protocolo. Após a recuperação em uma câmara de retenção de interface(Figura 1C),as fatias são transferidas individualmente para uma câmara de gravação submersa(Figura 2B). A câmara de gravação é fornecida com ACSF saturada de carbogênio usando uma bomba peristáltica(Figura 2A). A bomba primeiro atrai ACSF de um béquer d...

Discussão

Existem várias etapas neste protocolo de corte projetado para promover a saúde do tecido e favorecer o surgimento da atividade de rede naturalista espontânea: o camundongo é transcardialmente perfumado com solução de corte de sacarose resfriada; as fatias do córtex horizontal-entorhinal (HEC) são cortadas a uma espessura de 450 μm do hipocampo intermediário ou ventral; as fatias se recuperam na interface do ACSF aquecido e do ar umidificado e rico em carbogen; durante as gravações as fatias são superfundidas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	Lulzbot	LulzBot TAZ 6
Acute brain slice incubation holder	NIH 3D Print Exchange	3DPX-001623	Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma Aldrich	A9187-500MG
Ag-Cl ground pellets	Warner	64-1309, (E205)
agar	Becton, Dickinson	214530-500g
ascorbic acid	Alfa Aesar	36237
beaker (250 mL)	Kimax	14000-250
beaker (400 mL)	Kimax	14000-400
biocytin	Sigma Aldrich	B4261
blender	Oster	BRLY07-B00-NP0
Bonn scissors, small	becton, Dickinson	14184-09
borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)	Sutter Instruments	BF150-86-10HP	Fire polished capillaries are preferable.
calcium chloride solution (1 M)	G-Biosciences	R040
camera	Olympus	OLY-150
compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)	Airgas	X02OX95C2003102
compressed oxygen	Airgas	OX 200
constant voltage isolated stimulator	Digitimer Ltd.	DS2A-Mk.II
coverslips (22x50 mm)	VWR	16004-314
cyanoacrylate adhesive	Krazy Glue	KG925	Ideally use the brush-on form for precision
data acquisition software	Axograph	N/A	Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.
Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop	Dell	N/A	Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.
Digidata 1440A	Molecular Devices	1-2950-0367
digital timer	VWR	62344-641	4-channel Traceable timer
disposable absorbant pads	VWR	56616-018
dissector scissors	Fine Science Tools	14082-09
double-edge razor blades	Personna	BP9020
dual automatic temperature controller	Warner Instrument Corporation	TC-344B
dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber	N/A	N/A	The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.
equipment rack	Automate Scientific	FR-EQ70"	A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology
Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	324626-25GM
filter paper	Whatman	1004 070
fine scale	Mettler Toledo	XS204DR
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
glass petri dish (100 x 15 mm)	Corning	3160-101
glucose	Fisher Scientific	D16-1
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma Aldrich	G8877-250MG
ice buckets	Sigma Aldrich	BAM168072002-1EA
isoflurane vaporizer	General Anesthetic Services	Tec 3
lab tape	Fisher Scientific	15-901-10R
lens paper	Fisher Scientific	11-996
light source	Olympus	TH4-100
magnesium chloride solution (1 M)	Quality Biological	351-033-721EA
magnetic stir bars	Fisher Scientific	14-513-56	Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.
micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-5
micromanipulator (manual)	Scientifica	LBM-2000-00
microscope	Olympus	BX51WI
microspatula	Fine Science Tools	10089-11
monitor	Dell	2007FPb
MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier	Molecular Devices	MULTICLAMP 700B	The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)	Sigma Aldrich	H3375-25G
needle (20 gauge, 1.5 in length)	Becton, Dickinson	305176
nylon filament	YLI Wonder Invisible Thread	212-15-004	size 0.004. This cat. # is from Amazon.com
nylon mesh	Warner Instruments Corporation	64-0198
perstaltic pump	Harvard Apparatus	70-2027
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma Aldrich	P1937-1G
pipette holders	Molecular Devices	1-HL-U
platinum wire	World Precision	PT0203
polylactic acid (PLA) filament	Ultimaker	RAL 9010
potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911-500G
potassium gluconate	Sigma Aldrich	1550001-200MG
potassium hydroxide	Sigma Aldrich	60377-1KG
razor blades	VWR	55411-050
roller clamp	World Precision Instruments	14041
scale	Mettler Toledo	PM2000
scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
slice harp	Warner	SHD-26GH/2
sodium bicarbonate	Fisher Chemical	S233-500
sodium chloride	Sigma Aldrich	S9888-1KG
sodium phosphate monobasic anhydrous	Fisher Chemical	S369-500
sodium pyruvate	Fisher Chemical	BP356-100
spatula	VWR	82027-520
spatula/spoon, large	VWR	470149-442
sterile scalpel blades	Feather	72044-10
stirrer / hot plate	Corning	6795-220
stopcock valves, 1-way	World Precision Instruments	14054
stopcock valves, 3-way	World Precision Instruments	14036
sucrose	Acros Organics	AC177142500
support for swivel clamps	Fisher Scientific	14-679Q
surgical scissors, sharp/blunt	Fine Science Tools	14001-12
syringe (1 mL)	Becton, Dickinson	309659
syringe (60 mL with Luer-Lok tip)	Becton, Dickinson	309653
three-pronged clamp	Fisher Scientific	05-769-8Q
tissue forceps, large	Fine Science Tools	11021-15
tissue forceps, small	Fine Science Tools	11023-10
transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
tubing	Tygon	E-3603	ID 1/16 inch, OD 3/16 inch
tubing	Tygon	R-3603	ID 1/8 inch, OD 1/4 inch
vacuum grease	Dow Corning	14-635-5D
vibrating blade microtome	Leica	VT 1200S
vibration-dampening table with faraday cage	Micro-G / TMC-ametek	2536-516-4-30PE
volumetric flask (1 L)	Kimax	KIM-28014-1000
volumetric flask (2 L)	PYREX	65640-2000
warm water bath	VWR	1209