JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описан способ получения и живой визуализации неразбавленных цитоплазматических экстрактов из яиц Xenopus laevis .

Аннотация

Традиционно используемые для объемных биохимических анализов, экстракты яиц Xenopus laevis стали мощным инструментом на основе визуализации для изучения цитоплазматических явлений, таких как цитокинез, формирование митотического веретена и сборка ядра. Основываясь на ранних методах, которые изображали фиксированные экстракты, отобранные в редкие временные точки, последние подходы изображают живые экстракты с использованием покадровой микроскопии, выявляя более динамические особенности с улучшенным временным разрешением. Эти методы обычно требуют сложной обработки поверхности сосуда визуализации. Здесь мы представляем альтернативный метод живой визуализации экстрактов яиц, которые не требуют химической обработки поверхности. Он прост в реализации и использует серийные лабораторные расходные материалы для визуализации. Описана система, которая может быть использована как для широкоугольной, так и для конфокальной микроскопии. Он предназначен для визуализации экстрактов в 2-мерном (2D) поле, но может быть легко расширен до визуализации в 3D. Он хорошо подходит для изучения формирования пространственного рисунка в цитоплазме. С репрезентативными данными мы демонстрируем типичную динамическую организацию микротрубочек, ядер и митохондрий в интерфазных экстрактах, приготовленных с использованием этого метода. Эти данные изображения могут предоставить количественную информацию о цитоплазматической динамике и пространственной организации.

Введение

Цитоплазма составляет основной объем клетки и имеет четкую организацию. Ингредиенты эукариотической цитоплазмы могут самособираться в широкий спектр пространственных структур, таких как микротрубочки и аппарат Гольджи, которые, в свою очередь, динамически располагаются и переворачиваются в зависимости от идентичности клетки и физиологического состояния. Таким образом, понимание пространственной организации цитоплазмы и ее связи с клеточными функциями важно для понимания того, как работает клетка. Экстракты яиц Xenopus laevis традиционно использовались для объемных биохимических анализов 1,2,3,4,5,6,7,8, но недавняя работа устанавливает их как мощную живую систему визуализации для механистических исследований цитоплазматических структур и их клеточных функций 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Эти неразбавленные экстракты сохраняют многие структуры и функции цитоплазмы, позволяя при этом прямые манипуляции с цитоплазматическим содержимым, недостижимые в обычных клеточных моделях19,20. Это делает их идеальными для характеристики цитоплазматических явлений и препарирования их механистических основ.

Существующие методы визуализации экстрактов требуют химической модификации поверхности или изготовления микрофлюидных устройств. Один метод на основе чехла требует пассивации полиэтиленгликолем (ПЭГ) стеклянных покровных пластин21. Метод, основанный на микроэмульсии, требует осаждения из пара трихлор(1H,1H,2H,2H-перфтороктил)силана на стеклянных поверхностях22,23. Системы на основе микрофлюидов позволяют точно контролировать объем, геометрию и состав капель экстракта, но требуют специализированных средств микропроизводства 11,12,24.

Здесь мы представляем альтернативный метод визуализации экстрактов яиц, который прост в реализации и использует легкодоступные, недорогие материалы. Это включает в себя подготовку камеры визуализации с затвором и крышкой, покрытой фторированной этиленпропиленовой лентой (FEP). Камера может быть использована для визуализации экстрактов с различными системами микроскопии, включая стереоскопы и вертикальные и инвертированные микроскопы. Этот метод не требует химической обработки поверхностей при достижении аналогичной оптической чистоты, полученной с помощью существующих методов на основе стекла, рассмотренных выше. Он предназначен для изображения слоя экстрактов с равномерной толщиной в 2D-поле и может быть легко расширен для изображения 3D-объема экстрактов. Он хорошо подходит для покадровой визуализации коллективного цитоплазматического поведения в большом поле зрения.

Мы использовали экстракты яиц с межфазным арестом, чтобы продемонстрировать наш метод визуализации. Подготовка экстракта осуществляется в соответствии с протоколом Деминга и Корнблута19. Короче говоря, яйца, естественно остановленные в метафазе мейоза II, измельчаются низкоскоростным вращением. Этот спин освобождает цитоплазму от мейотического ареста и позволяет экстракту переходить в интерфазу. Обычно цитохалазин B добавляют перед дробильным спином для ингибирования образования F-актина. Тем не менее, он может быть опущен, если требуется F-актин. Циклогексимид также добавляют перед дробильным спином, чтобы предотвратить попадание межфазного экстракта в следующий митоз. Экстракты впоследствии помещают в вышеупомянутые камеры визуализации и помещают на микроскоп. Наконец, изображения записываются с течением времени через определенные промежутки времени камерой, подключенной к микроскопу, создавая покадровые серии изображений, которые фиксируют динамическое поведение экстракта в 2D-поле.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Стэнфордского университета.

1. Подготовка слайдов и обложек

  1. Нанесите слой фторированной этиленпропиленовой (FEP) клейкой ленты на стеклянную горку с помощью роликового аппликатора. Отрежьте лишнюю ленту по краям чистым лезвием бритвы. Таким же образом подготовьте чехлы с покрытием из ленты FEP (рисунок 1А).
  2. Нанесите двустороннюю липкую прокладку для изображения на сторону слайда, покрытую лентой FEP. Оставьте защитный вкладыш сверху неочищенным (рисунок 1А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды и крышки должны быть подготовлены перед экспериментом. Их можно использовать немедленно или хранить в ящиках для предотвращения накопления пыли на поверхностях. Скважина в распорке для визуализации имеет глубину 120 мкм и диаметр 9 мм.

2. Подготовка и живая визуализация межфазно-остановленных экстрактов яиц

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол адаптирован из Деминга и Корнблута19, Мюррея20 и Смайта и Ньюпорта25 с изменениями. Все этапы должны выполняться при комнатной температуре, если не указано иное.

  1. За три-десять дней до забора яйцеклеток вводят зрелую самку лягушек Xenopus laevis подкожно в дорсальный лимфатический мешок со 100 МЕ беременной кобыльей сывороточного гонадотропина (ПМСГ).
  2. За шестнадцать-восемнадцать часов до запланированного сбора яиц вводят лягушкам с шага 2.1 500 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). Оставьте лягушек при 18 °C в буфере для яйцекладки (100 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ MgSO4·7H2O, 2,5 мМ CaCl2·2H2O, 0,5 мМ HEPES, 0,1 мМ ЭДТА, готовят в виде 20-кратного запасного раствора при рН 7,4 и разбавляют чистой лягушачьей водой до 1 раза перед использованием) до сбора яиц.
  3. В день эксперимента соберите яйца в большую стеклянную чашку Петри и оцените качество яиц. Отбросьте яйца, которые выглядят как белые пухлые шарики или появляются в цепочке (рисунок 1B). Изучите яйца под стереоскопом, сохраните яйца с нормальным внешним видом (рисунок 1C) и выбросьте яйца с неправильным или пятнистым пигментом (рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол работает с яйцами, собранными из одной лягушки, которая обычно откладывает 25 мл яиц через 16 часов после инъекции ХГЧ. Обычно ХГЧ индуцирует в общей сложности от 3 до 6 лягушек, и для эксперимента по приготовлению экстракта выбирается лягушка с самым высоким качеством яйца.
  4. Перенесите яйца в стеклянный стакан объемом 400 мл и удалите как можно больше буфера для яйцекладки путем декантирования.
  5. Инкубировать яйца в 100 мл свежеприготовленного раствора для обезжелезивания (2% мас./об. L-цистеина в воде, довести до рН 8,0 с NaOH) и осторожно периодически закручивать их. Примерно через 3 минуты раствор высыпать, и добавить 100 мл свежего раствора для обезжелезивания. Продолжайте инкубацию до тех пор, пока яйца не будут плотно упакованы (между яйцами нет места), но не оставляйте яйца в растворе для обезжелезивания более 5 минут.
  6. Удалите как можно больше раствора для обезжелезивания путем декантирования и промыть яйца в буфере MMR 0,25x (25 мМ NaCl, 0,5 мМ KCl, 0,25 мМ MgCl2, 0,5 мМ CaCl2, 0,025 мМ ЭДТА, 1,25 мМ HEPES, приготовленный в виде 10-кратного запасного раствора, скорректированный до рН 7,8 с NaOH и разбавленный в воде Milli-Q перед использованием) путем добавления буфера, закручивая яйца, а затем выливая из буфера. Повторите несколько раз, пока для стирки не будет использовано в общей сложности 1 л буфера.
  7. Вымойте яйца несколько раз, имея в общей сложности 400 мл буфера лизиса яиц (250 мМ сахарозы, 10 мМ HEPES, 50 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, сделанный свежим и скорректированный до рН 7,7 с KOH). Удалите яйца с ненормальным внешним видом с помощью пипетки Пастера между стирками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца с аномальным внешним видом относятся к тем, которые выглядят как белые пухлые шарики (рисунок 1B), имеют пятнистую пигментацию (рисунок 1D), ухудшаются с растущей белой областью (рисунок 1E) или показывают затемненную и сокращенную пигментированную область в полушарии животного (рисунок 1F).
  8. Используя передаточную пипетку с широко открытым наконечником, перенесите яйца в центрифужную трубку круглого дна объемом 17 мл, содержащую 1 мл буфера лизиса яиц. Вращайте трубку в клинической центрифуге при 400 х г в течение 15 секунд, чтобы упаковать яйца.
  9. Удалите как можно больше буфера лизиса яиц с верхней части упакованных яиц с помощью пипетки Пастера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить как можно больше буфера из упакованных яиц, чтобы свести к минимуму разбавление экстракта яйца. Иногда для этого необходимо удалить некоторые рыхлые яйца вместе с остаточным буфером.
  10. Определяют приблизительный объем упакованных яиц, а затем добавляют 5 мкг/мл апротинина, 5 мкг/мл лейпептина, 5 мкг/мл цитохалазина В и 50 мкг/мл циклогексимида непосредственно поверх упакованных яиц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Апротинин и лейпептин являются ингибиторами протеазы. Цитохалазин B ингибирует полимеризацию актина, предотвращая сокращение и желирование экстракта26. Циклогексимид ингибирует синтез белка, тем самым удерживая экстракт в интерфазе клеточного цикла.
  11. Раздавите яйца центрифугированием трубки при 12 000 х г, 4 °C, в течение 15 минут, в качающемся роторе ведра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конце центрифугирования яйца должны были разорваться, и лизат разделился на три основных слоя: желтый липидный слой сверху, цитоплазматический экстракт (также называемый сырым экстрактом) в середине и темный плотный слой, содержащий гранулы пигмента внизу (рисунок 1G).
  12. Прикрепите иглу 18-го калибра к шприцу. Кончиком иглы, обращенным вверх, проколите трубку со стороны на дне цитоплазматического слоя и восстановите экстракт, медленно рисуя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рисуйте цитоплазматический экстракт медленно, чтобы избежать включения загрязняющего содержимого из желтого липидного слоя.
  13. Перенесите восстановленный цитоплазматический экстракт в новую микроцентрифужную трубку и подержите его на льду. Используйте экстракт в течение 1 часа.
  14. Когда вы будете готовы к изображению, дополните экстракт желаемыми реагентами и флуоресцентными зондами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные зонды для визуализации маркируют конкретные цитоплазматические структуры, чтобы их можно было визуализировать с помощью флуоресцентного микроскопа.
  15. Снимите верхнюю защитную прокладку с распорки для визуализации на слайде, подготовленном на этапе 1.2, и нанесите приблизительно 7 мкл экстракта в центр скважины. Немедленно нанесите покрытую лентой FEP крышку со стороной FEP, обращенную к экстракту, чтобы герметизировать скважину. Быстро переходите к визуализации (рисунок 1H,I).
  16. Установите затвор на перевернутый или вертикальный микроскоп с моторизованной сценой и цифровой камерой. Визуализируйте извлечения в требуемых пространственных положениях и временных интервалах как в каналах яркого поля, так и во флуоресцентных каналах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, для визуализации используется объектив 5x. Моторизованная ступень позволяет автоматически получать изображения в нескольких определенных пространственных положениях. Ярко-полевая микроскопия визуализирует цитоплазматические структуры с разной степенью прозрачности. Флуоресцентная микроскопия визуализирует цитоплазматические структуры, специально помеченные флуоресцентными зондами, добавленными на этапе 2.14. Камера записывает покадровые снимки этих структур, тем самым захватывая динамику цитоплазматической организации.

Результаты

Экстракты яиц Xenopus laevis можно использовать для изучения самоорганизации цитоплазмы во время интерфазы. На рисунке 2А показаны результаты успешного эксперимента. Мы дополнили интерфазно-арестованные экстракты демембранированными ядрами спермато?...

Обсуждение

Экстракты яиц Xenopus laevis стали мощной модельной системой для визуализационных исследований различных субклеточных структур 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 и цитоплазматической организации в целом

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим J. Kamenz, Y. Chen и W. Y. C. Huang за комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (R01 GM110564, P50 GM107615 и R35 GM131792), присужденными Джеймсу Э. Ферреллу-младшему.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
17 ml centrifuge tubeBeckman Coulter337986
22x22 mm square #1 cover glassCorning284522
AprotininMilliporeSigma10236624001Protease inhibitor
CycloheximideMilliporeSigma01810Protein synthesis inhibitor
Cytochalasin BMilliporeSigmaC6762Actin polymerization inhibitor
Female Xenopus laevis frogsNascoLM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin proteinCytoskeleton, Inc.TL488M-AFor visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin proteinCytoskeleton, Inc.TL670M-AFor visualizing the microtubule cytoskeleton
Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tapeCS Hyde company23-FEP-2-5
Glass Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-20C
Human chorionic gonadotropin (hCG)MilliporeSigmaCG10
Imaging spacerElectron Microscopy Sciences70327-8S
LeupeptinMilliporeSigma11017101001Protease inhibitor
Microscope slidesFisher Scientific12-518-100B
Mineral oilMilliporeSigma330760
MitoTracker Red CMXRosThermo Fisher ScientificM7512For visualizing mitochondria
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)BioVendorRP1782725000
Roller applicatorAmazonB07HMBJSP8For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips
Single-edged razor bladesFisher Scientific12-640For removing excessive FEP tape
Transfer pipetteFisher Scientific13-711-7M

Ссылки

  1. Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
  2. Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
  3. Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
  4. Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
  5. Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
  6. Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
  7. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
  8. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
  9. Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
  10. Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
  11. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
  12. Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
  13. Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
  14. Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
  15. Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
  16. Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
  17. Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
  18. Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
  19. Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
  20. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
  21. Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  22. Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
  23. Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
  24. Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
  25. Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
  26. Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, 2086-2095 (2011).
  27. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
  28. Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
  29. Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
  30. Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
  31. Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
  32. Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
  33. Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
  34. Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
  35. Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
  36. Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
  37. Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
  38. Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  39. Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

172Xenopus laevis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены