Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Xenopus laevis yumurtalarından seyreltilmemiş sitoplazmik ekstraktların hazırlanması ve canlı görüntülenmesi için bir yöntem tanımladık.
Geleneksel olarak toplu biyokimyasal tahliller için kullanılan Xenopus laevis yumurta ekstraktları, sitokinezi, mitotik iğ oluşumu ve çekirdeğin montajı gibi sitoplazmik fenomenleri incelemek için güçlü bir görüntüleme tabanlı araç olarak ortaya çıkmıştır. Seyrek zaman noktalarında örneklenen sabit ekstraktları görüntüleyen erken yöntemlere dayanarak, son yaklaşımlar hızlandırılmış mikroskopi kullanarak canlı ekstraktları görüntüleyerek gelişmiş zamansal çözünürlükle daha dinamik özellikler ortaya çıkarır. Bu yöntemler genellikle görüntüleme kabının sofistike yüzey işlemlerini gerektirir. Burada, kimyasal yüzey işlemi gerektirmeyen yumurta ekstraktlarının canlı görüntülenmesi için alternatif bir yöntem sunuyoruz. Uygulanması kolaydır ve görüntüleme için seri üretilen laboratuvar sarf malzemelerini kullanır. Hem geniş alan hem de konfokal mikroskopi için kullanılabilecek bir sistemi tanımlıyoruz. 2 boyutlu (2D) bir alanda ekstraktları görüntülemek için tasarlanmıştır, ancak 3D'de görüntülemeye kolayca genişletilebilir. Sitoplazma içindeki mekansal desen oluşumunu incelemek için çok uygundur. Temsili verilerle, bu yöntem kullanılarak hazırlanan interfaz ekstraktlarında mikrotübüllerin, çekirdeklerin ve mitokondrilerin tipik dinamik organizasyonunu gösteriyoruz. Bu görüntü verileri, sitoplazmik dinamikler ve mekansal organizasyon hakkında nicel bilgiler sağlayabilir.
Sitoplazma, bir hücrenin ana hacmini oluşturur ve ayrı bir organizasyona sahiptir. Ökaryotik sitoplazmanın bileşenleri, mikrotübül asterleri ve Golgi aparatı gibi çok çeşitli mekansal yapılara kendiliğinden toplanabilir ve bunlar da hücrenin kimliğine ve fizyolojik durumuna bağlı olarak dinamik olarak düzenlenir ve döndürülür. Sitoplazmanın mekansal organizasyonunu ve hücresel fonksiyonlara olan bağlantısını anlamak, hücrenin nasıl çalıştığını anlamak için önemlidir. Xenopus laevis yumurta ekstraktları geleneksel olarak toplu biyokimyasal tahliller için kullanılmıştır 1,2,3,4,5,6,7,8, ancak son çalışmalar onları sitoplazmik yapıların mekanik çalışmaları ve hücresel fonksiyonları için güçlü bir canlı görüntüleme sistemi olarak kurmaktadır 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Bu seyreltilmemiş ekstraktlar, sitoplazmanın birçok yapısını ve fonksiyonunu korurken, geleneksel hücre bazlı modellerde elde edilemeyen sitoplazmik içeriğin doğrudan manipülasyonlarına izin verir19,20. Bu, onları sitoplazmik fenomenleri karakterize etmek ve mekanik temellerini incelemek için ideal kılar.
Ekstraktları görüntülemek için mevcut yöntemler, kimyasal yüzey modifikasyonları veya mikroakışkan cihazların üretilmesini gerektirir. Bir coverslip bazlı yöntem, cam kapakların polietilen glikol (PEG) pasivasyonunu gerektirir21. Mikroemülsiyon bazlı bir yöntem, trikloro(1H,1H,2H,2H-perflorooktil)silanın cam yüzeylerde buhar birikimini gerektirir22,23. Mikroakışkan tabanlı sistemler, ekstrakt damlacıklarının hacminin, geometrisinin ve bileşiminin hassas bir şekilde kontrol edilmesini sağlar, ancak özel mikrofabrikasyon tesisleri gerektirir11,12,24.
Burada, yumurta ekstraktlarını görüntülemek için uygulaması kolay ve kolayca temin edilebilen, düşük maliyetli malzemeler kullanan alternatif bir yöntem sunuyoruz. Bu, bir slayt ve florlu etilen propilen (FEP) bant ile kaplanmış bir kapak kapağı ile bir görüntüleme odasının hazırlanmasını içerir. Oda, stereoskoplar ve dik ve ters mikroskoplar dahil olmak üzere çeşitli mikroskopi sistemleriyle ekstraktları görüntülemek için kullanılabilir. Bu yöntem, yukarıda tartışılan mevcut cam bazlı yöntemlerle elde edilen benzer optik netliği elde ederken yüzeylerin kimyasal olarak işlenmesini gerektirmez. Bir 2B alan boyunca eşit kalınlığa sahip bir ekstrakt katmanını görüntülemek için tasarlanmıştır ve 3B ekstrakt hacmini görüntülemek için kolayca genişletilebilir. Geniş bir görüş alanı üzerinde kolektif sitoplazmik davranışın hızlandırılmış görüntülenmesi için çok uygundur.
Görüntüleme yöntemimizi göstermek için interfaz tutuklamalı yumurta ekstraktları kullandık. Ekstrakt preparatı, Deming ve Kornbluth19 protokolünü takip eder. Kısacası, mayoz II'nin metafazında doğal olarak tutuklanan yumurtalar, düşük hızlı bir spin ile ezilir. Bu spin, sitoplazmayı mayotik arrestten serbest bırakır ve ekstraktın interfaza geçmesine izin verir. Normalde, F-aktin oluşumunu inhibe etmek için ezme spininden önce sitokalasin B eklenir. Bununla birlikte, F-aktin isteniyorsa atlanabilir. Sikloheksimid, interfaz ekstraktının bir sonraki mitoza girmesini önlemek için ezme spininden önce de eklenir. Ekstraktlar daha sonra yukarıda belirtilen görüntüleme odalarına yerleştirilir ve mikroskop üzerine yerleştirilir. Son olarak, görüntüler mikroskopa bağlı bir kamera tarafından belirli aralıklarla zaman içinde kaydedilir ve 2D alanda ekstraktın dinamik davranışını yakalayan hızlandırılmış görüntü serileri üretir.
Burada açıklanan tüm yöntemler, Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Slaytların ve kapak fişlerinin hazırlanması
2. İnterfaz tutuklu yumurta ekstraktlarının hazırlanması ve canlı görüntülenmesi
NOT: Aşağıdaki protokol Deming ve Kornbluth19, Murray20 ve Smythe ve Newport25'ten değişikliklerle uyarlanmıştır. Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar oda sıcaklığında yapılmalıdır.
Xenopus laevis yumurta ekstreleri, interfaz sırasında sitoplazmanın kendi kendine organizasyonunu incelemek için kullanılabilir. Şekil 2A, başarılı bir deneyin sonuçlarını göstermektedir. İnterfaz çekirdeklerinin yeniden yapılandırılmasına ve görselleştirilmesine izin vermek için fazlar arası tutuklanmış ekstraktları, fazlar arası çekirdeklerin yeniden yapılandırılmasına ve görselleştirilmesine izin vermek için 27 ?...
Xenopus laevis yumurta ekstreleri, çeşitli hücre altı yapıların 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 ve bir bütün olarak sitoplazmik organizasyonun görüntülenmesine dayalı çalışmalar için güçlü bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır....
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
J. Kamenz, Y. Chen ve W. Y. C. Huang'a el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, James E. Ferrell, Jr.'a verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R01 GM110564, P50 GM107615 ve R35 GM131792) gelen hibelerle desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
22x22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır