Xenopus laevis Preparación de extracto de huevo y métodos de imágenes en vivo para visualizar la organización citoplasmática dinámica

Resumen

Describimos un método para la preparación y obtención de imágenes en vivo de extractos citoplasmáticos sin diluir de huevos de Xenopus laevis .

Resumen

Tradicionalmente utilizados para ensayos bioquímicos a granel, los extractos de huevo de Xenopus laevis se han convertido en una poderosa herramienta basada en imágenes para estudiar fenómenos citoplasmáticos, como la citocinesis, la formación del huso mitótico y el ensamblaje del núcleo. Basándose en los primeros métodos que tomaban imágenes de extractos fijos muestreados en puntos de tiempo dispersos, los enfoques recientes de imágenes de extractos en vivo utilizando microscopía de lapso de tiempo, revelando características más dinámicas con una resolución temporal mejorada. Estos métodos generalmente requieren tratamientos superficiales sofisticados del vaso de imágenes. Aquí presentamos un método alternativo para obtener imágenes en vivo de extractos de huevo que no requieren tratamiento químico de superficie. Es fácil de implementar y utiliza consumibles de laboratorio producidos en masa para obtener imágenes. Describimos un sistema que se puede utilizar tanto para microscopía de campo amplio como para microscopía confocal. Está diseñado para extractos de imágenes en un campo de 2 dimensiones (2D), pero se puede extender fácilmente a imágenes en 3D. Es muy adecuado para estudiar la formación de patrones espaciales dentro del citoplasma. Con datos representativos, demostramos la organización dinámica típica de microtúbulos, núcleos y mitocondrias en extractos de interfase preparados utilizando este método. Estos datos de imagen pueden proporcionar información cuantitativa sobre la dinámica citoplasmática y la organización espacial.

Introducción

El citoplasma constituye el volumen principal de una célula y tiene una organización distinta. Los ingredientes del citoplasma eucariota pueden autoensamblarse en una amplia gama de estructuras espaciales, como los ásteres de microtúbulos y el aparato de Golgi, que a su vez están dispuestos dinámicamente y se voltean dependiendo de la identidad y el estado fisiológico de la célula. Por lo tanto, comprender la organización espacial del citoplasma y su vínculo con las funciones celulares es importante para comprender cómo funciona la célula. Los extractos de huevo de Xenopus laevis se han utilizado tradicionalmente para ensayos bioquímicos a granel 1,2,3,4,5,6,7,8, pero trabajos recientes los establecen como un poderoso sistema de imágenes en vivo para estudios mecanicistas de estructuras citoplasmáticas y sus funciones celulares 9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18. Estos extractos no diluidos preservan muchas estructuras y funciones del citoplasma, al tiempo que permiten manipulaciones directas de los contenidos citoplasmáticos no alcanzables en modelos convencionales basados en células^19,20. Esto los hace ideales para caracterizar fenómenos citoplasmáticos y diseccionar sus fundamentos mecanicistas.

Los métodos existentes para obtener imágenes de extractos requieren modificaciones químicas de la superficie o la fabricación de dispositivos microfluídicos. Un método basado en cubreobjetos requiere la pasivación del polietilenglicol (PEG) de los cubreobjetos de vidrio²¹. Un método basado en microemulsiones requiere la deposición de vapor de tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano en superficies de vidrio^22,23. Los sistemas basados en microfluídicos permiten un control preciso del volumen, geometría y composición de las gotas de extracción, pero requieren instalaciones especializadas de microfabricación^11,12,24.

Aquí presentamos un método alternativo para obtener imágenes de extractos de huevo que es fácil de implementar y utiliza materiales fácilmente disponibles y de bajo costo. Esto incluye la preparación de una cámara de imágenes con un portaobjetos y un cubreobjetos recubiertos con cinta de etileno propileno fluorado (FEP). La cámara se puede utilizar para extraer imágenes con una variedad de sistemas de microscopía, incluidos estereoscopios y microscopios verticales e invertidos. Este método no requiere tratamiento químico de superficies, al tiempo que logra una claridad óptica similar obtenida con los métodos existentes basados en vidrio discutidos anteriormente. Está diseñado para obtener imágenes de una capa de extractos con un grosor uniforme en un campo 2D, y se puede extender fácilmente para obtener imágenes de un volumen 3D de extractos. Es muy adecuado para imágenes de lapso de tiempo del comportamiento citoplasmático colectivo en un amplio campo de visión.

Hemos utilizado extractos de huevo detenidos entre fases para demostrar nuestro método de imagen. La preparación del extracto sigue el protocolo de Deming y Kornbluth¹⁹. Brevemente, los huevos naturalmente detenidos en la metafase de la meiosis II son aplastados por un giro de baja velocidad. Este giro libera el citoplasma del paro meiótico y permite que el extracto proceda a la interfase. Normalmente, la citocalasina B se agrega antes del giro de trituración para inhibir la formación de actina F. Sin embargo, se puede omitir si se desea F-actina. La cicloheximida también se agrega antes del centrifugado para evitar que el extracto de interfase entre en la siguiente mitosis. Los extractos se colocan posteriormente en las cámaras de imagen antes mencionadas y se colocan en un microscopio. Finalmente, las imágenes se registran a lo largo del tiempo a intervalos definidos por una cámara conectada al microscopio, produciendo series de imágenes de lapso de tiempo que capturan el comportamiento dinámico del extracto en un campo 2D.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Stanford.

1. Preparación de portaobjetos y cubreobjetos

1. Aplique una capa de cinta adhesiva de etileno propileno fluorado (FEP) a un portaobjetos de vidrio con un aplicador de rodillos. Corte el exceso de cinta sobre los bordes con una cuchilla de afeitar limpia. Prepare los cubreobjetos recubiertos con cinta FEP de la misma manera (Figura 1A).
2. Aplique un espaciador de imágenes adhesivas de doble cara al lado recubierto con cinta FEP de la diapositiva. Deje el forro protector en la parte superior sin pelar (Figura 1A).
   NOTA: Las diapositivas y los cubreobjetos deben prepararse antes del experimento. Se pueden usar inmediatamente o almacenar en cajas para evitar la acumulación de polvo en las superficies. El pozo en el espaciador de imágenes tiene una profundidad de 120 μm y tiene un diámetro de 9 mm.

2. Preparación e imágenes en vivo de extractos de huevo detenidos entre fases

NOTA: El siguiente protocolo está adaptado de Deming y Kornbluth¹⁹, Murray²⁰ y Smythe y Newport²⁵ con modificaciones. Todos los pasos deben realizarse a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

1. De tres a diez días antes de la recolección de huevos, inyecte ranas hembras maduras de Xenopus laevis por vía subcutánea en el saco linfático dorsal con 100 UI de gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG).
2. De dieciséis a dieciocho horas antes de la recolección planificada de huevos, inyecte las ranas del paso 2.1 con 500 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG). Dejar las ranas a 18 °C en tampón de puesta de huevos (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2 O, 2.5 mM CaCl 2·2H₂O, 0.5 mM HEPES, 0.1 mM EDTA, preparar como una solución madre 20x a pH _7.4 y diluir con agua limpia del tanque de rana hasta 1x antes de usar) hasta la recolección de huevos.
3. El día del experimento, recolecte los huevos en una placa de Petri de vidrio grande y evalúe la calidad del huevo. Deseche cualquier huevo que parezca bolas hinchadas blancas o que aparezca en una cuerda (Figura 1B). Examine los huevos bajo un estereoscopio, mantenga los huevos con apariencia normal (Figura 1C) y deseche aquellos con pigmento irregular o moteado (Figura 1D).
   NOTA: Este protocolo funciona con huevos recolectados de una sola rana, que generalmente pone 25 ml de huevos 16 horas después de la inyección de hCG. Por lo general, un total de 3 a 6 ranas son inducidas por hCG, y la rana con la más alta calidad de huevo se elige para el experimento de preparación de extractos.
4. Transfiera los huevos a un vaso de precipitados de vidrio de 400 ml y elimine la mayor cantidad posible de tampón de puesta de huevos por decantación.
5. Incubar los huevos en 100 ml de solución desejelante recién preparada (2% p/v L-cisteína en agua, ajustar a pH 8.0 con NaOH) y agitarlos suavemente periódicamente. Después de unos 3 minutos, vierta la solución y agregue 100 ml de solución desejelante fresca. Continúe la incubación hasta que los huevos estén bien empaquetados (sin espacio entre los huevos), pero evite dejar los huevos en la solución desarticulada durante más de un total de 5 minutos.
6. Eliminar la mayor cantidad posible de solución desarticulada por decantación y lavar los huevos en tampón MMR 0,25x (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl₂, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, preparado como una solución madre 10x, ajustado a pH 7,8 con NaOH, y diluido en agua Milli-Q antes de su uso) añadiendo el tampón, Agitando los huevos y luego vertiendo el amortiguador. Repita varias veces hasta que se use un total de 1 L del tampón para los lavados.
7. Lave los huevos varias veces con un total de 400 ml de tampón de lisis de huevo (250 mM de sacarosa, 10 mM de HEPES, 50 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl₂, 1 mM de DTT, frescos y ajustados a pH 7,7 con KOH). Retire los huevos con apariencia anormal utilizando una pipeta Pasteur entre los lavados.
   NOTA: Los huevos con apariencia anormal se refieren a aquellos que parecen bolas hinchadas blancas (Figura 1B), tienen pigmentación moteada (Figura 1D), se están deteriorando con una región blanca en crecimiento (Figura 1E) o muestran un área pigmentada oscura y contraída en el hemisferio animal (Figura 1F).
8. Usando una pipeta de transferencia con la punta bien abierta, transfiera los huevos a un tubo de centrífuga de fondo redondo de 17 ml que contenga 1 ml de tampón de lisis de huevo. Gire el tubo en una centrífuga clínica a 400 x g durante 15 segundos para empacar los huevos.
9. Retire la mayor cantidad posible del tampón de lisis del huevo de la parte superior de los huevos envasados con una pipeta Pasteur.
   NOTA: Es importante eliminar la mayor cantidad posible de tampón de los huevos empacados, con el fin de minimizar la dilución del extracto de huevo. A veces es necesario eliminar algunos huevos sueltos junto con el tampón residual para lograr esto.
10. Determine el volumen aproximado de los huevos empacados y luego agregue 5 μg/ml de aprotinina, 5 μg/ml de leupeptina, 5 μg/ml de citocalasina B y 50 μg/ml de cicloheximida directamente sobre los huevos empacados.
    NOTA: La aprotinina y la leupeptina son inhibidores de la proteasa. La citocalasina B inhibe la polimerización de actina, evitando que el extracto se contraiga y gelifique²⁶. La cicloheximida inhibe la síntesis de proteínas, manteniendo así el extracto en la interfase del ciclo celular.
11. Triturar los huevos centrifugando el tubo a 12.000 x g, 4 °C, durante 15 minutos, en un rotor de cuchara oscilante.
    NOTA: Al final de la centrifugación, los huevos deben haberse roto y el lisado separado en tres capas principales: una capa lipídica amarilla en la parte superior, el extracto citoplasmático (también llamado extracto crudo) en el medio y una capa densa oscura que contiene los gránulos de pigmento en la parte inferior (Figura 1G).
12. Coloque una aguja de calibre 18 en una jeringa. Con el bisel de la punta de la aguja hacia arriba, perfore el tubo desde el lado en la parte inferior de la capa citoplasmática y recupere el extracto dibujando lentamente.
    NOTA: Extraiga el extracto citoplasmático lentamente para evitar la inclusión de contenido contaminante de la capa lipídica amarilla.
13. Transfiera el extracto citoplasmático recuperado a un nuevo tubo de microcentrífuga y manténgalo en hielo. Use el extracto dentro de 1 hora.
14. Cuando esté listo para obtener imágenes, complemente el extracto con los reactivos deseados y las sondas de imágenes de fluorescencia.
    NOTA: Las sondas de imágenes de fluorescencia marcan estructuras citoplasmáticas específicas para que puedan ser visualizadas por un microscopio de fluorescencia.
15. Retire el revestimiento protector superior del espaciador de imágenes del portaobjetos preparado en el paso 1.2 y deposite aproximadamente 7 μL de extracto en el centro del pocillo. Aplique inmediatamente el cubrecubierto con cinta FEP con el lado FEP orientado hacia el extracto para sellar el pozo. Proceda rápidamente a la obtención de imágenes (Figura 1H, I).
16. Coloque la diapositiva en un microscopio invertido o vertical con una platina motorizada y una cámara digital. Obtener imágenes de los extractos en las posiciones espaciales deseadas y los intervalos de tiempo tanto en canales de campo claro como de fluorescencia.
    NOTA: Normalmente, se utiliza un objetivo 5x para la obtención de imágenes. La platina motorizada permite la adquisición automatizada de imágenes en múltiples posiciones espaciales definidas. La microscopía de campo claro visualiza estructuras citoplasmáticas con diferentes grados de transparencia. La microscopía de fluorescencia visualiza las estructuras citoplasmáticas específicamente marcadas por las sondas de imágenes de fluorescencia agregadas en el paso 2.14. La cámara graba imágenes de lapso de tiempo de estas estructuras, capturando así la dinámica de la organización citoplasmática.

Resultados

Los extractos de huevo de Xenopus laevis se pueden utilizar para estudiar la autoorganización del citoplasma durante la interfase. La figura 2A muestra los resultados de un experimento exitoso. Suplementamos extractos detenidos entre fases con núcleos de espermatozoides 19 de Xenopus laevis demembranados a una concentración de 27 núcleos/μL y 0,38 μM purificados GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (proteína de fusión que consiste en ...

Discusión

Los extractos de huevos de Xenopus laevis se han convertido en un poderoso sistema modelo para estudios basados en imágenes de diversas estructuras subcelulares 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 y organización citoplasmática en su conjunto<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
17 ml centrifuge tube	Beckman Coulter	337986
22x22 mm square #1 cover glass	Corning	284522
Aprotinin	MilliporeSigma	10236624001	Protease inhibitor
Cycloheximide	MilliporeSigma	01810	Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin B	MilliporeSigma	C6762	Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogs	Nasco	LM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL488M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein	Cytoskeleton, Inc.	TL670M-A	For visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape	CS Hyde company	23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG)	MilliporeSigma	CG10
Imaging spacer	Electron Microscopy Sciences	70327-8S
Leupeptin	MilliporeSigma	11017101001	Protease inhibitor
Microscope slides	Fisher Scientific	12-518-100B
Mineral oil	MilliporeSigma	330760
MitoTracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	BioVendor	RP1782725000
Roller applicator	Amazon	B07HMBJSP8	For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor blades	Fisher Scientific	12-640	For removing excessive FEP tape
Transfer pipette	Fisher Scientific	13-711-7M