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要約

このプロトコルは、自発的な鋭波波リップル活性を示すマウスからの水平海馬内皮質(HEC)スライスの調製を記述する。スライスは、簡略化されたインターフェース保持室でインキュベートされ、記録は、組織の酸素化とネットワークレベルの活動の自発的な出現を促進するために、流れの速い人工脳脊髄液と水没条件下で行われます。

要約

急性げっ歯類の脳スライスは、電気生理学、顕微鏡法、薬理学を用いた単細胞分解能を用いた神経回路の組織と機能に関する洞察を得るための、難解な実験的アプローチを提供します。しかし、 インビトロ 実験の設計における大きな考慮事項は、異なるスライス調製物が 、生体内で 観察される神経活動の自然主義的パターンをどの程度再現するかを示す。無傷の脳では、海馬ネットワークは、覚めの完了状態または非レム睡眠中に起こる鋭波波性複合体(SRS)によって例示されるように、動物の行動状態を反映する高度に同期した集団活動を生成する。SRSおよび他の形態のネットワーク活動は、適切な条件下で孤立した海馬スライス中に自発的に出現する可能性がある。強力な脳スライスツールキットを海馬ネットワーク活動の調査に適用するためには、組織の健康と海馬ネットワーク内の機能的な接続性の維持を最適化するアプローチを利用する必要があります。マウスは、経皮的に冷たいショ糖ベースの人工脳脊髄液と浸透する。海馬を含む水平スライスは、シナプス接続性を維持するために450 μmの厚さで切断されます。スライスはインターフェイススタイルのチャンバで回復し、記録のために水没した部屋に移される。記録室はスライスの酸素化を改善するために高流量の人工脳脊髄液の二重表面の重ね合たちのために設計されている。このプロトコルは、複雑で自発的なネットワーク活動の調査に適した健康な組織 をvitroで生成します。

概要

生体外の生きた海馬スライスからの電気生理学的測定は、多くの利点を有する強力な実験的アプローチである。実験者は顕微鏡、マイクロマニピュレーター、および記録システムを使用して、組織内の個々のニューロンから測定値を直接可視化し、収集することができます。組織スライスは光遺伝学的、化学遺伝学的、または薬理学的実験のための光刺激または薬物送達にも非常にアクセス可能である。

海馬ネットワークは、生体内で高度に同期的な集団活動を生成し、細胞外局所的なフィールドポテンシャル1、2、3、4、5の振動として見える。脳スライス法は、これらの神経ネットワーク振動の根底にある細胞および回路メカニズムに関する洞察を得るために活用されてきた。Maierらの基礎的な研究は、鋭波波波紋成(SRS)が腹側海馬6,7のスライスに自発的に出現できることを実証した。複数の研究者からのその後の研究は、海馬8、9、10のネットワーク状態を調節する神経調節因子の役割およびvivo11での行動の間に以前に活動していた神経アンサンブルのインビトロ再活性化を促進するシナプス機構を含む、SDRの多くの側面を徐々に解明してきた。脳スライス実験はまた、ガンマ範囲振動(30〜100Hz)、記憶符号化とリコール12、13をサポートすると考えられている明確な海馬ネットワーク状態への洞察を提供している。最後に、側頭葉てんかん14,15の病態生理学における海馬および関連する構造の中心的役割を認識し、研究者は海馬スライス製剤を使用しててんかん活動の発生および伝播を調査した。Carterららは、慢性てんかん動物から調製された海馬-内皮質スライスを組み合わせることで、vitro16で自発的にてんかん放電を発生させることができることを実証した。その後、Karlócaiらは、改変されたイオン濃度(Mg2+または上昇K+)または薬物(4APまたはガバジン)17を有する改変された人工脳脊髄液(ACSF)を用いて海馬スライス中のてんかん分泌物の基礎となるメカニズムを探った。

研究者は、重要な方法で異なる多数の海馬スライスアプローチを開発しました:(1)スライスに含まれる海馬の領域(側線、中間体、または腹側);(2)内皮質などの海馬外組織の有無。(3)スライス(コロナ、矢状、水平、または斜め)をカットするために使用される方向。(4)スライス後に組織が維持される条件(ACSFに完全に沈水するか、ACSFのインターフェースで保持され、加湿された、カルボゲンが豊富な空気)。

どのスライスアプローチを使用するかを選択することは、実験目的によって決定されるべきである。例えば、水没条件下で維持された眼海馬の横方向またはコロナスライスは、海馬内回路およびシナプス可塑性18、19、20の調査に非常に有効に使用されてきた。しかし、このような調製物は、腹側海馬21、22、23からのスライスほど容易にネットワーク振動を発生させるものではない。持続的なSWR活性の状態は、背側および腹側海馬24からの横切りスライスにおけるテタニック刺激によって誘発され得るが、腹側スライス7,25において自発的なSWRがより容易に観察される。

側方海馬と腹側海馬の間に固有の生理学的および解剖学的な区別は、生体内およびインビトロ26の両方で行われる研究によって支えられている。ラットにおける記録は、側腹および中間海馬全体にわたって強く一貫したシータリズムを明らかにしたが、腹側領域と海馬27の残りの部分との間の一貫性が悪い。生体内のSRSは、裏側海馬と中間海馬の間で容易に伝播し、腹側海馬に由来するSDRはしばしば局所的な28のままである。海馬の縦軸に沿って、裏側および中間海馬に存在するCA3錐体ニューロンに由来する関連投影法。腹側領域から発生するCA3投影は比較的局所的であり、したがって、スライスプロセス29、30の間に切断される可能性が低い。したがって、腹側スライスは、人口同期を生成するために必要な繰り返しネットワークをよりよく保存する可能性があります。vitroで自発的なネットワーク活動を発生させる腹側スライスの傾向は、より多くの側側領域31と比較して、錐体ニューロンの高い固有興奮性または腹側海馬におけるGABAergic阻害の高い固有の興奮性を反映してもよい。確かに、腹側海馬のスライスは、てんかん活動32、33に対してより敏感である。したがって、自発的な生理学的8、9、11、24または病理学的16、34、35、36ネットワーク振動の多くの研究は、伝統的に、時には腹側海馬の横面に平行な組織スライスを生み出す前頭後頭方向にわずかな角度で、水平スライスアプローチを使用してきました。

スライス処理によって、スライスの多くのセルが切断されることで、ネットワーク接続が不可避的に影響を受けます。目的の回路の接続性を最適化するために、準備中に保持されるスライスと組織の角度と厚さを考慮する必要があります。多くの研究は、生理学的または病理学的ネットワーク振動の文脈で2つの構造間の相互作用を探求するために水平結合海馬-内皮質スライス(HEC)を利用しています。Rothらは、海馬のCA1サブフィールドと内側の内皮質の層Vから二重記録を行い、HECスライス37を通してSWR活性の伝播を実証した。てんかんの活動の多くの研究は、てんかんの排出がコルチコヒッポカンネットワーク16、35、36、38を介して伝播する方法を調査するためにHECスライス調製を使用しています。無傷のコルチコヒッポカンピカルループの保存は、自発的なSVR、てんかんの排出、またはガンマ振動の前提条件ではないことを注意することが重要です。ネットワーク振動は、付着した海馬組織21、22、23、25、39、40、41を伴わない、側側または腹側海馬の横切れスライスで生成することができる。海馬スライスにおけるネットワーク振動の自発的発生のためのより重要な要因は、厚いスライス(400〜550 μm)がCA2/CA3の再発ネットワーク21、22、25でより多くの接続を維持するので、各スライスの厚さである可能性があります。

角度付き水平HECスライス(前頭部後頭部方向に約12°の角度でカット)は、コルチコヒッポカンピカルループ11、16、34、35、42の機能的接続性を研究するために使用されてきたが、そのような斜めの準備は、自発的なネットワーク活動43、44、45のために必要とされない。しかし、斜めのスライス平面を使用すると、下向きまたは上向きの角度が適用されるかに応じて、研究者が腹側または中間海馬の横方向の層板を最もよく保存するスライスを選択的に作成することができます(図1)。このアプローチは、パパテオドロプロスら、2002年に使用される方法と概念的に似ており、各海馬を自由に解剖し、組織チョッパーを使用して、側腹側全軸21に沿って横切りスライスを作成した。腹側と側側中海馬の機能的な区別に照らして、研究者は実験を設計したり結果を解釈したりする際に、スライスの解剖学的起源を考慮する必要があります。スライス手順中に寒天ランプを使用することは、中間海馬または腹側海馬のいずれかからスライスを優先的に生成する簡単な方法です。

海馬スライスは、水没したチャンバー(組織がACSFに完全に浸漬された)またはインターフェイススタイルのチャンバー(例えば、オスロまたはハースチャンバー、流れる媒体の薄膜のみで覆われたスライス)のいずれかで維持することができます。インターフェースの維持は、組織の酸素化を促進し、神経細胞の生存を促進し、ニューロン間活動の持続的な高レベルを可能にする。従来、沈められた記録条件は、ネットワークレベル振動の安定した発現のために十分な組織酸素化を提供しない、より遅いACSF流量を使用する。水没した海馬スライスでは、カルバコール誘発ガンマ振動は一過性に観察されるだけであるが、それらは界面記録室10、48、49で安定的に維持することができる。このように、vitroの複雑な自発的活動の多くの研究は、鋭波波波の複合体6、7、8、9、10、25、37、ガンマ振動10、38、45、47を調査するためにインターフェース記録室に依存してきました。

水没式記録室では、浸漬顕微鏡の目的を使用して個々の細胞を可視化し、記録のために健康的な細胞を選択的にターゲットにすることができます。水没した製剤はまた、水没が組織への薬物または他の化合物の急速な拡散を促進するので、細胞ミリューを細かく制御することを可能にする。したがって、水没条件下で安定したネットワーク振動が維持される修正方法論は、強力な実験アプローチを表す。このアプローチは、組織12、48、49への酸素供給を増強するためにACSF(〜6 mL/min)の高い流量を有する改変された水没記録室に移る前に、海馬スライスが簡略化されたインターフェーススタイルの保持室で数時間回復するハホスらの働きによって例示される。これらの条件下では、高レベルのニューロン間活動と安定した自発的ネットワーク振動を、水中記録室に維持することができる。この変更アプローチにより、研究者は視覚的に誘導された全細胞パッチクランプ記録を行い、形態学的に同定された細胞タイプがカルバコール誘導ガンマ振動12に寄与することを特徴付けることを可能にする。SRS は、ACSF11、48、49の速い流量を持つ水没した海馬スライスでも自然発生する可能性があります。Maierら et al. 水没した記録室に移る前にインターフェース室で回収された海馬スライスが確実に自発的なSWRを示したのに対し、水没した記録室に移る前にビーカーに沈んだスライスは、より小さな呼び起動場応答を示し、自発的なシナプス電流のレベルが低く、自発的なSWR43を示すことはほとんどありませんでした。Schlingloffらは、この改良された方法論を用いて、自発的なSRS44の生成におけるパルブアルブミン発現バスケット細胞の役割を実証した。

次のプロトコルは、水平海馬スライス中の自発的に活動するニューロンを界面条件下で回収し、その後、薬理学的または光遺伝学的操作および視覚的に導かれた記録に適した水没記録室で維持することができるスライス法を提示する。

プロトコル

ここで説明するすべての方法は、コロンビア大学の施設動物のケアと使用委員会によって承認されています (AC-AAAU9451).

1. ソリューションの準備

  1. 表1に記載されているように、スクロース切断液をスライス用に用意する。
    注:1 Lのショ糖溶液を調製した後、少量(約100〜200mL)を氷トレイに凍らせます。これらの冷凍スクロースアイスキューブは氷のスラリーにブレンドされます(ステップ4.3を参照)。
  2. 表2に記載されているように記録するための人工脳脊髄液(ACSF)を準備する。
  3. 微量金属やその他の不純物を除去するために濾過された精製水の1 mLにNaClの0.05844 gを溶解することによって刺激ピペットのためのNaClの1 Mを準備する。
    注: スクロース切断ソリューションと ACSF は、実験ごとに新しい準備をする必要があります。

2. 寒天ランプを準備する

  1. 寒天4%(例えば、50mLの水中の寒天の2g)を、微量金属やその他の不純物を除去するために濾過された精製水に寒天粉末を溶解して調製する。沸騰し始めるまで電子レンジで加熱します(約30〜60s)。溶融した寒天をカビに注ぎ、約12°の傾斜で冷蔵庫で4°Cで冷却し、固化させます。
    注:金型の場合、ガラスまたはプラスチック製の容器を斜めに使用でき、十分な溶融寒天が注がれ、長さ4cm、高さ約0.8cmのランプを形成します。

3. スライス領域をステージングする

  1. 約250 mLのACSFでスライス回収チャンバーを含む400 mLビーカーを充填します。32°Cに温めた水浴に入れ、カルボーゲン(95%酸素ガス/5%炭酸ガス)でバブリングを開始します。
    注:溶液の表面に保持室のナイロンメッシュを配置するのに十分な流体で回収ビーカーを充填し、スライスが暖かい溶液混合物と空気の界面で保持されるようにします(図1)。ナイロンメッシュに小さなレンズ紙を置きます。スライスはレンズ紙の上に置かれ、後でスライスを記録チャンバーに個別に転送するために使用できます(ステップ6.6を参照)。
  2. スクロース溶液を入れたフラスコをアイスバケツに入れ、冷やし、カルボーゲンで泡立ち始めます。
    注:回復ビーカーとショ糖溶液は、マウスがイオブルランチャンバーに置かれる前に、少なくとも30分間カーボーゲンバブリングで、それぞれ温め、冷やされるべきです。
  3. 冷凍庫から事前に作られた冷凍スクロース溶液アイスキューブのトレイを引き出し、ベンチに置いて部分的に解凍します。
  4. きれいな両刃のカミソリの刃の半分をミクロトームに入れ、必要に応じてキャリブレーションします。解剖中に使用するためにカミソリの刃の残りの半分を脇に置きます。
  5. スライシングチャンバーにカルボゲンラインと温度プローブを実行し、チャンバーを冷やすために氷で囲みます。
  6. 2つの使い捨て可能な吸収パッドで覆われたきれいなベンチまたはテーブルを準備しなさい。左パッドにすべての解剖ツールと3枚のラボテープをレイアウトし、そこで心筋灌流を行います。
    注:解剖ツールには、小さなボンハサミ、ディスセクターハサミ、大きなへら/スプーン、マイクロスパチュラ、新しいブレード付きメス、へら、シャープ/鈍い手術用ハサミ、大きな組織鉗子、小さな組織鉗子が含まれます( 材料表を参照)。
  7. 灌流領域の右側にある他の吸収パッドに、直径100mmガラスペトリ皿の蓋に円形の濾紙を置きます。ペトリ皿の底を蓋の隣に置き、カルボーゲンラインを皿の両方に入れます。
  8. かみそりの刃またはメスを使用して寒天の小さなランプ(角度付き表面に沿って約4センチ、高さ0.8cm、幅2cm)をカットします。高い端からランプの一部を切り取り、それを逆にして寒天のバッキングブロックを作成します。シアノアクリル酸接着剤を使用して、寒天ランプとバッキングブロックをスライスプラットフォームに貼り付け、脇に置きます。
    注:寒天のバッキングブロックは、スライス中に脳を安定させるのに役立ち、各スライスから不要な組織を解剖する表面を提供します(図1)。

4. 心筋透析

  1. ショ糖切断液のリザーバとして60 mL容量シリンジを、ベンチトップより約18インチ上に吊り下げる(例えば、垂直ポストに3本のスイベルクランプを使用する)。貯留槽の底部にチューブを取り付け、ローラークランプを通してチューブを実行し、チューブのもう一方の端を清潔な20G針に接続します。
  2. 60 mLの貯蔵所に約30 mLの冷蔵スクロース溶液を充填し、カルボーゲンラインをスクロース貯蔵所に向けて、ペルフューザを継続的に泡立てるようにします。
    注:ショ糖が閉じ込められた泡なしでチューブと針を通って流れていることを確認してください。流量は、針からスクロースを滴下する安定した、継続的な流れを持っているのに十分な速さでなければなりません。
  3. ブレンダーを使用して、凍ったスラリーに冷凍スクロースをつぶしてブレンドし、大きなスパチュラ/スプーンを使用してスラリーを分配します。
    1. ガラスペトリ皿蓋の端の周りに少量のスクロースラリーを置きます。ペトリ皿底に少量のスクローススラリーを加えます。
    2. 約20〜30mLのスクロースラリーを灌流液貯留層に加え、冷たい液体スクロースの30mLとよく混合し、貯水池に非常に冷たい、主に液体スクロースと残骸の凍結溶液の混合物が含まれるまで混合します。
  4. イオブルーラン気化器に接続されたチャンバーにマウスを置きます。約2 L/分で酸素が流れる状態で、気化器のダイアルを回してイオブルランを5%濃度で送り、タイマーを開始します。
    注:スライスの過程を通して、スライスが取得される速度を測定するために、このタイマーを維持してください。この手順は、スライスが完了し、イオブルランチャンバーに入る動物の15〜20分以内に、組織がインターフェースチャンバーで回復するような、できるだけ早く行う必要があります。マウスを見て、深い麻酔の状態が確実に達成されるようにします。最低5分後、マウスは深く麻酔され、つま先のピンチに反応しないはずです。
  5. イゾフルランチャンバーからマウスを取り外す直前に、ペトリ皿の蓋に約3〜5mmの深さまで冷やしたスクロース溶液を充填し、ペトリ皿底部に約1.0cmの深さまで冷やしたスクロース溶液を充填します。
  6. マウスを左吸収パッドに素早く移し、3枚のテープを使用して前肢と尾を固定します。後肢のつまみを行い、切開が行われる前にマウスが反応しないようにします。大きな組織鉗子と手術用はさみを使用して、皮膚をテントし、胸骨の底から胸の上まで長い切開を行います。鉗子を使用して胸骨を引き上げ、はさみを使用して横隔膜を切断します。
    注:マウスの初期位置と、ダイヤフラムを切断する最初のいくつかの切開は、マウスが意識を取り戻さないようにできるだけ早く行う必要があります。処置を通して十分な麻酔の深さを保障するために、鼻コーンは、灌流の間にイオブルランを提供するためにマウスに置くことができる。
  7. はさみを使用して両側のリブケージを切り取り、前肢が体と出会うポイントに向かって1つの大きな動きをカットします。鉗子で、リブケージの前部を頭に向かって上に振り、大きなはさみを使って水平カットで完全に取り外します。大きな鉗子を使用して心臓を所定の位置に保持し、左心室に20G灌流針を挿入します。針が正しく配置されると、冷やしたショ糖溶液が心室を満たすので、心臓の左側はすぐに青白くなります。
  8. 右心房に切断し、血液が循環系から流れ出るように小さなディスセクターハサミを使用してください。切開が正しく行われれば、心臓への損傷は最小限に抑えられるはずであり、灌流を通してポンピングを続けるべきである。
    注:組織紙のロールアップ部分は、心臓から血液およびスクロース溶液を吸い取り、手順中に灌流針の可視性を維持するために使用することができます。
  9. 灌流針が所定の位置に留まり、左心室から落ちないようにしてください。適切な流量と配置により、肝臓は20〜30 sの薄い日焼け/ベージュ色に青ざめ始めます。
  10. 30~45sの後、大きなはさみを使ってマウスの首を切ります。左手に頭を持ち、頭蓋骨から皮膚を押したり剥がしたりします。よく浸透した動物では、頭蓋骨は非常に青白く、脳ははっきりと見える血管なしで頭蓋骨を通して非常に薄いピンク色(白に近づく)に見えるはずです。

5. 脳を抽出し、スライスをカット

  1. 小さなボンハサミを使用して、目の近くの頭蓋骨の前部の正中線に向かって頭蓋骨を横切り2回カットします。頭蓋骨のベースの両側に2つの追加のカットを行います。
  2. ガラスペトリ皿の底に頭を移し、冷やしたスクロース溶液に浸す必要があります。小さなボンハサミを使用して頭蓋骨の長さに沿って正中線を切り取り、はさみで引き上げて脳組織の損傷を最小限に抑えます。小さなティッシュ鉗子を使って、頭蓋骨の両側をしっかりとつかみ、本を開くような脳から上下に振り回す。
  3. 左手の指を使って頭蓋骨のフラップを開いたままにし、嗅球の近くの脳の下にマイクロスパチュラを挿入します。頭蓋骨からスクロースに脳を反転し、脳幹を切断するためにマイクロスパチュラを使用しています。脳を洗って、残った血液、毛皮、または他の組織を取り除きます。
  4. 大きなへら/スプーンを使用して、ガラスペトリ皿の蓋に脳を移します。両刃のカミソリブレードの残りの半分は、以前に脇に置いて、最初に小脳を取り除くために2つのコロナカットを行い、次に嗅球を含む脳の最も前部を取り除きます(図1)。
  5. 寒天ランプにシアノアクリル酸接着剤を塗布します。非常に簡単に大きな組織鉗子を使用して乾燥したフィルターペーパーの一部に脳を置き、すぐに寒天ランプに移し、脳の腹側表面を接着剤に置きます。
    注:中間海馬のスライスの場合、脳は前部がランプの斜面を向き、後部がブレードに近い方向に向ける必要があります。腹側海馬のスライスの場合、前端がランプの斜面を指し示し、後端をランプの上部に、ブレードから遠ざけて脳を向けます。いずれの場合も、脳の上部に脳を配置し、脳のコロナカット面が寒天バッキングブロックに接触するようにする必要があります(図1)。
  6. 寒天と脳を持つスライスプラットフォームをミクロトームのスライスチャンバーに入れ、冷やしたスクロース溶液で完全に浸します。大きなスパチュラ/スプーンを使用してショ糖スラリーをチャンバーに移し、攪拌して冷凍スクロースを溶かし、混合物の温度を1〜2°Cに急速に下げます。
    注:スライス全体の温度計を確認してください。スクロース溶液が3°C以上に温まった場合は、スラリーを加えて混ぜて温度を下げます。
  7. マイクロトーム速度を0.07mm/sに設定して、厚さ450μmのスライスをカットします。各スライスが解放されると、小さな組織鉗子と鋭いメスを使用して最初に2つの半球を分離し、次にスライスが主に海馬領域と海馬部領域からなるまで組織を切り取る(図1)。
  8. プラスチックトランスファーピペットを使用して、スライスをインターフェイス回復チャンバに個別に転送し、ACSFのインターフェースと、スライスを覆うACSFの薄い半月板だけで空気に配置されるようにします。チャンバーの蓋をしっかりと閉じ、スライスを32°Cで30分間回収します。
  9. 32°Cでの最初の回復の後、水浴からインターフェース回復チャンバーを持って来て、磁気攪拌棒がチャンバー内のACSFの循環を促進するように遅い速度に設定された攪拌機の上に置きます。スライスがさらに90分間回復するにつれて、徐々に室温まで冷却します。回復チャンバーが継続的にカルボーゲンで泡立ち、大きな泡がスライスの下に閉じ込められることを許可しないことを確認してください。

6. 自発的な活動の局所的なフィールド電位(LFP)の記録を行う

  1. 取得ソフトウェアを実行しているコンピュータ、コンピュータに接続されたモニタ、刺激装置、マイクロマニピュレータ、温度コントローラ、顕微鏡光源、顕微鏡取り付けカメラ、マイクロ電極アンプ、デジタイザ、およびペリスタリックポンプを含むすべての必要な機器をオンにしてLFP記録の準備をします。中央真空システムを使用する場合は、壁弁を開いて、記録チャンバからACSFを除去する真空ラインを準備します。
  2. 加熱された貯留層をACSFで満たし、バブリングACSFを含む400 mLビーカーにチューブの一端を置きます。蠕動ポンプをオンにして、ACSFを400 mLビーカーから加熱された貯水池に向け、リザーバーから記録室に向けます。チューブをタップまたはピンチして、閉じ込められた泡を解放します。
  3. 蠕動ポンプを調整して、記録チャンバーを通るACSFの流量が速い(~8~10 mL/min)ことを確認します。温度プローブを使用して、記録チャンバの中央にACSFが32°Cであることを確認します。
    注: ACSF が蠕動ポンプを使用して記録チャンバに配信される場合、流量が高いと、流量が著しい変動を招く可能性があります。一貫した流速は、チューブに統合された一連の空のシリンジからなる単純な脈動ダンパーを使用して達成することができる(図2)。
  4. 加熱フィラメントプーラーを使用して、ホウケイ酸ガラス毛細血管からの刺激と記録ピペットを準備します。プーラープロトコルは、刺激または局所電界電位記録電極用に2-3 MOhmの抵抗を持つピペットを得るように構成する必要があります。
  5. 刺激ピペットを1 M NaClとLFPピペットにACSFで充填します。
  6. 配管を短時間クランプし、ポンプをオフにして ACSF のフローを一時停止します。細かい鉗子を使ってスライスをレンズ紙の角をつかみ、スライスがレンズ紙に貼り付けます。レンズペーパーとスライスを記録室に入れ、スライスを下にして、レンズ紙を「皮をむく」し、スライスを記録室に沈めたままにします。ハープを使用してスライスを固定します。
    注:ハープは、ステンレス鋼またはプラチナと細かいナイロンフィラメントのU字型の部分を使用して、事前に作られたか、またはラボで作られています。
  7. 手動マイクロマニピュレータにNaClで満たされた刺激ピペットを入れ、ピペットの先端をスライスの表面(例えば、 地層ラジタム 層)に約30〜45°の角度でゆっくりと進めます。ピペットの先端が組織に入ったら、ピペットをゆっくりと前進させ、スライス内の軸索を不必要に損傷する可能性のある横方向または垂直方向の大きな動きを控えます。スライス中に損傷した表面近くの細胞を避けるために、ピペットの先端をスライスの深さ50~100μm以上に入れる。
  8. ACSFで満たされたLFPピペットを電動マイクロマニピュレータに取り付けたピペットホルダーに入れ、下さい。口の圧力またはストップコック弁を介して接続された1 mLのシリンジを使用して非常に軽い正圧を適用し、管の短い長さをピペットホルダーに適用します。
    注:興味の信号を記録するためにスライス内にLFPピペットを配置する:鋭波波波の場合、1つのLFPピペットは、層ピラミッド(SP)と層ラジタム(SR)の第2ピペットに配置する必要があります。この構成により、SRの負の鋭波とSPの高周波リップル振動の同時記録が可能になります(図3)。
  9. マイクロマニピュレータを使用すると、約30〜45°の角度で、LFPピペットの先端を対象領域(CA1ピラミッド型セル層など)にゆっくりと進めます。スライス中に損傷した表面近くの細胞を避けるために、ピペットの先端をスライスの深さ50~100μm以上に入れる。LFPピペットを進めながら、取得ソフトウェアを使用して小さな電圧テストパルスを継続的に供給し、電極抵抗の急激な増加を監視します。これは、ピペットが詰まったり、細胞に押し付けられたりしたことを示している可能性があります。
  10. LFPピペットが対象領域に配置されたら、ピペットホルダーに取り付けられたチューブのバルブを開けて、慎重に正圧を放出します。
  11. LFPを2番目の場所に同時に記録するには、ステップ6.8~6.10を2番目のピペットとマイクロマニピュレータで繰り返します。
  12. 現在のクランプ構成のマイクロ電極アンプを使用して、取得ソフトウェアでブリッジバランス機能を使用してピペットの直列抵抗を補正した後、局所的なフィールドポテンシャルで自発的な活動を記録します。自発的なSRはSP層の細胞外電位に正の偏向として現れる(図3)。
  13. 呼び起こされる電位を記録するために、デジタイザに接続された刺激装置を使用して、NaClで満たされた刺激ピペットを通して短い(200 us)の方形電圧パルスを供給します。刺激電圧ダイヤルを調整して、応答振幅の範囲を呼び起こします。

結果

ここでは、このプロトコルで説明したように準備されたHECスライスからの代表的な録音を示します。インターフェース保持室(図1C)での回復後、スライスは水没した記録室に個別に移される(図2B)。記録チャンバには、蠕動ポンプを用いてカルボゲン飽和ACSFが供給される(図2A)。ポンプは最初に保持ビーカーから熱い貯蔵所にACS...

ディスカッション

組織の健康を促進し、自発的な自然主義的なネットワーク活動の出現を支持するように設計されたこのスライスプロトコルにはいくつかのステップがあります:マウスは、チルドショ糖切断溶液で経皮的に浸透しています。水平内膜皮質(HEC)スライスは、中間または腹側海馬から450μmの厚さで切断されます。スライスは、温めたACSFのインターフェースで回復し、加湿された、カルボゲンが豊富...

開示事項

著者は開示するものは何もない。

謝辞

著者はスティーブ・ジーゲルバウムのサポートに感謝したいと思います。資金は5R01NS106983-02と1 F31 NS113466-01によって提供されます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
3D printerLulzbotLulzBot TAZ 6
Acute brain slice incubation holderNIH 3D Print Exchange3DPX-001623Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623
Adenosine 5′-triphosphate magnesium saltSigma AldrichA9187-500MG
Ag-Cl ground pelletsWarner64-1309, (E205)
agarBecton, Dickinson214530-500g
ascorbic acidAlfa Aesar36237
beaker (250 mL)Kimax14000-250
beaker (400 mL)Kimax14000-400
biocytinSigma AldrichB4261
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Bonn scissors, smallbecton, Dickinson14184-09
borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm)Sutter InstrumentsBF150-86-10HPFire polished capillaries are preferable.
calcium chloride solution (1 M)G-BiosciencesR040
cameraOlympusOLY-150
compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide)AirgasX02OX95C2003102
compressed oxygenAirgasOX 200
constant voltage isolated stimulatorDigitimer Ltd.DS2A-Mk.II
coverslips (22x50 mm)VWR16004-314
cyanoacrylate adhesiveKrazy GlueKG925Ideally use the brush-on form for precision
data acquisition softwareAxographN/AAny equivalent software (e.g. pClamp) would work.
Dell Precision T1500 Tower Workstation DesktopDellN/ACatalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software.
Digidata 1440AMolecular Devices1-2950-0367
digital timerVWR62344-6414-channel Traceable timer
disposable absorbant padsVWR56616-018
dissector scissorsFine Science Tools14082-09
double-edge razor bladesPersonnaBP9020
dual automatic temperature controllerWarner Instrument CorporationTC-344B
dual-surface or laminar-flow optimized recording chamberN/AN/AThe chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments.
equipment rackAutomate ScientificFR-EQ70"A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology
Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA)Sigma Aldrich324626-25GM
filter paperWhatman1004 070
fine scaleMettler ToledoXS204DR
Flaming/Brown micropipette pullerSutter InstrumentsP-97
glass petri dish (100 x 15 mm)Corning3160-101
glucoseFisher ScientificD16-1
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrateSigma AldrichG8877-250MG
ice bucketsSigma AldrichBAM168072002-1EA
isoflurane vaporizerGeneral Anesthetic ServicesTec 3
lab tapeFisher Scientific15-901-10R
lens paperFisher Scientific11-996
light sourceOlympusTH4-100
magnesium chloride solution (1 M)Quality Biological351-033-721EA
magnetic stir barsFisher Scientific14-513-56Catalog number will be dependent on the size of the stir bar.
micromanipulatorLuigs & NeumannSM-5
micromanipulator (manual)ScientificaLBM-2000-00
microscopeOlympusBX51WI
microspatulaFine Science Tools10089-11
monitorDell2007FPb
MultiClamp 700B Microelectrode AmplifierMolecular DevicesMULTICLAMP 700BThe MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell.
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES)Sigma AldrichH3375-25G
needle (20 gauge, 1.5 in length)Becton, Dickinson305176
nylon filamentYLI Wonder Invisible Thread212-15-004size 0.004. This cat. # is from Amazon.com
nylon meshWarner Instruments Corporation64-0198
perstaltic pumpHarvard Apparatus70-2027
Phosphocreatine di(tris) saltSigma AldrichP1937-1G
pipette holdersMolecular Devices1-HL-U
platinum wireWorld PrecisionPT0203
polylactic acid (PLA) filamentUltimakerRAL 9010
potassium chlorideSigma AldrichP3911-500G
potassium gluconateSigma Aldrich1550001-200MG
potassium hydroxideSigma Aldrich60377-1KG
razor bladesVWR55411-050
roller clampWorld Precision Instruments14041
scaleMettler ToledoPM2000
scalpel handleFine Science Tools10004-13
slice harpWarnerSHD-26GH/2
sodium bicarbonateFisher ChemicalS233-500
sodium chlorideSigma AldrichS9888-1KG
sodium phosphate monobasic anhydrousFisher ChemicalS369-500
sodium pyruvateFisher ChemicalBP356-100
spatulaVWR82027-520
spatula/spoon, largeVWR470149-442
sterile scalpel bladesFeather72044-10
stirrer / hot plateCorning6795-220
stopcock valves, 1-wayWorld Precision Instruments14054
stopcock valves, 3-wayWorld Precision Instruments14036
sucroseAcros OrganicsAC177142500
support for swivel clampsFisher Scientific14-679Q
surgical scissors, sharp/bluntFine Science Tools14001-12
syringe (1 mL)Becton, Dickinson309659
syringe (60 mL with Luer-Lok tip)Becton, Dickinson309653
three-pronged clampFisher Scientific05-769-8Q
tissue forceps, largeFine Science Tools11021-15
tissue forceps, smallFine Science Tools11023-10
transfer pipettesFisher Scientific13-711-7M
tubingTygonE-3603ID 1/16 inch, OD 3/16 inch
tubingTygonR-3603ID 1/8 inch, OD 1/4 inch
vacuum greaseDow Corning14-635-5D
vibrating blade microtomeLeicaVT 1200S
vibration-dampening table with faraday cageMicro-G / TMC-ametek2536-516-4-30PE
volumetric flask (1 L)KimaxKIM-28014-1000
volumetric flask (2 L)PYREX65640-2000
warm water bathVWR1209
 

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