Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi

Özet

Bu protokol, spontan keskin dalga dalgalanma aktivitesi sergileyen farelerden yatay hipokampal-entorhinal korteks (HEC) dilimlerinin hazırlanmasını açıklar. Dilimler basitleştirilmiş bir arayüz tutma odasında inkübe edilir ve kayıtlar, doku oksijenlenmesini ve ağ düzeyinde aktivitenin kendiliğinden ortaya çıkmasını teşvik etmek için hızlı akan yapay beyin omurilik sıvısı ile su altında koşullar altında gerçekleştirilir.

Özet

Akut kemirgen beyin dilimlemesi, elektrofizyoloji, mikroskopi ve farmakoloji kullanarak tek hücreli çözünürlükle sinir devrelerinin organizasyonu ve işlevi hakkında fikir edinmek için çekişli deneysel bir yaklaşım sunar. Bununla birlikte, in vitro deneylerin tasarımında önemli bir husus, farklı dilim preparatlarının in vivo olarak gözlemlendiği gibi doğal sinirsel aktivite kalıplarını ne ölçüde yeniden özetlediğidir. Sağlam beyinde, hipokampal ağ, uyanık tüketici durumlar veya REM olmayan uyku sırasında meydana gelen keskin dalga dalgalanma komplekslerinin (SWR' ler) örneklediği gibi, hayvanın davranışsal durumunu yansıtan yüksek oranda senkronize popülasyon aktivitesi oluşturur. SWR'ler ve diğer ağ aktivitesi biçimleri, uygun koşullar altında izole hipokampal dilimlerde kendiliğinden ortaya çıkabilir. Hipokampal ağ aktivitesinin araştırılmasına güçlü beyin dilimi araç setini uygulamak için, doku sağlığını ve hipokampal ağ içindeki fonksiyonel bağlantının korunmasını optimize eden bir yaklaşım kullanmak gerekir. Fareler transkardiyal olarak soğuk sakkaroz bazlı yapay beyin omurilik sıvısı ile perfüzyona edilir. Hipokampus içeren yatay dilimler, sinaptik bağlantıyı korumak için 450 μm kalınlığında kesilir. Dilimler arabirim stili bir bölmede kurtarılır ve kayıtlar için batık bir odaya aktarılır. Kayıt odası, dilimin oksijenlenmesini iyileştirmek için yapay beyin omurilik sıvısının yüksek akış hızında çift yüzeyli süperfüzyonu için tasarlanmıştır. Bu protokol, karmaşık ve spontan ağ aktivitesinin in vitro araştırılmasına uygun sağlıklı doku sağlar.

Giriş

Canlı hipokampal dilimlerden in vitro elektrofizyolojik ölçüm, sayısız avantajı olan güçlü bir deneysel yaklaşımdır. Deneyci, dokudaki bireysel nöronlardan ölçümleri doğrudan görselleştirmek ve toplamak için bir mikroskop, mikromanipülatörler ve bir kayıt sistemi kullanabilir. Doku dilimleri ayrıca optogenetik, kemogenetik veya farmakolojik deneyler için fotostimülasyon veya ilaç teslimatı için çok erişilebilir.

Hipokampal ağ, hücredışı yerel alan potansiyeli 1 ,²,^3,4,5'tesalınımlar ol....

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (AC-AAAU9451) tarafından onaylanmıştır.

1. Çözümler hazırlayın

1. Tablo 1'de açıklandığı gibi dilimleme için sakkaroz kesme çözeltisi hazırlayın.
   NOT: 1 L sakkaroz çözeltisi hazırladıktan sonra, bir buz tepsisinde az miktarda (yaklaşık 100-200 mL) dondurun. Bu donmuş sakkaroz buz küpleri buzlu bir bulamaç içine karıştırılacaktır (bkz. adım 4.3).
2. Tablo 2'de açıklandığı gibi kayıt için yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) hazırlayın.
3. eser metalleri ve diğer safsızlıkları....

Sonuçlar

Burada, bu protokolde açıklandığı gibi hazırlanan HEC dilimlerinden temsili kayıtlar sunulmaktadır. Bir arayüz tutma odasında kurtarmadan sonra (Şekil 1C), dilimler tek tek su altında bir kayıt odasına aktarılır (Şekil 2B). Kayıt odası, peristaltik bir pompa kullanılarak karbojen doymuş ACSF ile birlikte verilir (Şekil 2A). Pompa ilk olarak ACSF'yi bir tutma kabından ısıtılmış bir hazneye çeker. Karbojen.......

Tartışmalar

Doku sağlığını teşvik etmek ve spontan doğal ağ aktivitesinin ortaya çıkmasını desteklemek için tasarlanmış bu dilimleme protokolünde birkaç adım vardır: fare transkardiyel olarak soğutulmuş sakkaroz kesme çözeltisi ile perfüzyona sahiptir; yatay-entorhinal korteks (HEC) dilimleri ara veya ventral hipokampustan 450 μm kalınlığında kesilir; dilimler ısıtılmış ACSF ve nemlendirilmiş, karbojen bakımından zengin hava arayüzünde iyileşir; kayıt sırasında dilimler ACSF ile 32 ° C'ye .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	Lulzbot	LulzBot TAZ 6
Acute brain slice incubation holder	NIH 3D Print Exchange	3DPX-001623	Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma Aldrich	A9187-500MG
Ag-Cl ground pellets	Warner	64-1309, (E205)
agar	Becton, Dickinson	214530-500g
ascorbic acid	Alfa Aesar	36237
beaker (250 mL)	Kimax	14000-250
beaker (400 mL)	Kimax	14000-400
biocytin	Sigma Aldrich	B4261
blender	Oster	BRLY07-B00-NP0
Bonn scissors, small	becton, Dickinson	14184-09
borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)	Sutter Instruments	BF150-86-10HP	Fire polished capillaries are preferable.
calcium chloride solution (1 M)	G-Biosciences	R040
camera	Olympus	OLY-150
compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)	Airgas	X02OX95C2003102
compressed oxygen	Airgas	OX 200
constant voltage isolated stimulator	Digitimer Ltd.	DS2A-Mk.II
coverslips (22x50 mm)	VWR	16004-314
cyanoacrylate adhesive	Krazy Glue	KG925	Ideally use the brush-on form for precision
data acquisition software	Axograph	N/A	Any equivalent software (e.g. pClamp) would work.
Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop	Dell	N/A	Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.
Digidata 1440A	Molecular Devices	1-2950-0367
digital timer	VWR	62344-641	4-channel Traceable timer
disposable absorbant pads	VWR	56616-018
dissector scissors	Fine Science Tools	14082-09
double-edge razor blades	Personna	BP9020
dual automatic temperature controller	Warner Instrument Corporation	TC-344B
dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber	N/A	N/A	The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.
equipment rack	Automate Scientific	FR-EQ70"	A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology
Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA)	Sigma Aldrich	324626-25GM
filter paper	Whatman	1004 070
fine scale	Mettler Toledo	XS204DR
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instruments	P-97
glass petri dish (100 x 15 mm)	Corning	3160-101
glucose	Fisher Scientific	D16-1
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma Aldrich	G8877-250MG
ice buckets	Sigma Aldrich	BAM168072002-1EA
isoflurane vaporizer	General Anesthetic Services	Tec 3
lab tape	Fisher Scientific	15-901-10R
lens paper	Fisher Scientific	11-996
light source	Olympus	TH4-100
magnesium chloride solution (1 M)	Quality Biological	351-033-721EA
magnetic stir bars	Fisher Scientific	14-513-56	Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.
micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-5
micromanipulator (manual)	Scientifica	LBM-2000-00
microscope	Olympus	BX51WI
microspatula	Fine Science Tools	10089-11
monitor	Dell	2007FPb
MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier	Molecular Devices	MULTICLAMP 700B	The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)	Sigma Aldrich	H3375-25G
needle (20 gauge, 1.5 in length)	Becton, Dickinson	305176
nylon filament	YLI Wonder Invisible Thread	212-15-004	size 0.004. This cat. # is from Amazon.com
nylon mesh	Warner Instruments Corporation	64-0198
perstaltic pump	Harvard Apparatus	70-2027
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma Aldrich	P1937-1G
pipette holders	Molecular Devices	1-HL-U
platinum wire	World Precision	PT0203
polylactic acid (PLA) filament	Ultimaker	RAL 9010
potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911-500G
potassium gluconate	Sigma Aldrich	1550001-200MG
potassium hydroxide	Sigma Aldrich	60377-1KG
razor blades	VWR	55411-050
roller clamp	World Precision Instruments	14041
scale	Mettler Toledo	PM2000
scalpel handle	Fine Science Tools	10004-13
slice harp	Warner	SHD-26GH/2
sodium bicarbonate	Fisher Chemical	S233-500
sodium chloride	Sigma Aldrich	S9888-1KG
sodium phosphate monobasic anhydrous	Fisher Chemical	S369-500
sodium pyruvate	Fisher Chemical	BP356-100
spatula	VWR	82027-520
spatula/spoon, large	VWR	470149-442
sterile scalpel blades	Feather	72044-10
stirrer / hot plate	Corning	6795-220
stopcock valves, 1-way	World Precision Instruments	14054
stopcock valves, 3-way	World Precision Instruments	14036
sucrose	Acros Organics	AC177142500
support for swivel clamps	Fisher Scientific	14-679Q
surgical scissors, sharp/blunt	Fine Science Tools	14001-12
syringe (1 mL)	Becton, Dickinson	309659
syringe (60 mL with Luer-Lok tip)	Becton, Dickinson	309653
three-pronged clamp	Fisher Scientific	05-769-8Q
tissue forceps, large	Fine Science Tools	11021-15
tissue forceps, small	Fine Science Tools	11023-10
transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-7M
tubing	Tygon	E-3603	ID 1/16 inch, OD 3/16 inch
tubing	Tygon	R-3603	ID 1/8 inch, OD 1/4 inch
vacuum grease	Dow Corning	14-635-5D
vibrating blade microtome	Leica	VT 1200S
vibration-dampening table with faraday cage	Micro-G / TMC-ametek	2536-516-4-30PE
volumetric flask (1 L)	Kimax	KIM-28014-1000
volumetric flask (2 L)	PYREX	65640-2000
warm water bath	VWR	1209