JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает подготовку горизонтальных ломтиков гиппокампа-энториналальной коры (HEC) от мышей, проявляли спонтанную резковолную рябь. Фрагменты инкубируются в упрощенном интерфейсе удерживающей камеры, а записи выполняются в условиях погружения с быстротекущей искусственной спинномозговой жидкостью для содействия оксигенации тканей и спонтанному появлению сетевой активности.

Аннотация

Острая нарезка мозга грызунов предлагает методический экспериментальный подход, чтобы получить представление об организации и функции нейронных цепей с одноклеточным разрешением с использованием электрофизиологии, микроскопии и фармакологии. Тем не менее, одним из основных соображений при разработке экспериментов in vitro является степень, в которой различные препараты ломтика повторить натуралистические модели нейронной активности, как наблюдается in vivo. В нетронутом мозге гиппокампа сеть генерирует высоко синхронизированную активность популяции, отражающую поведенческое состояние животного, о чем свидетельствуют острые волновые волновые рябь комплексов (SWRs), которые происходят во время бодрствования потребления состояний или не-REM сна. SWRs и другие формы сетевой деятельности могут возникать спонтанно в изолированных ломтиках гиппокампа при соответствующих условиях. Для того, чтобы применить мощный набор инструментов ломтик мозга для исследования активности гиппокампа сети, необходимо использовать подход, который оптимизирует здоровье тканей и сохранение функциональной связи в сети гиппокампа. Мыши транскардиально пронизаны холодной сахарозой на основе искусственной спинномозговой жидкости. Горизонтальные ломтики, содержащие гиппокамп, разрезаются толщиной 450 мкм для сохранения синаптической связи. Фрагменты восстанавливаются в камере в стиле интерфейса и передаются в погруженную камеру для записи. Камера записи предназначена для двойного поверхностного суперфузии искусственной спинномозговой жидкости с высокой скоростью потока для улучшения оксигенации ломтика. Этот протокол дает здоровую ткань, подходящую для исследования сложной и спонтанной сетевой активности in vitro.

Введение

Электрофизиологические измерения из живых ломтиков гиппокампа in vitro является мощным экспериментальным подходом с многочисленными преимуществами. Экспериментатор может использовать микроскоп, микроманипуляторы и систему записи для непосредственной визуализации и сбора измерений от отдельных нейронов в ткани. Ткань ломтики также очень доступны для фотостимуляции или доставки препарата для оптогенетических, химиогенетических или фармакологических экспериментов.

Гиппокампная сеть генерирует высокосинхронизациозную активность популяции in vivo,видимую как колебания в внеклеточном локальном полевомпотенциале 1,2,3,4,5. Методы среза мозга были использованы, чтобы получить представление о клеточных и цепных механизмов, лежащих в основе этих колебаний нейрональной сети. Основопокоительная работа Майера и др. показала, что острые волнообразные комплексы (SWRs) могут возникать спонтанно в ломтиках брюшногогиппокампа 6,7. Последующие исследования от нескольких исследователей постепенно разъяснили многие аспекты SWRs, в том числе роль нейромодуляторов в регулировании сетевого состояниягиппокампа 8,9,10 исинаптических механизмов, которые управляют в пробирке реактивации нейрональных ансамблей ранее активны во время поведения in vivo11. Эксперименты с ломтиками мозга также предоставили представление о колебаниях гамма-диапазона (30-100 Гц), отчетливом состоянии сети гиппокампа, которое, как полагают, поддерживает кодированиепамяти и напоминает 12,13. Наконец, признавая центральную роль гиппокампа и связанных с ним структур в патофизиологии эпилепсиивисочной доли 14,15, исследователи использовали гиппокампа ломтик препаратов для исследования поколения и распространения эпилептиформной активности. Картер и др. продемонстрировали, что комбинированные ломтики гиппокампа-энторинной коры, приготовленные из хронически эпилептических животных, могут спонтанно генерировать эпилептические выделения в пробирке16. Впоследствии, Карлокай и др. исследовали механизмы, лежащие в основе эпилептиформных разрядов в ломтиках гиппокампа с помощью модифицированной искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) с измененными концентрациями ионов (снижение Mg2 или повышенныйK ) или добавленных препаратов (4AP илигабазин) 17.

Исследователи разработали многочисленные подходы гиппокампа ломтик, которые отличаются в ключевых отношениях: (1) области гиппокампа, содержащиеся в ломтик (спинной, промежуточный, или брюшной); (2) наличие или отсутствие экстрагиппокампальных тканей, таких как энторинальная кора; (3) ориентация, используемая для разреза срезов (корональный, sagittal, горизонтальный или косой); и (4) условия, при которых ткань поддерживается после нарезки (полностью погружена в ACSF или проводится на стыке ACSF и увлажненной, богатой карбогеном воздуха).

Выбор подхода к использованию нарезки должен определяться экспериментальной целью. Например, поперечные или корональные ломтики спинного гиппокампа, поддерживаемые в затопленных условиях, были использованы очень эффективно для исследования внутригиппокампальной схемы исинаптической пластичности 18,19,20. Тем не менее, такие препараты не спонтанно генерировать сетевые колебания так же легко, как ломтики из брюшногогиппокампа 21,22,23. Хотя состояние постоянной активности SWR может быть вызвано тетаной стимуляции поперечных ломтиков из спинного и брюшногогиппокампа 24, спонтанные SWRs более легко наблюдается в брюшнойломтиками 7,25.

Врожденное физиологическое и анатомическое различие между спинным и желудочковым гиппокампом подтверждается исследованиями, проведенными как in vivo, так и in vitro26. Записи у крыс показали сильно когерентные ритмы темы по всей спинной и промежуточный гиппокамп, но плохая согласованность между брюшной области и остальной частигиппокампа 27. SWRs in vivo легко размножаются между спинным и промежуточным гиппокампом, в то время как SWRs, которые происходят в брюшном гиппокампе, частоостаются местными 28. Асциальные проекции, происходящие из пирамидальных нейронов CA3, которые находятся в спинном и промежуточном гиппокампе, проецируют большие расстояния вдоль продольной оси гиппокампа. Прогнозы CA3, происходящие из вентальных регионов, остаются относительно локальными, и, таким образом, менее вероятно, будут разорваныв процессе нарезки 29,30. Таким образом, вентальные ломтики могут лучше сохранить повторяющуюся сеть, необходимую для создания синхронности популяций. Склонность желудочков к генерации спонтанной сетевой активности в пробирке может также отражать более высокую внутреннюю возбудимость пирамидальных нейронов или более слабое ГАМК ингибирование в брюшном гиппокампе по сравнению с более спиннымиобластями 31. Действительно, вентрал гиппокампа ломтики более восприимчивы к эпилептиформнойактивности 32,33. Так, во многихисследованиях спонтанных физиологических 8,9,11,24 или патологических16,34,35,36 сетевых колебаний традиционно использовался горизонтальный нарезной подход, иногда с небольшим углом в передне-затылочной направлении, что дает ломтики тканей параллельно поперечной плоскости брюшного гиппокампа.

Подключение к сети неизбежно влияет на процедуру нарезки, так как многие ячейки в срезе будут разорваны. Угол и толщина ломтика и ткани, сохраненные в препарате, следует учитывать для оптимизации подключения в схемах, представляющих интерес. Во многих исследованиях использовались горизонтальные комбинированные ломтики гиппокампа-энторинальной коры (HEC) для изучения взаимодействий между двумя структурами в контексте физиологических или патологических колебаний сети. Рот и др. выполнили двойные записи с под поля CA1 гиппокампа и слоя V медиальной энторинальной коры, чтобы продемонстрировать распространение активности SWR через срезHEC 37. Многие исследования эпилептиформной активности использовали препарат heC ломтикисследовать,как эпилептиформные разряды распространяются через кортикогиппокампальнойсети 16,35,36,38. Важно отметить, что сохранение нетронутой коркикогиппокампальной петли не является необходимым условием для спонтанных SWRs, эпилептиформных разрядов или гамма-колебаний; сетевые колебания могут быть сгенерированы в поперечных ломтиках спинного или брюшного гиппокампа без прикрепленных парагиппокампальныхтканей 21,22,23, 25,39,40,41. Более важным фактором для спонтанного поколения сетевых колебаний в гиппокампе ломтиками может быть толщина каждого ломтика, так как более толстый ломтик (400-550 мкм) сохранит больше подключения в повторяющейся сети CA2/CA321,22,25.

Хотя угловые горизонтальные ломтики HEC (вырезать с примерно 12 "угол в переднем затылочной направлении) были использованы для изучения функциональной связи кортикогиппокампальнойпетли 11,16,34,35,42, такие угловые препараты не требуются для спонтаннойсетевой активности 43,44,45. Тем не менее, использование угловой нарезки плоскости позволяет следователю выборочно сделать ломтики, которые лучше всего сохранить поперечно ориентированных ламеллы либо брюшной или промежуточный гиппокамп, в зависимости от того, вниз или вверх угол применяется (Рисунок 1). Этот подход концептуально похож на тот, который используется Papatheodoropoulos и др., 2002, который расчленил каждый гиппокамп бесплатно, а затем использовать ткани измельчитель для создания поперечных ломтиков вдоль всей спинно-вентральнойоси 21. В свете вышеупомянутых функциональных различий между брюшной и спинной-промежуточный гиппокамп, исследователи должны рассмотреть анатомическое происхождение ломтиков при разработке экспериментов или интерпретации результатов. Использование агар рампы во время процедуры нарезки является простым способом преимущественно производить ломтики либо из промежуточных или брюшной гиппокампа.

Гиппокампальные ломтики можно поддерживать либо в погруженной камере (с тканью, полностью погруженной в ACSF), либо в камере в стиле интерфейса (например, в камере Осло или Хааса, с ломтиками, покрытыми только тонкой пленкой струящихся средств массовой информации). Обслуживание интерфейса повышает оксигенацию тканей, что способствует выживанию нейронов и обеспечивает устойчивый высокий уровень межнейронной активности. Традиционно условия подводной записи используют более медленный уровень потока ACSF, который не обеспечивает адекватной оксигенации тканей для стабильного выражения колебаний сетевого уровня. В погруженных ломтиках гиппокампа карбахол-индуцированных гамма-колебанийнаблюдаются только переходно 46,47, в то время как они могут быть стабилико поддерживается винтерфейсе записи камер 10,48,49. Таким образом, многие исследования сложной спонтанной активности in vitro опирались на интерфейс записывающих камер для исследования резковолновыхволновых волновых комплексов 6,7,8,9,10,25,37,гамма-колебаний 10,13и эпилептиформнойактивности 16,38,45,47.

В камере записи в подводном стиле цель микроскопа погружения может быть использована для визуализации отдельных клеток и выборочной целевой здоровых клеток для записи. Подводный препарат также позволяет осуществлять тонкий контроль над клеточной средой, так как погружение способствует быстрому рассеиванию наркотиков или других соединений в ткани. Таким образом, модифицированная методология, при которой стабильные колебания сети поддерживаются в условиях погружения, представляет собой мощный экспериментальный подход. Этот подход является примером работы H'jos et al., в которой ломтики гиппокампа восстанавливаются в упрощенной камере холдинга в стиле интерфейса в течение нескольких часов перед передачей в модифицированную погруженную камеру записи с высокой скоростью потока ACSF (6 мл/мин) для повышения подачи кислородав ткани 12,48,49. В этих условиях в погруженной камере записи можно поддерживать высокий уровень межнейронической активности и стабильные спонтанные сетевые колебания. Этот модифицированный подход позволяет следователям выполнять визуально управляемые записи зажима цельноклеточного патча и характеризовать вклад морфологически идентифицированных типов клеток в гамма-колебания, вызванные карбахолом12. SWRs также может произойти спонтанно в погруженных ломтиков гиппокампа с быстрой скоростью потока ACSF11,48,49. Майер и др. продемонстрировали, что гиппокамп ломтики, которые восстановились в интерфейсной камере перед передачей в погруженную камеру записи надежно выставлены спонтанные SWRs, в то время как ломтики, которые восстановлены погружены в стакан перед передачей в погруженную камеру записи показали меньшие вызванные реакции поля, более низкие уровни спонтанных синаптических течений, и только очень редко выставлены спонтанные SWRs43. Schlingloff et al. использовали эту улучшенную методологию, чтобы продемонстрировать роль парвалбумин-экспрессинговых клеток корзины в генерации спонтанных SWRs44.

Следующий протокол представляет собой метод нарезки, с помощью которого спонтанно активные нейроны в горизонтальных ломтиках гиппокампа могут быть восстановлены в условиях интерфейса и впоследствии поддерживаться в погруженной камере записи, пригодной для фармакологических или оптогенетических манипуляций и визуально управляемых записей.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Колумбийском университете (AC-AAAU9451).

1. Подготовка решений

  1. Подготовка раствора для резки сахарозы для нарезки, как описано в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После подготовки 1 л раствора сахарозы, заморозить небольшое количество (примерно 100-200 мл) в лоток для льда. Эти замороженные кубики льда сахарозы будут смешаны в ледяную суспензию (см. шаг 4.3).
  2. Подготовка искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) для записи, как описано в таблице 2.
  3. Приготовьте 1 М NaCl для стимуляции пипеток путем растворения 0,05844 г NaCl в 1 мл очищенной воды, которая была отфильтрована для удаления следов металлов и других примесей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для резки сахарозы и ACSF должны быть подготовлены свежими для каждого эксперимента.

2. Подготовка агар рампы

  1. Приготовьте 4% агара (например, 2 г агара в 50 мл воды) путем растворения агар-порошка в очищенную воду, которая была отфильтрована для удаления следов металлов и других примесей. Нагрейте смесь в микроволновой печи, пока она только начинает кипеть (примерно 30-60 с). Налейте расплавленный агар в форму и дайте ему остыть и затвердеть при 4 градусов по Цельсию в холодильнике при наклоне примерно на 12 градусов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для формы, можно использовать любой стеклянный или пластиковый контейнер, установленный под углом, с достаточным расплавленным агаром налил в форме пандуса 4 см в длину и примерно 0,8 см в высоту.

3. Этап нарезки области

  1. Заполните стакан 400 мл, содержащий камеру восстановления ломтика с приблизительно 250 мл ACSF; поместите его в водяную баню, разогретую до 32 градусов по Цельсию, и начните пузыриться карбогеном (95% кислородного газа/5% углекислого газа).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заполните стакан восстановления с достаточно жидкости, чтобы поместить нейлоновую сетку удерживаемой камеры на самом поверхности раствора, так что ломтики будут проводиться на стыке теплой смеси раствора и воздуха(рисунок 1). Поместите небольшие кусочки бумаги объектива на нейлоновую сетку. Ломтики будут лежать на верхней части бумаги объектива, которая позже может быть использована для передачи ломтиков индивидуально в камеру записи (см. шаг 6.6).
  2. Поместите колбу с раствором сахарозы в ведро со льдом, чтобы охладить и начать пузыриться карбогеном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор стакана и сахарозы следует нагревать и охлаждать, соответственно, карбогеном, кипящим не менее 30 минут, прежде чем мышь помещается в изофлюрановую камеру.
  3. Вытяните лоток из готовых, замороженных кубиков сахара из морозильной камеры и поместите на скамейку, чтобы частично оттаять.
  4. Поместите половину чистого двухконечного лезвия бритвы в микротом и при необходимости откалибровать. Отложите другую половину лезвия бритвы для использования во время вскрытия.
  5. Вы запустите карбоген линии и температуры зонда в нарезке камеры и окружить льдом, чтобы охладить камеру.
  6. Приготовьте чистую скамейку или стол, покрытый двумя одноразовыми абсорбентными прокладками. Выложить все инструменты вскрытия и три куска лабораторной ленты на левой площадке, где транскардная перфузия будет выполнена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты вскрытия включают небольшие ножницы Бонна, ножницы-рассечения, большой шпатель/ложка, микроспатулу, скальпель с новым лезвием, шпателем, острыми/тупыми хирургическими ножницами, большими миппами тканей и небольшими ткани миппами (см. таблицу материалов).
  7. На другой абсорбющей площадке справа от области перфузии поместите круглый кусок фильтровальной бумаги в крышку стеклянной чашки Петри диаметром 100 мм. Поместите нижнюю часть чашки Петри рядом с крышкой и поместите линию карбогена на оба куска блюда.
  8. Используйте лезвие бритвы или скальпель, чтобы вырезать небольшой пандус агара (примерно 4 см вдоль угловой поверхности, 0,8 см в высоту, 2 см в ширину). Отрежьте кусок рампы от высокого конца и переверньте его, чтобы создать бэк-блок агара. Используйте кианоакрилат клей, чтобы прикрепить агар рампы и резервного блока на нарезку платформы и отложите в сторону.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бэк-блок агара помогает стабилизировать мозг во время нарезки и обеспечивает поверхность, на которой, чтобы вскрыть ненужные ткани из каждого ломтика(рисунок 1).

4. Перфузия транскардия

  1. Приостановить 60 мл емкостью шприца в качестве резервуара для раствора для резки сахарозы примерно на 18 дюймов над скамейкой (например, с помощью трехголового поворотного зажима на вертикальном столбе). Прикрепите трубки к нижней части резервуара, запустить трубки через зажим ролика, и подключить другой конец трубки к чистой иглы 20 G.
  2. Заполните 60 мл резервуара с примерно 30 мл охлажденной сахарозы раствора и направить карбоген линии в резервуар сахарозы постоянно пузырь перфуза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что сахароза течет через трубки и иглы без каких-либо захваченных пузырьков. Скорость потока должна быть достаточно быстрой, чтобы иметь устойчивый, непрерывный поток капающей сахарозы из иглы.
  3. Используя блендер, раздавить и смешать замороженные сахарозы в ледяной суспензии и использовать большой шпатель / ложка для распространения суспензии.
    1. Поместите небольшое количество сахарозы суспензии по краям стеклянной крышки чашки Петри. Добавьте небольшое количество сусозной суспензии на дно чашки Петри.
    2. Добавить примерно 20-30 мл сусозной суспензии в резервуар перфузионовой жидкости, хорошо смешивая его с 30 мл охлажденной жидкой сахарозы до тех пор, пока резервуар не содержит смесь очень холодной, преимущественно жидкой сахарозы с некоторым остатком замороженного раствора.
  4. Поместите мышь в камеру, соединенную с испарителем изофлюрана. С кислородом течет примерно на 2 л / мин, включите циферблат испарителя для доставки изофлюран на 5% концентрации и начать таймер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите этот таймер происходит на протяжении всего курса нарезки, чтобы оценить, как быстро ломтики получены. Процедура должна быть сделана как можно быстрее, так что нарезка завершена, и ткань восстанавливается в интерфейсной камере в течение 15-20 минут животного, ввода изофлюран камеры. Следите за мышью, чтобы обеспечить состояние глубокой анестезии. Как минимум через 5 минут мышь должна быть глубоко обезболены и не реагирует на щепотки ног.
  5. Непосредственно перед удалением мыши из изофлюрановой камеры заполните крышку чашки Петри охлажденным раствором сахарозы на глубину примерно 3-5 мм и заполните дно чашки Петри охлажденным раствором сахарозы на глубину около 1,0 см.
  6. Быстро перенесите мышь на левую абсорбянтную площадку и используйте 3 куска ленты для защиты конечностей и хвоста. Выполните задний ноготь щепотку, чтобы убедиться, что мышь не реагирует, прежде чем любой разрез выполняется. Используя большие ткани миппы и хирургические ножницы, палатка кожи и сделать продольный разрез от нижней части грудины в верхней части груди. Использование типсов подтянуть на грудину и использовать ножницы, чтобы прорезать диафрагму.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальное позиционирование мыши и первые несколько разрезов, чтобы разорвать диафрагму должны быть выполнены как можно быстрее, чтобы мышь не приходит в сознание. Для обеспечения достаточной глубины анестезии на протяжении всей процедуры, нос конус может быть помещен на мышь, чтобы доставить изофлюран во время перфузии.
  7. Используйте ножницы, чтобы прорезать грудную клетку с каждой стороны, разрезая одним большим движением к точке, где передний край встречается с телом. С типсами, качели передней части грудной клетки прочь и вверх к голове, а затем полностью удалить его с горизонтальным разрезом с помощью больших ножниц. Держите сердце на месте с помощью больших типсов и вставьте 20 G перфузионной иглы в левый желудочек. После того, как игла расположена правильно, левая сторона сердца должна быстро бледнеть, как охлажденный раствор сахарозы заполняет желудочек.
  8. Используйте небольшие ножницы расчленителя, чтобы нарезать правый атриум и позволить крови течь из кровеносной системы. Если разрезы выполняются правильно, должно быть минимальное повреждение сердца, и он должен продолжать накачки по всей перфузии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свернутые кусочки бумаги ткани могут быть использованы для wick прочь крови и раствора сахарозы от сердца и поддерживать видимость иглы перфузии во время процедуры.
  9. Убедитесь, что перфузионная игла остается на месте и не выпадают из левого желудочка. При надлежащей скорости потока и размещения, печень начнет бледнеть до светлого загара / бежевый цвет с 20-30 с.
  10. После 30-45 с, использовать большие ножницы, чтобы обезглавить мышь. Держа голову в левой руке, нажмите или очистить кожу от черепа. У хорошо пронизанного животного череп должен быть очень бледным, а мозг должен выглядеть очень светло-розового цвета (приближающегося к белому) через череп без четко видимых кровеносных сосудов.

5. Извлекайте мозг и нарежьте ломтики

  1. Используя маленькие ножницы Бонна, сделайте два бокового прорезает череп к средней линии в передней части черепа, рядом с глазами. Сделайте два дополнительных разреза по обе стороны от основания черепа.
  2. Перенесите голову на дно стеклянной чашки Петри, где она должна быть в основном погружена в охлажденный раствор сахарозы. Используйте небольшие ножницы Бонн, чтобы сократить средней линии по длине черепа, потянув вверх с ножницами, чтобы свести к минимуму повреждение основной ткани мозга. Используя небольшие ткани типсы, твердо схватить каждую сторону черепа и качели его вверх и от мозга, как открытие книги.
  3. Используйте пальцы левой руки, чтобы держать лоскуты черепа открытыми и вставить микроспатулы под мозг возле обонятельных луковиц. Переверните мозг из черепа в сахарозу и используйте микроспатулу, чтобы разорвать ствол мозга. Вымойте мозг, чтобы удалить остатки крови, меха или других тканей.
  4. Используйте большой шпатель / ложка для передачи мозга на крышку стеклянной чашки Петри. С другой половиной обоюдоострый лезвие бритвы ранее отложить, сделать два корональных сокращений, чтобы сначала удалить мозжечок, а затем наиболее передней части мозга, в том числе обонятельные луковицы (Рисунок 1).
  5. Нанесите клей цианоакрилата на агар-рампу. Очень кратко поместите мозг на кусок сухой фильтровальной бумаги с помощью больших ткани типсов, а затем немедленно передать его на агар рампы, размещение брюшной поверхности мозга на клей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для ломтиков промежуточного гиппокампа, мозг должен быть ориентирован с передней лицом вверх по склону рампы, и задний ближе к лезвию. Для ломтиков брюшного гиппокампа, сориентировать мозг с переднего конца указал вниз по склону рампы, с задней части в верхней части рампы, дальше от лезвия. В любом случае, мозг должен быть расположен в верхней части рампы, так что коронально вырезать поверхность мозга контактов агар резервного блока (Рисунок 1).
  6. Поместите нарезку платформы с агаром и мозгом в нарезку камеры микротомы и полностью погрузитесь с охлажденным раствором сахарозы. Используйте большой шпатель / ложка для передачи некоторых сусозы суспензии в камеру, помешивая, чтобы расплавить любую замороженную сахарозу и быстро снизить температуру смеси до 1-2 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за датчиком температуры на протяжении всей нарезки. Если раствор сахарозы нагревается выше 3 градусов по Цельсию, добавьте больше суспензии и перемешайте, чтобы снизить температуру.
  7. Нарежьте ломтики толщиной 450 мкм со скоростью микротома до 0,07 мм/с. Как каждый ломтик освобождается, использовать небольшие ткани типсов и острый скальпель, чтобы сначала отделить два полушария, а затем отрезать ткани, пока ломтик состоит в основном из гиппокампа и парагиппокампа регионов (Рисунок 1).
  8. Используйте пластиковую трубку передачи для передачи ломтиков индивидуально в камеру восстановления интерфейса, гарантируя, что они расположены на интерфейсе ACSF и воздуха только с тонким мениска ACSF покрытие ломтиков. Плотно закройте крышку камеры и дайте ломтикам восстановиться при 32 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
  9. После первоначального восстановления при 32 градусов по Цельсию, довести интерфейс восстановления камеры из водяной ванны и место на мешалку набор на медленной скорости, так что магнитный бар перемешать способствует циркуляции ACSF в камере. Дайте ему постепенно остыть до комнатной температуры, как ломтики восстановить в течение дополнительных 90 минут. Убедитесь, что восстановительная камера постоянно пузырилась карбогеном и не позволяла крупным пузырькам попасть в ловушку под ломтиками.

6. Выполнить локальный полевой потенциал (LFP) записи спонтанной активности

  1. Подготовьтесь к записям LFP, включив все необходимое оборудование, включая компьютер, работающий с программным обеспечением приобретения, монитор, подключенный к компьютеру, стимуляторы, микроманипулятор, контроллер температуры, источник света микроскопа, камеру, прикрепленную к микроскопу, усилитель микроэлектрода, дигитайзер и перистальтический насос. При использовании центральной вакуумной системы откройте настенный клапан для подготовки вакуумной линии, которая будет удалять ACSF из камеры записи.
  2. Заполните нагретый резервуар с ACSF, а затем поместите один конец трубки в стакан 400 мл, содержащий кипящий ACSF. Включите перистальтический насос, чтобы направить ACSF от стакана 400 мл к нагретому резервуару, и от резервуара далее к камере записи. Нажмите или ущипнуть трубки, чтобы освободить любые захваченных пузырьков.
  3. Отрегулируйте перистальтический насос, чтобы скорость потока ACSF через камеру записи была быстрой (8-10 мл/мин). Используйте температурный зонд, чтобы убедиться, что ACSF составляет 32 градуса по Цельсию в центре камеры записи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ACSF доставляется в камеру записи с помощью перистальтического насоса, высокая скорость потока может привести к значительному колебательности скорости потока. Последовательные темпы потока могут быть достигнуты с помощью простого демпфера пульсации, состоящего из серии пустых шприцев, интегрированных в трубки(рисунок 2).
  4. Подготовка стимуляции и записи пипетки из borosilicate стеклянные капилляры с помощью подогревом нити шкив. Протокол шкива должен быть настроен для получения пипеток с сопротивлением 2-3 MOhm для стимуляции или локального поля потенциальных электродов записи.
  5. Заполните стимуляции пипетки с 1 M NaCl и LFP пипетки с ACSF.
  6. Кратко зажим труб и выключите насос, чтобы приостановить поток ACSF. Передача ломтик в камеру записи с помощью тонкой типсов, чтобы схватить угол бумаги объектива ломтик лежит на-ломтик будет придерживаться объектива бумаги. Поместите бумагу объектива и нарежьте в камеру записи с ломтиком лицом вниз, а затем "очистить" от объектива бумаги оставляя ломтик погружен в камеру записи. Закрепите ломтик с помощью арфы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Арфы можно приобрести предварительно сделанные или сделанные в лаборатории с использованием U-образного куска нержавеющей стали или платины и тонкой нейлоновой нити.
  7. Поместите заполненный NaCl стимуляцию пипетку в ручной микроманипулятор и медленно перемотка кончика пипетки на поверхность ломтика (например, в слой излучения слоя) под углом примерно 30-45 ". После того, как кончик пипетки попадает в ткань, заранее пипетки вперед медленно и воздерживаться от больших движений в боковом или вертикальном направлении, которые могут излишне повредить аксоны в ломтик. Поместите кончик пипетки по крайней мере 50-100 мкм глубоко в ломтик, чтобы избежать клеток вблизи поверхности, которые были повреждены во время нарезки.
  8. Поместите заполненный ACSF пипетки LFP в держатель пипетки, прикрепленный к моторизованной микроманипулятору. Применить очень легкое положительное давление, используя либо давление рта или 1 мл шприц подключен через клапан стопкок и короткая длина трубки для держателя пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Позиция LFP пипетки в ломтик для того, чтобы записать сигналы интереса: в случае резкой волновой рябь, один LFP пипетки должны быть помещены в слой pyramidale (SP) и второй пипетки в слой излучения (SR). Эта конфигурация позволяет одновременно записывать отрицательную резкую волну в SR и высокочастотные колебания рябь в SP(рисунок 3).
  9. С помощью микроманипулятора медленно продвигают кончик пипетки LFP в область интереса (например, пирамидальный клеточный слой CA1) под углом примерно 30–45 градусов. Поместите кончик пипетки по крайней мере 50-100 мкм глубоко в ломтик, чтобы избежать клеток вблизи поверхности, которые были повреждены во время нарезки. Продвигаясь по трубе LFP, постоянно доставьте небольшой импульс теста напряжения с помощью программного обеспечения для приобретения и наблюдайте за внезапным увеличением сопротивления электродов. Это может свидетельствовать о том, что пипетка была забита или прижата к ячейке.
  10. После того, как LFP пипетка расположена в области интереса, осторожно отпустите положительное давление, открыв клапан на трубе, прикрепленной к держатель пипетки.
  11. Чтобы записать LFP во втором месте одновременно, повторите шаги 6.8-6.10 со второй пипеткой и микроманипулятором.
  12. Используйте усилитель микроэлектрода в текущей конфигурации зажима для записи спонтанной активности в локальном полевом потенциале после использования функции баланса моста в программном обеспечении приобретения для коррекции сопротивления серии пипетки. Спонтанные SWRs будут отображаться как положительные отклонения во внеклеточном потенциале слоя SP(рисунок 3).
  13. Для записи вызванных полевых потенциалов используйте стимуляторы, подключенные к дигитайзеру, чтобы доставить короткий (200 нас) импульс квадратного напряжения через заполненный NaCl стимуляцию пипетку. Отрегулируйте циферблат напряжения стимуляции, чтобы вызвать целый ряд амплитуд реакции.

Результаты

Здесь представлены репрезентативные записи из срезов HEC, подготовленные, как описано в этом протоколе. После восстановления в камере холдинга интерфейса(рисунок 1C),ломтики переносятся индивидуально в погруженную камеру записи(рисунок 2B). Камера записи ?...

Обсуждение

Есть несколько шагов в этом протоколе нарезки, направленных на содействие здоровью тканей и способствовать появлению спонтанной натуралистической сетевой активности: мышь транскардиально пронизана охлажденным раствором для резки сахарозы; ломтики горизонтально-энторинной коры (HEC) ...

Раскрытие информации

Автору нечего разглашать.

Благодарности

Автор хотел бы поблагодарить Стива Сигелбаума за поддержку. Финансирование осуществляется 5R01NS106983-02, а также 1 F31 NS113466-01.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3D printerLulzbotLulzBot TAZ 6
Acute brain slice incubation holderNIH 3D Print Exchange3DPX-001623Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
Adenosine 5′-triphosphate magnesium saltSigma AldrichA9187-500MG
Ag-Cl ground pelletsWarner64-1309, (E205)
agarBecton, Dickinson214530-500g
ascorbic acidAlfa Aesar36237
beaker (250 mL)Kimax14000-250
beaker (400 mL)Kimax14000-400
biocytinSigma AldrichB4261
blenderOsterBRLY07-B00-NP0
Bonn scissors, smallbecton, Dickinson14184-09
borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)Sutter InstrumentsBF150-86-10HPFire polished capillaries are preferable.
calcium chloride solution (1 M)G-BiosciencesR040
cameraOlympusOLY-150
compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)AirgasX02OX95C2003102
compressed oxygenAirgasOX 200
constant voltage isolated stimulatorDigitimer Ltd.DS2A-Mk.II
coverslips (22x50 mm)VWR16004-314
cyanoacrylate adhesiveKrazy GlueKG925Ideally use the brush-on form for precision
data acquisition softwareAxographN/AAny equivalent software (e.g. pClamp) would work.
Dell Precision T1500 Tower Workstation DesktopDellN/ACatalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.
Digidata 1440AMolecular Devices1-2950-0367
digital timerVWR62344-6414-channel Traceable timer
disposable absorbant padsVWR56616-018
dissector scissorsFine Science Tools14082-09
double-edge razor bladesPersonnaBP9020
dual automatic temperature controllerWarner Instrument CorporationTC-344B
dual-surface or laminar-flow optimized recording chamberN/AN/AThe chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.
equipment rackAutomate ScientificFR-EQ70"A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology
Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA)Sigma Aldrich324626-25GM
filter paperWhatman1004 070
fine scaleMettler ToledoXS204DR
Flaming/Brown micropipette pullerSutter InstrumentsP-97
glass petri dish (100 x 15 mm)Corning3160-101
glucoseFisher ScientificD16-1
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrateSigma AldrichG8877-250MG
ice bucketsSigma AldrichBAM168072002-1EA
isoflurane vaporizerGeneral Anesthetic ServicesTec 3
lab tapeFisher Scientific15-901-10R
lens paperFisher Scientific11-996
light sourceOlympusTH4-100
magnesium chloride solution (1 M)Quality Biological351-033-721EA
magnetic stir barsFisher Scientific14-513-56Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.
micromanipulatorLuigs & NeumannSM-5
micromanipulator (manual)ScientificaLBM-2000-00
microscopeOlympusBX51WI
microspatulaFine Science Tools10089-11
monitorDell2007FPb
MultiClamp 700B Microelectrode AmplifierMolecular DevicesMULTICLAMP 700BThe MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)Sigma AldrichH3375-25G
needle (20 gauge, 1.5 in length)Becton, Dickinson305176
nylon filamentYLI Wonder Invisible Thread212-15-004size 0.004. This cat. # is from Amazon.com
nylon meshWarner Instruments Corporation64-0198
perstaltic pumpHarvard Apparatus70-2027
Phosphocreatine di(tris) saltSigma AldrichP1937-1G
pipette holdersMolecular Devices1-HL-U
platinum wireWorld PrecisionPT0203
polylactic acid (PLA) filamentUltimakerRAL 9010
potassium chlorideSigma AldrichP3911-500G
potassium gluconateSigma Aldrich1550001-200MG
potassium hydroxideSigma Aldrich60377-1KG
razor bladesVWR55411-050
roller clampWorld Precision Instruments14041
scaleMettler ToledoPM2000
scalpel handleFine Science Tools10004-13
slice harpWarnerSHD-26GH/2
sodium bicarbonateFisher ChemicalS233-500
sodium chlorideSigma AldrichS9888-1KG
sodium phosphate monobasic anhydrousFisher ChemicalS369-500
sodium pyruvateFisher ChemicalBP356-100
spatulaVWR82027-520
spatula/spoon, largeVWR470149-442
sterile scalpel bladesFeather72044-10
stirrer / hot plateCorning6795-220
stopcock valves, 1-wayWorld Precision Instruments14054
stopcock valves, 3-wayWorld Precision Instruments14036
sucroseAcros OrganicsAC177142500
support for swivel clampsFisher Scientific14-679Q
surgical scissors, sharp/bluntFine Science Tools14001-12
syringe (1 mL)Becton, Dickinson309659
syringe (60 mL with Luer-Lok tip)Becton, Dickinson309653
three-pronged clampFisher Scientific05-769-8Q
tissue forceps, largeFine Science Tools11021-15
tissue forceps, smallFine Science Tools11023-10
transfer pipettesFisher Scientific13-711-7M
tubingTygonE-3603ID 1/16 inch, OD 3/16 inch
tubingTygonR-3603ID 1/8 inch, OD 1/4 inch
vacuum greaseDow Corning14-635-5D
vibrating blade microtomeLeicaVT 1200S
vibration-dampening table with faraday cageMicro-G / TMC-ametek2536-516-4-30PE
volumetric flask (1 L)KimaxKIM-28014-1000
volumetric flask (2 L)PYREX65640-2000
warm water bathVWR1209
 

Ссылки

  1. Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
  2. Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
  3. Buzsáki, G., Horváth, Z., Urioste, R., Hetke, J., Wise, K. High-frequency network oscillation in the hippocampus. Science. 256, 1025-1027 (1992).
  4. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
  5. Buzsáki, G. Hippocampal sharp wave-ripple: A cognitive biomarker for episodic memory and planning. Hippocampus. 25, 1073 (2015).
  6. Maier, N., et al. Reduction of high-frequency network oscillations (ripples) and pathological network discharges in hippocampal slices from connexin 36-deficient mice. Journal of Physiology. 541, 521-528 (2002).
  7. Maier, N., Nimmrich, V., Draguhn, A. Cellular and network mechanisms underlying spontaneous sharp wave-ripple complexes in mouse hippocampal slices. Journal of Physiology. 550, 873-887 (2003).
  8. ul Haq, R., et al. Adrenergic modulation of sharp wave-ripple activity in rat hippocampal slices. Hippocampus. 22, 516-533 (2012).
  9. ul Haq, R., et al. Serotonin dependent masking of hippocampal sharp wave ripples. Neuropharmacology. 101, 188-203 (2016).
  10. Maier, P., Kaiser, M. E., Grinevich, V., Draguhn, A., Both, M. Differential effects of oxytocin on mouse hippocampal oscillations in vitro. European Journal of Neuroscience. 44, 2885-2898 (2016).
  11. Mizunuma, M., et al. Unbalanced excitability underlies offline reactivation of behaviorally activated neurons. Nature Neuroscience. 17, 503-505 (2014).
  12. Hájos, N., et al. Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal gamma oscillations in vitro. Journal of Neuroscience. 24, 9127-9137 (2004).
  13. Geschwill, P., et al. Synchronicity of excitatory inputs drives hippocampal networks to distinct oscillatory patterns. Hippocampus. , (2020).
  14. Rutecki, P. A., Grossmann, R. G., Armstrong, D., Irish-Loewen, S. Electrophysiological connections between the hippocampus and entorhinal cortex in patients with complex partial seizures. Journal of Neurosurgery. 70, 667-675 (1989).
  15. Lothman, E. W., Bertram, E. H., Stringer, J. L. Functional anatomy of hippocampal seizures. Progress in Neurobiology. 37, 1-82 (1991).
  16. Carter, D. S., Deshpande, L. S., Rafiq, A., Sombati, S., Delorenzo, R. J. Characterization of spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampal - cortical slices prepared from chronic epileptic animals. Seizure: European Journal of Epilepsy. 20, 218-224 (2011).
  17. Karlócai, M. R., et al. Physiological sharp wave-ripples and interictal events in vitro: What's the difference. Brain. 137, 463-485 (2014).
  18. Leroy, F., et al. Input-timing-dependent plasticity in the hippocampal CA2 region and its potential role in social memory. Neuron. 95, 1089-1102 (2017).
  19. Sun, Q., et al. Proximodistal heterogeneity of hippocampal CA3 pyramidal neuron intrinsic properties, connectivity, and reactivation during memory recall. Neuron. 95, 656-672 (2017).
  20. Masurkar, A. V., et al. Medial and lateral entorhinal cortex differentially excite deep versus superficial CA1 pyramidal neurons. Cell Reports. 18, 1-13 (2017).
  21. Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous, low frequency (∼2-3 Hz) field activity generated in rat ventral hippocampal slices perfused with normal medium. Brain Research Bulletin. 57, 187-193 (2002).
  22. Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous GABAA-dependent synchronous periodic activity in adult rat ventral hippocampal slices. Neuroscience Letters. 319, 17-20 (2002).
  23. Kubota, D., Colgin, L. L., Casale, M., Brucher, F. A., Lynch, G. Endogenous waves in hippocampal slices. Journal of Neurophysiology. 89, 81-89 (2003).
  24. Behrens, C. J., Van Den Boom, L. P., De Hoz, L., Friedman, A., Heinemann, U. Induction of sharp wave - complexes in vitro and reorganization of hippocampal networks. Nature Neuroscience. 8, 1560-1567 (2005).
  25. Kouvaros, S., Papatheodoropoulos, C. Prominent differences in sharp waves, ripples and complex spike bursts between the dorsal and the ventral rat hippocampus. Neuroscience. 352, 131-143 (2017).
  26. Strange, B. A., Witter, M. P., Lein, E. S., Moser, E. I. Functional organization of the hippocampal longitudinal axis. Nature Reviews Neuroscience. 15, 655-669 (2014).
  27. Patel, J., Fujisawa, S., Berényi, A., Royer, S., Buzsáki, G. Traveling Theta Waves along the Entire Septotemporal Axis of the Hippocampus. Neuron. 75, 410-417 (2012).
  28. Patel, J., Schomburg, E. W., Berényi, A., Fujisawa, S., Buzsáki, G. Local generation and propagation of ripples along the septotemporal axis of the hippocampus. Journal of Neuroscience. 33, 17029-17041 (2013).
  29. Fricke, R., Cowan, W. M. An autoradiographic study of the commissural and ipsilateral hippocampo-dentate projections in the adult rat. Journal of Comparative Neurology. 181, 253-269 (1978).
  30. Ishizuka, N. O. R., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 623, 580-623 (1990).
  31. Papatheodoropoulos, C. Electrophysiological evidence for long-axis intrinsic diversification of the hippocampus. Frontiers in Bioscience - Landmark. 23, 109-145 (2018).
  32. Gilbert, M., Racine, R. J., Smith, G. K. Epileptiform burst responses in ventral vs dorsal hippocampal slices. Brain Research. 361, 389-391 (1985).
  33. Papatheodoropoulos, C., Moschovos, C., Kostopoulos, G. Greater contribution of N-methyl-D-aspartic acid receptors in ventral compared to dorsal hippocampal slices in the expression and long-term maintenance of epileptiform activity. Neuroscience. 135, 765-779 (2005).
  34. Jones, R. S. G., Heinemann, U. Synaptic and intrinsic responses of medial entorhinal cortical cells in normal and magnesium-free medium in vitro. Journal of Neurophysiology. 59, (1988).
  35. Rafiq, A., Delorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex / hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70, 1962-1974 (1993).
  36. Stoop, R., Pralong, E. Functional connections and epileptic spread between hippocampus, entorhinal cortex and amygdala in a modified horizontal slice preparation of the rat brain. European Journal of Neuroscience. 12, 3651-3663 (2000).
  37. Roth, F. C., Beyer, K. M., Both, M., Draguhn, A., Egorov, A. V. Downstream effects of hippocampal sharp wave ripple oscillations on medial entorhinal cortex layer V neurons in vitro. Hippocampus. 26, 1493-1508 (2016).
  38. Bertsche, A., Bruehl, C., Pietz, J., Draguhn, A. Region- and pattern-specific effects of glutamate uptake blockers on epileptiform activity in rat brain slices. Epilepsy Research. 88, 118-126 (2010).
  39. Wu, C., Shen, H., Luk, W. P., Zhang, L. A fundamental oscillatory state of isolated rodent hippocampus. Journal of Physiology. 540, 509-527 (2002).
  40. Colgin, L. L., Jia, Y., Sabatier, J. M., Lynch, G. Blockade of NMDA receptors enhances spontaneous sharp waves in rat hippocampal slices. Neuroscience Letters. 385, 46-51 (2005).
  41. Ellender, T. J., Nissen, W., Colgin, L. L., Mann, E. O., Paulsen, O. Priming of hippocampal population bursts by individual perisomatic-targeting interneurons. The Journal of Neuroscience. 30, 5979-5991 (2010).
  42. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A. Comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 1-17 (2017).
  43. Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4, 6925 (2009).
  44. Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. Journal of Neuroscience. 34, 11385-11398 (2014).
  45. McCloskey, D. P., Scharfman, H. E. Progressive, potassium-sensitive epileptiform activity in hippocampal area CA3 of pilocarpine-treated rats with recurrent seizures. Epilepsy Research. 97, 92-102 (2011).
  46. McMahon, L. L., Williams, J. H., Kauer, J. A. Functionally distinct groups of interneurons identified during rhythmic carbachol oscillations in hippocampus in vitro. Journal of Neuroscience. 18, 5640-5651 (1998).
  47. Pöschel, B., Heinemann, U., Draguhn, A. High frequency oscillations in the dentate gyrus of rat hippocampal slices induced by tetanic stimulation. Brain Research. 959, 320-327 (2003).
  48. Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29, 319-327 (2009).
  49. Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183, 107-113 (2009).
  50. Dengler, C. G., Yue, C., Takano, H., Coulter, D. A. Massively augmented hippocampal dentate granule cell activation accompanies epilepsy development. Nature Publishing Group. , 1-17 (2017).
  51. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N -methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. 132, 1-13 (2018).
  52. Westerhof, N., Lankhaar, J. W., Westerhof, B. E. The arterial windkessel. Medical and Biological Engineering and Computing. 47, 131-141 (2009).
  53. Shi, W. X., Bunney, B. S. A small volume chamber for electrical recording from submerged brain slices and a pulse-free medium supply system using a peristalic pump. Journal of Neuroscience Methods. 35, 235-240 (1990).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

162

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены